cRGD環肽修飾的脂質體靶向肺癌細胞A549的體外研究

張志強，馬海英，李運霞，楊艷榮，趙欣

cRGD環肽修飾的脂質體靶向肺癌細胞A549的體外研究

張志強，馬海英，李運霞，楊艷榮，趙欣

目的構建一種整合素cRGD環肽修飾的脂質體（cRGD-LP）并用于靶向A549細胞的研究。方法采用薄膜分散法制備cRGD-LP，測定其粒徑和電位，用流式細胞儀考察A549細胞對其的攝取，激光共聚焦顯微鏡考察cRGD-LP的腫瘤球穿透能力。結果構建的cRGD-LP粒徑為（112.3±7.8）nm，粒徑分散系數（PDI）為0.023±0.045，電位為（2.38±0.87）mV，且24 h內有良好的血清穩定性，粒徑保持在115 nm左右。A549細胞對cRGD-LP的攝取是PEG修飾脂質體（PEG-LP）的1.7倍，且cRGD-LP對A549腫瘤球的穿透能力比PEG-LP高，能穿透至腫瘤球的深部。結論構建的cRGD-LP具有良好的靶向A549細胞的能力，是一種潛在的新型給藥系統。

肺癌；整合素；cRGD；脂質體

肺癌在中國的發病率和致死率近年來呈急劇上升的趨勢［1-2］。目前，針對肺癌主要包括化療和手術治療兩種方式。由于化療藥物的副作用和缺乏組織選擇性，使得肺癌的化療效果大大折扣。因此，如何克服化療藥物的這兩種局限性成為研究的重點。

在眾多給藥系統中，由于脂質體既可以包載脂溶性藥物，又可以包載水溶性藥物，并具有高穩定性，使得其在腫瘤治療中倍受青睞［3］。將藥物包裹在脂質體中可以大大減少藥物的毒性，如將紫杉醇包裹在脂質體中，可以大大減小其心臟毒性，從而減輕化療帶來的副作用［4］。聚乙二醇（PEG）修飾的脂質體可以通過腫瘤增強滲透滯留效應（EPR）靶向到達腫瘤部位。與沒有PEG修飾的脂質體相比，PEG修飾的脂質體可以使更多化療藥物蓄積在腫瘤部位，從而增加其療效［4-5］。但是，這種脂質體由于缺乏組織選擇性，其治療效果仍遠遠達不到期望的效果。針對這一現象，構建一種可以主動靶向于肺部的脂質體給藥系統能夠顯著提高化療的效果，并且減少其副作用。在非小細胞肺癌細胞A549中，研究人員發現整合素αvβ3受體高表達［6］，因此利用cRGD序列可以與整合素受體αvβ3結合這一優勢［7］，將cRGD修飾在脂質體表面，構建主動靶向的脂質體給藥系統應用在肺癌治療中，從而產生更好的治療效果。

基于上述研究背景，本研究構建由精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）修飾的cRGD環肽脂質體（cRGD-LP），通過體外的脂質體構建、穩定性考察、細胞攝取和腫瘤球穿透試驗的考察，期望所構建的cRGD-LP可以高效地主動靶向肺癌細胞，增加其抗腫瘤效果。

1 材料與儀器

ZS90粒徑電位測定儀（英國，Malvern），流式細胞儀（美國，BD），激光共聚焦掃描顯微鏡（德國，Leica），A549細胞（ATCC），cRGD（上海吉爾多肽有限公司，純度95%），DSPE-PEG2000-NHS（西安瑞禧生物科技有限公司），DSPE-PEG2000-OMe（上海艾韋特醫藥科技有限公司），磷脂SPC和膽固醇Chole（北京奧博星生物技術有限責任公司），異硫氰酸熒光素標記的磷脂（FITC-PE，美國Sigma），DAPI（碧云天生物技術有限公司），DMEM高糖培養基和胎牛血清（美國，Gbico），其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 DSPE-PEG2000-cRGD的合成［7］準確定量稱量cRGD和DSPE-PEG2000-NHS（摩爾比為2∶1），分別溶解于無水二甲基甲酰胺（DMF）中，二者混合室溫避光反應48 h；之后混合液加入透析袋中（截留分子量1000），超純水透析48 h后，取出透析袋中液體凍干，得純化后的DSPE-PEG2000-cRGD。

2.2 脂質體的制備［4］本課題制備兩種脂質體，其中PEG-LP通過SPC∶Chole∶DSPE-PEG2000-OMe摩爾質量比為3∶2∶0.05比例制得，cRGD-LP通過SPC∶Chole∶DSPE-PEG2000-cRGD摩爾質量比為3∶2∶0.05比例制得。兩種脂質體制備方法如下：將所有脂質體材料溶解于氯仿甲醇混合液（V/V=2∶1）中，室溫旋蒸抽干成薄膜，真空干燥過夜，用PBS室溫水化15 min，探頭超聲40 s制得。對于FITC標記的脂質體，將定量FIPE-PE加入脂質體材料中，與脂質材料一起抽膜制得。

