扣囊復膜酵母與釀酒酵母混合液態發酵改善糯米酒風味的研究

楊子琳，伍時華，黃翠姬，易弋

（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006）

扣囊復膜酵母與釀酒酵母混合液態發酵改善糯米酒風味的研究

楊子琳，伍時華*，黃翠姬，易弋

（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006）

為了改善釀酒酵母單菌種液態發酵糯米酒的風味，將扣囊復膜酵母3-1Y與釀酒酵母SJ4進行混合發酵，比較混合發酵與釀酒酵母單菌種發酵糯米酒的差異性，并用PCA（主成分分析法）分析混合發酵糯米酒中風味物質含量.結果表明：混合發酵與SJ4單菌種發酵相比，糯米酒中總酸和氨基酸態氮含量分別提高了17.3％，19.8％；甲醇、異丁醇、異戊醇的含量分別由417.4mg／L，321.3mg／L，4.4mg／L降至23.6mg／L，1.3mg／L，0.047mg／L；低級酯達到733mg／L，是SJ4單菌種發酵的3.47倍.總酸、氨基酸態氮、低級酯的升高及有害醇的降低均有效改善了糯米酒的風味和口感；主成分分析混合發酵過程中風味物質含量，得出風味物質的合成活性在發酵54 h期間達到最大值，為進一步改善液態發酵糯米酒風味提供理論基礎.

糯米酒；混合發酵；風味物質；主成分分析

風味物質是衡量糯米酒質量的一項重要指標，糯米酒中的風味物質主要和原料、酵母和陳釀有關.在發酵過程中酵母對風味物質的形成有很重要的作用，大部分風味物質是酵母發酵時產生的副產物［1］.早期研究認為非釀酒酵母耐酒精能力差，在酒精發酵過程中的早衰現象會對酒的風味和口感產生不利影響［2-3］.但隨著研究的深入，發現非釀酒酵母合成風味物質的總含量往往是釀酒酵母的數倍甚至數十倍［4-5］，近幾年研究的重點逐漸轉移到釀酒酵母與非釀酒酵母的混合發酵上［6］.同一酵母屬下各種酵母發酵特性不同，產生的代謝物也不相同，故發酵酒的風味也就不同，不同屬之間的酵母所產生香氣物質的差異更大，酒中風味物質的種類、含量與酵母菌種具有很高的相關性［7］.

以往的研究多注重工藝對其發酵結果的影響或片面追求產酒精度高的酵母菌［8］.本研究在以往研究的基礎上，將扣囊復膜酵母和釀酒酵母進行混合發酵，比較混合發酵與釀酒酵母單菌種發酵的差異性，探究混合發酵的特點，為提高液態發酵糯米酒的質量和風味提供理論研究基礎.

1　材料與方法

1.1原料柳州市某超市所售糯米.

1.2發酵菌株

表1　試驗所用菌株Tab.1 Strains used in the experiment

1.3發酵菌懸液的制備

1.3.1霉菌孢子懸浮液的制備

霉菌孢子懸浮液制備方法按照應玲云文獻［9］中所述方法.

1.3.2酵母菌懸液的制備

酵母菌懸浮液制備方法按照應玲云文獻［9］中所述方法.

1.4培養基

1.4.1霉菌種子培養基［10］

200 g糯米加水浸泡4 h，將浸泡好的糯米瀝干后置于水浴鍋中，加水至剛剛浸沒糯米，待溫度上升至60℃時以10 U／g的接入量加入耐高溫ɑ－淀粉酶，90℃水浴保溫2 h，冷卻后過濾，加水定容至1 L，分裝成50mL／瓶，115℃下高壓蒸汽滅菌30min.

1.4.2酵母菌種子培養基［11］（g／L）

酵母浸膏10，葡萄糖20，蛋白胨20，自然pH，在115℃溫度下高壓蒸汽滅菌30min.

1.4.3糯米液態發酵培養基

按照50 g／瓶的量，稱取糯米加水浸泡4 h后瀝干，加水至剛剛浸沒糯米置于水浴鍋中，待溫度上升至60℃時以10U／g的接入量加入耐高溫ɑ－淀粉酶，90℃保溫2 h，冷卻后加水定量至200 g／瓶，打漿，115℃溫度下高壓蒸汽滅菌30min.

1.5分析方法

1.5.1理化成分分析方法

酒精度、總糖、總酸、氨基酸態氮的測定參照《GBT 13662－2008黃酒》［12］的方法進行.

1.5.2風味物質分析方法

TM－930白酒專用毛細管柱（25m×0.53mm×0.1μm）；載氣為N2；采用程序升溫：起始溫度45℃，恒溫3min，以3.5℃／min上升至62℃，以1℃／min上升至67℃，再以25℃／min上升至200℃，保持6min；進樣口、檢測器溫度220℃；采樣結束時間30min.內標為乙酸丁酯，體積質量為34.17mg／100mL.

