小球藻細胞壁缺陷型突變體的篩選及轉化系統的建立

王亞麗徐澤東蔣思婧黃開耀

（1. 中國科學院水生生物研究所， 中國科學院藻類生物學重點實驗室， 武漢 430072； 2. 中國科學院大學， 北京 100049； 3. 湖北大學生命科學學院， 武漢 430062）

小球藻細胞壁缺陷型突變體的篩選及轉化系統的建立

王亞麗1，2徐澤東3蔣思婧3黃開耀1

（1. 中國科學院水生生物研究所， 中國科學院藻類生物學重點實驗室， 武漢 430072； 2. 中國科學院大學， 北京 100049； 3. 湖北大學生命科學學院， 武漢 430062）

由于高效、穩定遺傳轉化系統的缺乏， 小球藻遺傳改良以及油脂代謝機理的研究等工作難以進行。研究旨在通過篩選獲得小球藻Chlorella vulgaris細胞壁缺陷型突變體， 在此基礎上建立其轉化系統。首先通過紫外誘變獲得小球藻Chlorella vulgaris的突變體庫， 基于細胞壁缺陷型突變體在1% Triton X-100處理后葉綠素會釋放到上清中的原理， 利用酶標儀高通量地從約4000個突變體中篩選獲得10株細胞壁缺陷的小球藻。同時以小球藻內源性β-tubulin的啟動子和終止子作為啟動子和終止子， 以AphⅧ （Aminoglycoside 3′-Phosphotransferase type Ⅷ）作為報告基因構建了轉化載體pHK203。通過優化電轉緩沖液組分和電擊參數， 確定了細胞壁缺陷型突變體CWD-3的最佳轉化條件， 即2 μg pHK203， ddH2O作為電轉緩沖液， 1500 V， 525 Ω， 50 μF的電擊條件下， 轉化效率可達到40個轉化子/μg DNA。研究為小球藻Chlorella vulgaris的油脂代謝通路和遺傳改良提供了技術基礎， 同時由于可降低破壁成本， 篩選獲得的細胞壁缺陷型突變體適于工業化生產小球藻藻粉。

小球藻； 轉化； 細胞壁缺陷； 生物柴油

小球藻Chlorella指一類單細胞無鞭毛真核綠藻［1］， 長久以來被用作研究光合作用機制和二氧化碳同化機制的模式生物［2］， 并且是食品添加劑和營養保健品的優質來源， 在全球多個公司實現了商業化生產［3，4］。近年來， 微藻生物柴油被認為是一種很有潛力的替代能源［5］。篩選高產油小球藻［6］和優化小球藻產油條件［7，8］的研究不斷涌現， 推動小球藻作為生產生物柴油的生物反應器。但是， 穩定、高效的轉化方法的缺乏， 嚴重制約了對小球藻油脂代謝機理的研究和其遺傳改良。

構建小球藻轉化系統的努力一直沒有停止。小球藻堅實的細胞壁是轉化成功的重要障礙。一種方法是通過酶解法弱化細胞壁或者制備原生質體來促進轉化成功， Jarvis等［9］通過原生質體法在Chlorella ellipsoidea中首次實現了外源基因螢火蟲熒光蛋白的瞬時表達。Maruyama等［10］通過電轉化原生質體的方式實現了GUS （β-葡萄糖醛酸酶）基因在Chlorella saccharophila中的瞬時表達。而后Liu等［11］報道了通過原生質體法實現了GUS基因在Chlorella ellipsoidea中的穩定表達。在細胞壁完整的小球藻中利用電轉化的方法轉入外源基因也有陸續報道， 如Chow等［12］和Wang等［13］先后在Chlorella vulgaris和Chlorella sp.中實現了GUS （β-葡萄糖醛酸酶）的瞬時表達， 而Chen等［14］和Bai等［15］報道了在Chlorella ellipsoidea中NP-1（兔噬中性肽-1）基因的穩定表達， 但是其采用的電轉化電壓高達6—9 kV， 而這可能會提高藻細胞的死亡率。其他轉化方法， 如基因槍法成功將硝酸還原酶基因轉化入Chlorella saccharophila硝酸還原酶缺陷型突變體中， 實現了其回復突變［16］， 但是這種方法需要昂貴且復雜的設備， 并且不易掌握。