2.3 粒徑和電位的測定所制得的兩種脂質體均用超純水以1∶10稀釋至1 ml，用粒徑電位儀分別對其粒徑和電位進行測定。結果如表1所示，兩種脂質體PEG-LP和cRGD-LP的粒徑均在100 nm左右，PDI均＜0.3，說明該兩種脂質體顯示了良好的均一性。從電位測定結果看，PEG-LP略帶負電荷，cRGD-LP略帶正電荷，但均接近電中性，說明兩種脂質體都具有高穩定性。

表1 不同脂質體的粒徑與電位（n=3）

2.4 血清穩定性測定分別吸取兩種制備的脂質體1 ml，加入到過濾后的胎牛血清（FBS）1∶1混合，所得到的脂質體血清混合物在37℃下孵育，分別于0、1、2、4、8、12和24 h各吸取100 μl，用超純水稀釋到1 ml，對其粒徑進行測定。結果如圖1所示，此兩種脂質體與FBS混合后，在24 h之內，cRGD-LP粒徑維持在115 nm左右，PEG-LP粒徑保持在100 nm左右，表明在體外模擬條件下，此兩種脂質體均具有較高的血清穩定性，有利于脂質體的體內研究。

圖1 不同脂質體的血清穩定性（n=3）

2.5 體外細胞攝取［8］將A549細胞以10萬/孔接種在6孔板中，等細胞完全貼壁后，繼續生長24 h，直到每孔細胞匯合度達到約80%。將所制得到的FITC標記的兩種脂質體各100 μl加入到6孔板中，再加入900 μl DMEM培養基，使得每孔FITC含量為3 μg/ml。37℃繼續孵育4 h，將細胞用PBS洗3次，胰酶消化，將每孔細胞重懸在300 μl PBS中，用流式細胞儀進行測定。結果表明，A549細胞對cRGD-LP攝取的熒光強度是PEG-LP的1.7倍（P＜0.05，圖2），說明cRGD-LP有利于A549細胞的攝取，更易靶向至腫瘤細胞，因此可以使得腫瘤治療效果顯著增加。

圖2 A549細胞對不同脂質體攝取結果（n=3）

細胞攝取定性實驗：將A549細胞如上述方法與兩種脂質體孵育4 h后，PBS清洗3次，加入1 μg/ml的DAPI染色10 min，再用4%的多聚甲醛固定，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞攝取情況。結果表明（圖3），FITC標記的cRGD-LP組的熒光強度顯著高于PEG-LP組。該結果與流式細胞儀定量攝取的結果一致，兩者均表明與PEG-LP相比，cRGD-LP可以更好的靶向A549細胞。

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察A549細胞對不同脂質體的攝取（n=3）

2.6 腫瘤球穿透性實驗［9］用無血清的DMEM配置2%的瓊脂糖凝膠，將此凝膠80℃下加熱至融化，以每孔100 μl接種在96孔板中。待其冷卻至室溫形成固體后，消化A549細胞，以每孔8000個接種在96孔板中。待腫瘤球成形長至直徑為200～300 μm后，將FITC標記的兩種脂質體加入到96孔板中，使得每孔FITC含量為3 μg/ml。繼續37℃孵育4 h后，將腫瘤球吸出，用PBS洗3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min后，在激光共聚焦顯微鏡下考察兩種脂質體腫瘤球穿透能力。結果表明（圖4），FTIC標記的cRGD-LP組的熒光強度高于PEG-LP組，并且在腫瘤球的深部，cRGD-LP組的熒光強度高于PEG-LP組，說明cRGD-LP對A549腫瘤球的穿透能力強于PEG-LP，cRGD-LP比PEG-LP穿透進入腫瘤球深部，更能靶向至深處的腫瘤細胞。

圖4 不同脂質體對A549腫瘤球穿透能力（n=3）

3 討論

在化療中，盡管PEG修飾的脂質體可以被動靶向到腫瘤細胞，但缺乏對癌癥細胞的主動識別能力。整合素作為真核細胞的特異性表達受體，高表達在A549肺癌細胞中。構建整合素修飾的給藥系統，可以比傳統PEG修飾的給藥系統更好的靶向癌癥病灶。盡管有研究證實RGD修飾的脂質體可以主動靶向到整合素高αvβ3表達的腫瘤細胞中［10］，但其與腫瘤細胞之間具有受體飽和效應。最新研究表明，二硫鍵修飾的環肽RGD（cRGD）與線性RGD相比，對整合素αvβ3具有更高的親和力，所以構建cRGD修飾的給藥系統可以更好的主動靶向于腫瘤細胞［11］。