1.5.3數據分析用Microsoft Excel，Origin和PCA對實驗數據進行統計分析.

1.6混合發酵接種方式

扣囊復膜酵母3－1Y與釀酒酵母SJ4混合發酵采用順序接種方式：先將3－1Y以5×105個／mL的接種量接入滅菌后的液態糯米發酵培養基中，搖床120 r／min，28℃條件下培養24 h，再以5×105個／mL的接種量接入釀酒酵母SJ4，繼續在搖床120 r／min，28℃的培養條件發酵66h，至培養基還原糖含量不再變化，結束發酵.

1.7液態釀造糯米酒的工藝流程圖

圖1　液態釀造糯米酒的工藝流程圖Fig.1 Flow diagram for glutinous rice wine brewing

2　結果與分析

2.1混合菌種發酵對糯米酒理化性質的改善作用

混合菌種發酵和SJ4單菌種發酵糯米酒的理化指標如表2所示.比較混合發酵與SJ4單菌種發酵糯米酒的理化指標：混合發酵糯米酒中總糖為6.53 g／L，酒精度為9.7％，與SJ4單菌種發酵糯米酒中總糖7.6 g／L，酒精度10.4％差異不顯著（P＞0.05）；糯米酒中適量的酸能起到調味解暴作用，是重要的調味物質［13］，而酒中的氨基酸態反映酒中氨基酸的總量，是糯米酒主要的營養成分，直接體現糯米酒的質量水平［14］.分析總酸和氨基酸態氮含量可知，混合發酵的糯米酒中總酸和氨基酸態氮比SJ4單菌種發酵分別高出17.3％，19.8％.總酸和氨基酸態氮含量的提高，豐富了酒體香味，明顯改善了糯米酒的品質.

表2　單一和混合菌種發酵糯米酒的發酵參數Tab.2 Fermentation parameters of single and mixed fermented glutinous rice wine

2.2混合菌種發酵對糯米酒風味的改善作用

含量過高的異丁醇和異戊醇能夠引起飲用者頭痛，即所謂的“上頭”［15］.由表3可知，SJ4單菌種發酵時異丁醇含量達321.3mg／L，嚴重影響了酒的品質.比較混合發酵與SJ4單菌種發酵，糯米酒中異丁醇、異戊醇的含量分別由SJ4單菌種發酵時的321.3mg／L，4.4mg／L降至1.3mg／L，0.047mg／L，這對糯米酒品質的改善有重要作用.酒中的甲醇對血管有麻痹及導致神經變性作用，尤其損害視神經，過多攝入嚴重時可導致失明，黃酒中不應含有甲醇［16］.混合發酵結束，糯米酒中的甲醇含量由SJ4單菌種發酵時的417.4mg／L降至23.6mg／L.3－1Y與SJ4混合發酵顯著降低了糯米酒中有害醇的含量，混合發酵結束糯米酒中總高級醇含量僅有24.8mg／L.混合發酵的糯米酒中高級醇含量降低可能是由于3－1Y較低的發酵活力導致糖酵解產生的丙酮酸無法高效氧化為乙醇，而是通過其它途徑轉化為乙酰－COA、乙酸和乳酸，導致混合發酵的糯米酒中總酸含量增高，并間接抑制其代謝副產物如高級醇的合成［17］，故需要進一步的試驗研究驗證.

酯是一類具有特殊香味的有機化合物.主要包括脂肪酸乙酯和乙酸酯，它們能賦予酒體獨特的風味，尤其是水果味和花香味［18］.比較混合發酵與SJ4單菌種發酵，糯米酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的含量分別由SJ4單菌種發酵時的45.7mg／L，0.46mg／L顯著增加至221.9mg／L，427.3mg／L，這2種物質的提高對改善液態發酵糯米酒的口感和風味有重要作用.乳酸乙酯主要帶來類似菠蘿香甜味的乙酯，能賦予糯米酒水果香味；具有類似香蕉味的己酸乙酯含量在混合發酵中僅提高了5.6％，增量不明顯，但丁酸乙酯含量卻由原來的154.5mg／L降至72.5mg／L.混合發酵的糯米酒中總低級酯含量達到733mg／L是SJ4單菌種發酵時的3.47倍，明顯改善了糯米酒的風味.