通過酶解法弱化細胞壁存來促進轉化的方法存在轉化效率不穩定的缺陷， 因而未見后續報道。另外， 上述研究都采用外源性的CaMV35S （Cauli-flower Mosaic Virus 35S）啟動子［10，12—14］或Ubi-Ω（Ubiquitin-Ω）啟動子［11，14，15］來控制轉基因的表達，然而有研究表明， 內源性啟動子驅動基因表達的效率要高于外源性啟動子［17］。β-tubulin是一種保守的微管蛋白， 其啟動子的高驅動效率在Marssonina brunnea［18］、Physcomitrella patens［19］、Volvox［20］中都被證實。本研究針對以上兩點， 希望篩選獲得小球藻細胞壁缺陷型突變體， 同時利用小球藻內源性β-tubulin的啟動子來構建轉化載體， 在球藻Chlorella vulgaris中建立高效、穩定的轉化系統。

1 材料與方法

1.1 藻株和培養條件

小球藻Chlorella vulgaris UTEX 265來自美國德克薩斯州立大學藻種庫， 在本研究中作為野生型藻株。培養基是在Bristol solution［21］的基礎上添加1%的Tryptone （Oxoid， 英國）， 稱為Bristol-T培養基，配方見表 1。固體培養基在液體Bristol-T基礎上添加1.5%瓊脂粉（Bio-sharp， 日本）。篩選培養基在固體培養基的基礎上添加10 μg/mL巴龍霉素（Sigma，USA）。培養條件為22℃， 50 μE/（m2·s）連續光照，120 r/min震蕩培養。

1.2 生長曲線繪制

以不同時間點的細胞濃度數據來繪制生長曲線。設置初始接種濃度為5×105個/mL。每天定時取藻液， 使用血細胞計數板進行計數。做三次生物學重復。

1.3 紫外誘變獲得突變體庫

取對數生長期的藻液， 將其濃度調整為4×106個/ mL， 終體積為4 mL， 使用自制紫外誘變儀（兩支15 W紫外燈管， 輻射距離9 cm）， 在不同的輻射時長下進行紫外誘變， 輻射時長設定為0、60s、75s、90s、105s和120s， 輻射完畢后， 將培養皿中的藻液混勻，各取100 μL涂布于Bristol-T固體平板上。在單克隆長出之后， 計數各個輻射時長的平板上長出的單克隆數目。以0時的存活率為100%， 將60s、75s、90s、105s和120s這5個輻射時長下的平板上的單克隆數目除以0的平板上的單克隆數目， 計算得到各個輻射時長下的致死率。進行3次生物學重復。根據致死率繪制紫外誘變致死曲線。找到致死率為90%—95%的最佳輻射時間。按照最佳輻射時間進行紫外誘變獲得突變體庫。

表 1 Bristol-T培養基配方Tab. 1 Composition of Bristol-T medium

1.4 細胞壁缺陷型突變體篩選

將紫外誘變后獲得的突變體接種于96孔細胞培養板（NEST， 中國）中， 置于光下120 r/min震蕩培養2d。用排槍將藻液充分混勻， 取50 μL加入到96孔黑色酶標板（Greiner Bio-One， 德國）中， 在多功能酶標儀（Molecular Devices， 美國）中設置激發光為430 nm， 發射光為670 nm， 測定藻液的熒光值， 記作A1。向藻液中加入等體積的1%TritonX-100， 于室溫反應1h。3000×g， 5min離心后， 小心吸取50 μL上清至新的96孔黑色酶標板中， 在同樣設置下測熒光值， 記作A2。計算A2/A1。根據突變體與野生型A2/A1的值的大小來篩選細胞壁缺陷型突變體。

1.5 巴龍霉素耐受性測定

取對數生長期的藻液， 將其濃度調整為5×106個/mL或者2×106個/mL， 吹打混勻后， 分別吸取10 μL垂直滴在含有不同濃度巴龍霉素的Bristol-T固體平板上。待其吹干后， 將平板置于藻房暗光處放置2h， 然后取出置于光下培養。7d后觀察平板上藻斑的生長情況。