基于上述情況，本研究構建了cRGD修飾的脂質體，該脂質體粒徑在110 nm左右，且具有較高的血清穩定性，說明將構建的脂質體cRGD-LP應用在體內研究中時，cRGD-LP在體內循環中可以保持較高的穩定性，可以減少與血漿蛋白的結合，從而有更多的cRGD-LP蓄積在腫瘤部位，可以使得化療效果增加的可能性大大提高。由于A549細胞高表達整合素受體αvβ3，而cRGD可以與αvβ3高度結合，因此，從流式細胞儀檢測和激光共聚焦顯微鏡觀察結果來看，A549細胞對cRGD-LP的攝取能力更高。正是由于cRGD可以與αvβ3高度結合，從A549腫瘤球穿透試驗表明，cRGD-LP的腫瘤球穿透能力高于PEG-LP，且可以穿透至腫瘤球深部。細胞攝取和腫瘤球穿透試驗均說明cRGD修飾的脂質體可以更好的與A549細胞結合，進入細胞發揮作用。如果將所構建的cRGD-LP載入化療藥物，應用到肺癌治療時，會有更多的化療藥物靶向分布到腫瘤病灶中，從而使得化療的療效大大提高。因此，cRGD-LP展示出其將來在肺癌治療中的良好的前景。

綜上所述，cRGD修飾的脂質體給藥系統，不僅有較高的穩定性，而且與PEG修飾的脂質體相比，更容易被A549細胞攝取，說明cRGD修飾的脂質體有潛力應用在肺癌的治療中，為進一步針對肺癌的化療研究奠定了基礎。

［1］趙欣.載microRNA-34a脂質體靶向治療肺癌干細胞靶的研究［J］.中華生化藥學雜志，2014，1（34）：68-71.

［2］張宏飛，嚴煜，張裕東，等.脂質體介導人NIS基因轉染肺癌A549細胞及其蛋白表達［J］.臨床肺科雜志，2012，17（3）：500-502.

［3］曹純潔.長循環脂質體的研究進展［J］.藥學實踐雜志，2005，23（1）：1-3.

［4］付寒，胡光蓮，何勤.細胞穿膜肽TAT和可斷裂PEG共修飾載紫杉醇脂質體的制備及體外促細胞凋亡作用［J］.藥學學報，2014，49（7）：1054-1061.

［5］彭佩，林愛華，陳軍，等.NGR修飾的香豆素-6隱形脂質體的制備及其體外細胞攝取性質［J］.中國醫院藥學雜志，2014，34（6）：427-432.

［6］趙欣.RGD修飾共載紫杉醇與microRNA-34a脂質體靶向抑制A549肺癌細胞的初步研究［J］.第三軍醫大學學報，2014，36（11）：1183-1186.

［7］Chen ZY，Xin J，Yan D，et al.Cyclic RGD peptide-modified liposomal drug delivery system:enhanced cellular uptake in vitro and improved pharmacokinetics in rats［J］.Int J Nanomedicine，2014，9:921-935.

［8］Chen L，Huang FZ，Cheng LF，et al.GE11-modified liposomes for non-small cell lung cancer targeting:preparation，ex vitro and in vivo evaluation［J］.Int J Nanomedicine，2012，7:3803-3811.

［9］Kim E，Jeno WB，Kim S，et al.Decrease of reactive oxygen species-related biomarkers in the tissue-mimi3D spheroid culture of human lung cells exposed to zinc oxide nanoparticles［J］.J Nanosci Nanotechnol，2014，14（5）:3356-3365.

［10］Su W，Wang H，Wang S，et al.PEG/RGD-modified magnetic polymeric liposomes for controlled drug release and tumor cell targeting［J］.Int J Pharm，2012，426:170-181.

［11］陳鈺，楊蕊，李向東，等.cRGD靶向阿霉素脂質體制備及其對Hela細胞的影響［J］.南京醫科大學學報，2014，34（11）：1481-1485.

Study on liposomes modified by cRGD targeting to lung cancer cell A549 in vitro

Zhang Zhiqiang1，Ma Haiying2，Li Yunxia1，Yang Yanrong1，Zhao Xin11.Department of Respiration；2.Department of Cardiovascular Surgery，the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Xinxiang，Henan，453100，China

ObjectiveTo construct a research on liposomes modified by cRGD（cRGD-LP）and its targeting ability to A549 cells in vitro.MethodsThe cRGD-LP was prepared by film-ultrasonic method.The size and zeta potential of cRGD-LP were detected.The cellular uptake of cRGD-LP to A549 cells was evaluated by flow cytometry.The penetration ability of cRGD-LP into the tumor spheroid was inspected by laser confocal microscopy.ResultsThe size of cRGD-LP was around（112.3±7.8）nm；the polydispersity index（PDI）of cRGD-LP was 0.023±0.045；the zeta potential was（2.38±0.87）mV.The cRGD-LP was stable within 24 h and kept the particle diameter at the level of 115 nm.The cellular uptake ability of A549 to cRGD-LP was 1.7-fold as PEG-LP（liposomes modified by PEG）.The tumor spheroid penetration ability of cRGD-LP was higher than that of PEG-LP.ConclusioncRGD-LP has high tumor targeting ability to A549 cells，and it is a potential drug delivery system.

lung cancer；integrin；cRGD；liposomes

R 734.2

A

1004-0188（2016）05-0482-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.05.007

2015-05-28）

453100河南新鄉，新鄉醫學院第一附屬醫院呼吸科（張志強，李運霞，楊艷榮，趙欣），心外科（馬海英）