表3　單一和混合發酵糯米酒中風味物質含量Tab.3 Content of flavor com pounds in different yeast inoculation ways to ferment glutinous rice wine mg／L

2.3主成分分析法分析混合發酵過程中風味物質代謝

主成分分析（principal component analysis，PCA）也稱主分量分析，該方法利用降維的思想，將多指標的變量通過線性變換、計算特征值等轉化成少數幾個綜合指標的數理統計方法［19］.如表4及續表4所示，混合發酵過程中糯米酒中9種主要風味物質含量，在Minitab 15分析軟件中運用統計菜單下的主成分分析進行數據統計，得到特征值、貢獻率、累計貢獻率、載荷表（表5）和分值圖（圖2）.

表4　混合發酵過程中糯米酒風味物質含量Tab.4 Content of flavor compounds during the mixed fermentation mg／L

續表4　混合發酵過程中糯米酒風味物質含量Continued Tab.4 Content of flavor com pounds during the mixed fermentation mg／L

由分析結果可知：第一主成分（PC1）所占比率為38.4％，第二主成分（PC2）所占比率為27.2％，第三主成分（PC3）所占比率為14.8％，3個主成分的累計貢獻率為80.4％，分析結果可靠；在主成分分析中，載荷絕對值越大表示該項目與該主成分間的相關性越大，正負值分別代表正負相關，由表5可知，對第一主成分影響較大的依次為己酸乙酯、異丁醇，對第二主成分影響較大的依次為仲丁醇、丁酸乙酯、乳酸乙酯、異戊醇，對第三主成分影響較大的依次為正丙醇、甲醇.

表5　混合發酵過程中主要風味物質載荷表Tab.5 Load table of flavor compounds during the mixed fermentation

由3D分值圖（圖2）可知，發酵102 h的糯米酒PC1值最高，為3.09，發酵66 h的PC2值最高為2.24，發酵19 h的PC3值最高為1.96.計算各發酵時間段的相對貢獻率（PC1×PC2×PC3）絕對值大小，分別為2.5879，1.008 9，2.2623，0.0383，1.6887，5.1039,0.1908，0.03675，0.5679，0.921 7，得出發酵54 h的糯米酒相對貢獻率最大為5.103 9，表明在發酵54 h的這段時間內，酵母細胞中風味物質的代謝活動最為旺盛.

3　結論

注：0～9分別代表發酵時間點：0 h，9 h，19 h，29 h，42 h，54 h，66 h，78 h，90 h，102 hNote：0～9 respectively represent fermentation time：0 h，9 h，19 h，29 h，42 h，54 h，66 h，78 h，90 h，102 h

通過對扣囊復膜酵母和釀酒酵母混合液態發酵改善糯米酒風味物質的研究，初步了解到2種酵母混合發酵的特點.結果表明：混合發酵與SJ4單菌種發酵相比，糯米酒的酒精度及殘糖量差異不顯著（P＞0.05），但混合發酵能提高糯米酒中總酸和氨基態氮含量.除此之外，混合發酵還能顯著改變糯米酒中的風味物質，不僅降低了對人體有害的甲醇、異丁醇、異戊醇的含量，同時合成更多低級酯，有效改善了糯米酒的質量和風味.PCA（主成分分析）分析得出混合發酵54 h左右的時間段是酵母次級代謝最為活躍、風味物質合成活性最高的時候，可在此段時間前加入微生物營養物質，如碳源、氮源、微量元素等來進一步改善糯米酒中風味物質含量.

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（學科編輯：黎婭）

Research of mixed fermentation of saccharomycescerevisiae and saccharomycopsis fibuligera to improve flavor com pounds in glutinous rice wine by liquid fermentation

YANG Zi-lin1,WU Shi-hua*,HUANG Cui-ji,YI Yi
(School of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006,China)

To improve the taste of glutinous rice wine fermented with S.cerevisiae single strain by mixing 3-1Y and SJ4,this paper compared the differences between mixture fermentation and pure fermentation of S.cerevisiae.Flavor substances content in glutinous rice wine were analyzed by PCA(principal component analysis).The results showed:by comparing mixed fermentation and pure fermentation of SJ4,total acid and amino nitrogen content in mixed fermentation were increased by 17.3％,19.8％respectively;the contents of Methanol,isoamyl alcohol and isobutanol in glutinous rice wine were reduced from 417.4mg/L,321.3 mg/L,4.4 mg/L to 23.6 mg/L,1.3 mg/L, 0.047mg/L respectively;the lower esters content was3.47 times as much as pure culture of SJ4 increase to 733mg/ L.The synthesis activity of flavor substances reaches its maximum at about 54h in the mixed fermentation which provide a theoretical basis to further improve the glutinous rice wine flavor.

glutinous rice wine;mixed fermentation;flavor compounds;principal components analysis

TS261.1

A

2095-7335（2016）03-0095-06

10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2016.03.017

2016-04-14

廣西科技攻關項目（桂科攻0782003-2）資助.

＊伍時華，博士，教授，研究方向：發酵工程，E-mail：974499054＠qq.com.