1.6 載體構建

pHK203是在本實驗室載體pKS-AphⅧ-Lox的基礎上將它的啟動子和終止子分別換成小球藻Chlorella vulgaris的β-tubulin的啟動子和終止子構建而來。β-tubulin的啟動子和終止子都是通過PCR擴增獲得， 引物分別為β-tubulin-pF、β-tubulinpR和β-tubulin-uF、β-tubulin-uR， 引物序列見表 2。將載體用XhoⅠ和SacⅠ酶切， 借助片段與載體的同源序列， 通過雙片段無酶克隆的方式［22］將啟動子片段連接到載體上； 再將重組載體用BamHⅠ和KpnⅠ酶切， 通過雙片段無酶克隆的方式將終止子片段連接到重組載體上。

1.7 電轉化方法

3000×g， 5min離心收集3×107個對數生長期的細胞。將細胞用新鮮Bristol-T培養基洗滌一次后，用電轉緩沖液重懸， 加入2 μg pHK203， 混勻， 于冰上前處理15min。將細胞懸液轉移至電極杯中， 在電轉儀（BTX， ECM 630， 美國）中進行電擊， 電擊后置于冰上后處理15min。吸出細胞懸液， 轉移到裝有20 mL含有60 mmol/L山梨醇（Biosharp， 日本）的Bristol-T培養基的50 mL離心管中， 恢復過夜。3000×g， 5min離心收集細胞， 用500 μL新鮮的Bristol-T重懸后， 涂布到含有10 μg/mL巴龍霉素的Bristol-T平板上。暗光放置2h后， 取出置于光下培養。

表 2 本研究中所用的引物Tab. 2 Primers used in the current study

1.8 PCR驗證重組子

將電轉化后長出來的單克隆劃線于Bristol-T固體培養基上， 3d后挑取適量藻落于24孔板中， 置于光下培養2d， 用于提取基因組?；蚪M提取方法參照［16］， 優化部分包括將CTAB緩沖液用量減少到200 μL，以及加入玻璃珠（Sigma， USA）利于細胞裂解。

PCR擴增AphⅧ片段以驗證重組子。所用的正向和反向引物分別是AphⅧ-F和AphⅧ-R （表 2）。PCR程序為: 1， 94℃， 5min； 2， 94℃， 30s； 3， 62℃，45s； 4， 72℃， 1min； 5， 72℃， 10min， 步驟2—4重復30次。

2 結果

2.1 生長曲線

微藻的生長狀態和生長時期對遺傳轉化成功存在影響［23］， 為了確定Chlorella vulgaris UTEX 265的生長特性， 確定其生長的對數期和穩定期， 本研究首先測定了其生長曲線。從測定獲得的生長曲線中看出， 在開始培養之后， Chlorella vulgaris迅速進入對數生長期， 在培養7d之后細胞增殖速度開始下降。所以本實驗選擇以培養4—6d的藻細胞來進行紫外誘變和電轉化。

2.2 對巴龍霉素敏感性的測定

AphⅧ 編碼Ⅷ型氨基糖苷類3′-磷酸轉移酶， 使藻株對氨基糖苷類抗生素如巴龍霉素等具有抗性，是一個高效的重組子報告基因［24，25］。本研究采用AphⅧ 作為報告基因， 首先需要確定小球藻Chlorella vulgaris UTEX 265對巴龍霉素的耐受性。如圖 1所示， 在藻斑形成實驗中， 在沒有巴龍霉素篩選壓力時， 10 μL 5×106個/mL （C1）或者2.5×106個/mL（C2）的藻液在7d后即形成深綠色的邊緣稍凸起的藻斑。而當施加巴龍霉素篩選壓力之后， 從巴龍霉素濃度為2.5 μg/mL起C1和C2組即開始不能形成藻斑， 但C1組在藻斑邊緣處有綠色痕跡， 推測是由于邊緣處細胞的堆積造成， 濃度較低的C2組從5 μg/mL起即完全沒有藻落長出。以上實驗表明，巴龍霉素對于小球藻Chlorella vulgaris 是一種有效的篩選壓力， 同時， 細胞的堆疊會造成上層細胞的“幸存”。本研究為了確保篩選的陽性率， 選擇10 μg/mL巴龍霉素作為篩選壓力。

2.3 細胞壁缺陷突變體的篩選

圖 1 小球藻Chlorella vulgaris對巴龍霉素的耐受性測定Fig. 1 Sensitivity of Chlorella vulgaris to paromomycin

普通小球藻具有堅硬的細胞壁， 主要由堅硬的多聚糖組成［1］， 是電轉化成功的一個重要阻礙因素［26］。因此我們希望獲得小球藻無細胞壁突變體，在其中進行電轉化系統的探索。首先通過紫外誘變獲得突變體庫， 利用自制紫外誘變儀對小球藻Chlorella vulgaris UTEX 265進行紫外誘變， 在距離紫外光源垂直距離為9 cm， 細胞濃度為4×106個/ mL時， 測定紫外誘變致死曲線。紫外誘變的致死率在輻射時長為60—90s劇烈升高， 在輻射時長為90s時達到90%的致死率， 而后隨著輻射時長的延長， 致死率趨于100%。我們選擇90s作為制備突變體庫時的輻射時長。通過紫外誘變獲得了近4000株突變體。

Triton X-100是一種離子型去垢劑， 細胞壁薄弱的藻細胞經過1% Triton X-100處理后會發生裂解， 釋放出葉綠素［27］， 此時離心后測得的上清液的熒光值（A2）與處理前細胞懸液的熒光值（A1）應該相當?；谶@個原理， 我們制定了小球藻無細胞壁突變體的篩選流程（圖 2）， 根據A2/A1的值來篩選細胞壁缺陷型突變體。

從近4000株突變體中， 篩選獲得10株A2/A1值顯著高于野生型的突變體， 分別命名為CWD-1至CWD-10。如圖 3所示， 野生型的A2/A1值在0.08左右， 而10株突變體的A2/A1值在1左右， 證明細胞壁相對于野生型發生了弱化， 經過1% Triton X-100處理后發生了裂解釋放出了葉綠素。

在10個細胞壁缺陷型突變體中， CWD-3的A2/A1值最高， 顯示其細胞壁缺陷程度可能最高。為了排除其細胞壁缺陷的同時發生生長障礙， 因此本研究對其生長速度進行了測定。如圖 4所示，CWD-3的生長趨勢與野生型類似， 同時生長速度相較于野生型反而有所提高。所以CWD-3不存在生長問題， 方便用于后續轉化系統的建立， 同時表明其可能具有工業化生產藻粉， 減少破壁等成本的潛力。

圖 2 Chlorella vulgaris無細胞壁突變體的篩選流程Fig. 2 The screening procedure for cell wall-less mutants in Chlorella vulgaris

圖 3 小球藻Chlorella vulgaris細胞壁缺陷型突變體Fig. 3 Cell wall-defective mutants of Chlorella vulgaris

圖 4 小球藻Chlorella vulgaris細胞壁缺陷型突變體CWD-3生長速度與野生型對比Fig. 4 The growth curve of cell wall-defective mutant CWD-3 and WT

2.4 電轉化系統的建立

轉化載體pHK203的示意圖和酶切驗證圖（圖5）。pHK203總長度為6941 bp， β-tubulin啟動子長度為2077 bp， 3′-UTR長度為1083 bp， AphⅧ長度為885 bp， 在β-tubulin啟動子距離5′端777 bp處存在一個SacⅠ酶切位點。酶切驗證的結果符合預期。這說明我們成功構建了轉化載體。

為了研究脈沖時間和電轉緩沖液的成分的關系， 獲得合適的脈沖時間， 我們設計了不同的電轉緩沖液（表 3）， 按照電轉化方法， 在電轉儀參數設定為1500 V， 525 Ω， 50 μF條件下， 測定其脈沖時間。

從圖 6可以看出， 緩沖液的組分對于脈沖時間有很大影響。由Buffer 1到Buffer 4， 在其他成分保持一致的情況下， 隨著電轉緩沖液中NaCl濃度降低， 脈沖時間逐漸延長。脈沖時間在電轉緩沖液中沒有離子成分， 僅存在ddH2O或者山梨醇和HEPES等非離子物質時， 穩定在22ms左右。

圖 5 pHK203示意圖和酶切驗證圖譜Fig. 5 Diagram of pHK203 and confirmation of restriction enzyme digestion

表 3 本研究所用的電轉緩沖液的組分Tab. 3 Component of electroporation buffer used in this study

在本研究中， 主要嘗試從電擊參數和電轉緩沖液組分兩各部分來優化電轉化系統， 提高轉化效率。從表 4中可以看出， 同樣以Buffer 1 （Bristol，60 mmol/L 山梨醇， 375 mmol/L NaCl）作為電轉緩沖液時， 提高電轉儀的電阻和電容設置， 電轉效率有了較大提高。值得注意的是， 當提高電阻和電容時， 脈沖時間也提高了， 由430 μs左右提高到了620 μs左右， 同時， 在電擊過程中出現了電火花， 引起了爆杯。而當以Buffer 5 （ddH2O）作為電轉緩沖液， 當提高電轉儀的電阻時， 脈沖時間由22 ms左右提高到了29 ms左右， 但是轉化效率反而有所下降。當以Buffer 7 （100 mmol/L山梨醇， 10 mmol/L HEPES）作為電轉緩沖液時， 轉化效率與以Buffer 5 （ddH2O）作為電轉緩沖液時的轉化效率基本一致。

在1500 V， 525 Ω， 50 μF條件下， 以500 μL ddH2O作為電轉緩沖液， 以pHK203為轉化載體電轉化CWD-3， 在涂布巴龍霉素平板后約7—10d， 單克隆逐漸長出。理論上這些克隆具有巴龍霉素抗性， 應該成功轉入了載體DNA。為了進一步確認， 我們從平板上挑取1/3區域范圍內的單克隆， 抽提總DNA，然后用PCR擴增AphⅧ片段， 并將擴增出來的DNA回收純化， 測序， 與AphⅧ序列進行比對。如圖 7c所示， 待檢測的13株藻有6株擴增得到833 bp的AphⅧ片段， 并且經過測序證實其序列正確。以上結果表明， 本研究成功建立了小球藻電轉化系統， 將外源DNA轉入到了小球藻細胞中。

3 討論

圖 6 脈沖時間與電轉緩沖液組分的關系Fig. 6 The relationship between pulse duration and components of electroporation buffer

表 4 轉化效率與電轉化條件的關系Tab. 4 The relationship between transformation efficiency and electroporation conditions

轉化系統的建立對于現代微藻生物技術的發展非常重要。由于穩定轉化系統的缺乏， 小球藻的淀粉和油脂等代謝通路的研究， 以及通過基因工程的手段獲得優良高產油藻株的研究等， 都進展緩慢。本研究率先嘗試篩選小球藻細胞壁缺陷型突變體用于轉化系統的建立。建立了細胞壁缺陷型突變體的篩選方法。通過酶標儀檢測1% Triton X-100處理前藻液和處理后上清的熒光值的方法， 由于排槍、96孔板和酶標儀的使用， 相比于前人用體式顯微鏡觀察克隆形態［27］， 實現了高通量的細胞壁缺陷型突變體的篩選。從約4000株突變體中獲得10株處理前后熒光值比顯著高于野生型的突變體，雖然這10株突變體的克隆形態與野生型沒有顯著差異， 同時， 與相同數量的萊茵衣藻無細胞壁突變體CW 15在1% Triton X-100處理前后熒光值比（9.5±0.5）相比， 這10株突變體的A2/A1值較小。綜合以上結果， 表明我們獲得了10株細胞壁存在缺陷的小球藻突變體， 同時， 這種缺陷沒有衣藻無細胞壁突變體明顯， 但這10株細胞壁缺陷突變體可以減輕電轉化時的阻礙， 由于生長速率沒有降低， 應用于商業化生產時， 通過降低破壁成本， 可以降低總體生產成本。

圖 7 PCR驗證陽性轉化子Fig. 7 Confirmation of positive transformants via PCR

本研究率先以小球藻內源性β-tubulin啟動子和終止子構建轉化載體， 率先在小球藻中使用巴龍霉素作為篩選抗生素， 并且用藻斑實驗證實了小球藻對于巴龍霉素的敏感性， 確定了10 μg/mL的篩選濃度。本研究通過對不同電擊緩沖液組分的摸索，發現在相同的電擊參數， 電轉緩沖液中的離子濃度越高， 則脈沖時間會越短。以ddH2O或者山梨醇、HEPES作為電轉緩沖液時， 脈沖時間最高， 達到22ms左右， 而這個脈沖時間被證明足夠外源DNA進入到小球藻Chlorella vulgaris中， 實現成功轉化。Brown等［28］研究發現， 需要26 ms的脈沖時間使外源DNA成功進入萊茵衣藻無細胞壁突變體， 而需要兩個26 ms的脈沖時間使外源DNA成功進入細胞壁正常萊茵衣藻。使用非離子型電轉緩沖液時，通過提高電阻來提高脈沖時間， 有助于轉化效率的提高， 但是， 在電轉緩沖液離子強度較大條件下， 提高脈沖時間反而會造成轉化效率的下降， 有可能是因為提高了電轉化過程中細胞的死亡率［29］。出于操作安全、簡便和節約成本的目的， 則可以選擇以ddH2O作為電轉緩沖液。通過對不同電轉化條件的比較， 證明在以ddH2O作為電轉緩沖液， 在1500 V， 525 Ω， 50 μF電擊條件下， 5 μg/mL環狀載體DNA即可以達到相對較高的轉化效率。相對于前人的報道［9—11，13，14，16］， 無需經過酶解等步驟弱化細胞壁， 無需使用極高的電壓， 并且電轉緩沖液成分單一， 簡便易行， 節約成本。

Shimogawarra等［30］研究發現， 在電轉化體系中添加鮭精子DNA作為運載DNA可以提高萊茵衣藻的電轉化效率， 但Yamano等［31］證實不加鮭精子DNA能達到同樣的轉化效率。王等［23］發現載體線性化可以提高GUS活性。Shimogawara等［30］證實電擊恢復后涂布平板時， 以玉米淀粉、海藻酸鈉、礦物油等包埋藻細胞， 為細胞提供一個保濕的環境，可以提高轉化子的存活率。我們猜測可以通過添加鮭精子DNA作為運載DNA， 線性化載體， 在涂平板時添加包埋材料等方式可以繼續提高小球藻Chlorella vulgaris的轉化效率。另外， 我們考慮在轉化載體pHK203的AphⅧ片段后加上GFP等標記，以方便采用western blot的方式對轉化子進行進一步確認。

綜上所述， 本研究通過酶標儀測定1% Triton X-100處理前藻液和處理后上清熒光值的方法， 高通量地篩選獲得了10株細胞壁缺陷的小球藻突變體。以其中的CWD-3藻株， 通過對電轉緩沖液組分和電擊參數的摸索， 以2 μg pHK203， 以ddH2O為電轉緩沖液， 在1500 V， 525 Ω， 50 μF電擊條件下， 可以得到40個轉化子/μg DNA。該轉化系統操作簡便、快速。該系統的建立， 為研究小球藻Chlorella

vulgaris的油脂代謝通路， 遺傳改良等提供了遺傳操作手段。

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SCREENING OF CELL WALL-DEFECTIVE MUTANTS AND CONSTRUCTION OF TRANSFORMATION SYSTEM IN CHLORELLA VULGARIS

WANG Ya-Li1，2， XU Ze-Dong3， JIANG Si-Jing3and HUANG Kai-Yao1
（1. Key Laboratory of Algal Biology， Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430072， China； 2. University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China； 3. Hubei University， Wuhan 430062， China）

Chlorella vulgaris has been widely recognized as a safe food ingredient due to its richness in proteins， vitamins， minerals and short chain poly-unsaturated fatty acid. Recently， Chlorella vulgaris was chosen as one of the feedstock for biodiesel because of its high growth rate and high lipid content， but lacking of stable and efficient transformation system has seriously hindered the understanding of lipid metabolism and the development of the genetic engineering. Our aim was to obtain cell wall-defective mutants of Chlorella vulgaris and use them to construct an electro-transformation system. Based on the release ability of chlorophyll after treatment of 1% Triton X-100， we set up a high throughput screening method of cell wall-defective mutants and obtained 10 cell wall-defective mutants. In addition， we constructed a transformation vector pHK203 by using endogenous promoter and 3′-UTR of β-tubulin gene and by using AphⅧ as selective marker. We successfully obtained 40 transformants per μg DNA using plasmid pHK203 and ddH2O as electroporation buffer with the best electroporation condition of 1500 V， 525 Ω， 50 μF. Our study will benefit the study of lipid metabolism pathway and genetic engineering of Chlorella vulgaris.

Chlorella vulgaris； Transformation； Cell wall-defective； Biodiesel

10.7541/2016.49

Q813.5

A

1000-3207（2016）02-0370-08

2015-04-27；

2015-09-14

國家開發投資公司資助項目 ［Supported by State Development & Investment Corporation （SDIC）］

王亞麗（1990—）， 女， 湖北襄陽人； 碩士； 主要從事微藻生物技術研究。E-mail: wangyali199011@163.com

黃開耀， E-mail: huangky@ihb.ac.cn； 蔣思婧， E-mail: jiangsijing@hubu.edu.cn