雷公藤內酯醇對卵巢癌SKOV-3細胞株惡性生物學行為影響的實驗研究

郭慧

江西省宜春市婦幼保健；藥劑科，江西宜春336000

雷公藤內酯醇對卵巢癌SKOV-3細胞株惡性生物學行為影響的實驗研究

郭慧

江西省宜春市婦幼保健；藥劑科，江西宜春336000

目的研究雷公藤內酯醇（TP）對卵巢癌SKOV-3細胞株惡性生物學行為的影響。方法培養卵巢癌SKOV-3細胞株，用0、10、20、40、80 nmol/L的TP處理，0 nmol/L TP處理的為正常對照（NC）組，10、20、40、80 nmol/L TP處理的為10 nmol/L TP組、20 nmol/L TP組、40 nmol/L TP組、80 nmol/L TP組，測定細胞活力及細胞Bcl-2、Bax、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1的mRNA含量。結果TP處理能以劑量依賴性和時間依賴性的方式降低卵巢癌細胞活力，同組不同時間點及同時間點多組間的細胞活力比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。10、20、40、80 nmol/L TP組細胞Bcl-2mRNA含量（0.83±0.11、0.68±0.07、0.54±0.08、0.33±0.04）均低于NC組（1.00±0.15），BaxmRNA含量（1.32±0.15、1.66±0.21、2.19±0.35、3.22±0.63）均高于NC組（1.00±0.13），Beclin-1 mRNA含量（1.44±0.18、1.76± 0.24、2.51±0.32、3.10±0.47）均高于NC組（1.00±0.18），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ（1.33±0.19、1.81±0.22、2.49±0.31、3.41±0.51）均高于NC組（1.00±0.17），差異有統計學意義（P＜0.05）。不同劑量TP組Bcl-2、Bax、Beclin-1mRNA含量及LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論TP能夠通過調節Bcl-2/Bax表達、細胞自噬的途徑來抑制卵巢癌SKOV-3細胞株的增殖。

卵巢癌；雷公藤內酯醇；增殖；自噬

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一，早期缺乏典型的臨床癥狀，確診時多數已發展至中晚期，預后情況較差、5年存活率不足30%。卵巢癌的死亡率位居女性生殖系統惡性腫瘤的前列，是威脅女性生命健康的重要疾病。化療是臨床上治療晚期卵巢癌的常用方法，但是受到化療藥物不良反應、耐藥性等因素制＜，整體的化療效果并不理想［1-2］。近年來，臨床學者致力于探尋更加低毒性、高殺傷性的藥物來治療卵巢癌。雷公藤內酯醇（triptolide，TP）是從中藥材雷公藤中分離得到的二萜內酯類化合物，對子宮內膜癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤的生長均有抑制作用［3-4］。但是，關于單獨應用TP是否能影響卵巢癌細胞的惡性生物學行為尚未見報道，本研究主要分析TP對卵巢癌SKOV-3細胞株惡性生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

卵巢癌SKOV-3細胞株購于中科；細胞庫，RPMI1640培養基、牛血清均購于Gibco公司，TP購于Sigma公司，MTS細胞活力檢測試劑盒購于Promega公司，PCR試劑盒購于北京天根公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養SKOV-3細胞株復蘇后用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養，待細胞生長至70%～80%的密度后用0.125%的胰酶進行消化，取消化后的細胞并重懸，接種在培養瓶或培養板中，培養瓶中的細胞用于繼續傳代，培養板中的細胞用于藥物處理。

1.2.2 細胞處理取培養板中的細胞，待細胞密度生長至80%左右，將含有血清的培養基更換為不含血清的培養基，24 h后在細胞孔內加入不同劑量的TP，培養孔內的藥物終濃度分別為0、10、20、40、80 nmol/L。0 nmol/L TP處理的為正常對照（NC）組，不同劑量TP處理的為10 nmol/L TP組、20 nmol/L TP組、40 nmol/L TP組、80 nmol/L TP組。連續處理不同時間后進行后續檢測。每批細胞重復5次。

1.2.3 細胞活力檢測檢測細胞活力時，細胞接種在96孔細胞板中，藥物處理12、24、48 h，分別在培養基中加入20μLMTS檢測試劑，繼續孵育4 h后，在酶標儀上測定450 nm處的吸光度（OD）值。

1.2.4 mRNA含量測定檢測細胞中mRNA含量時，細胞接種在12孔細胞板中，藥物處理24 h后，棄盡培養基，采用RNA提取試劑盒及反轉錄試劑盒進行實驗操作，得到mRNA所對應的cDNA樣本；取cDNA樣本并進行稀釋，然后采用PCR試劑盒配置反應體系，具體體系如下：cDNA樣本1μL、Mastermix反應液10μL、20μmol/L的上下游引物各0.4μL、去離子水8.2μL。按照下列程序進行PCR反應：95℃、15 s，特異性退火溫度、20 s，72℃、25 s，重復40個循環，計算機自動生成擴增曲線及對應的起跳循環數（Ct值），通過2-ΔΔCt公式計算mRNA含量。擴增的基因包括Bcl-2、Bax、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin-1以及β-actin。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組計量資料比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組不同時間點細胞活力比較

TP處理24 h的半最大效應濃度（EC50）為36.8 nmol/L，處理48 h的EC50為13.5 nmol/L。同時間點多組間比較：處理后12、24、48 h，TP組細胞OD值均顯著低于NC組，且TP劑量越大，細胞OD值越低；同組不同時間點比較：TP組細胞處理后12、24、48 h的OD值有差異，處理時間越長，細胞OD值越低。見表1。

表1 各組不同時間點細胞活力比較（x±s）

2.2 各組細胞Bcl-2、Baxm RNA含量比較

處理后24 h，TP組細胞Bcl-2 mRNA含量顯著低于NC組，BaxmRNA含量顯著高于NC組，且TP劑量越大，細胞Bcl-2mRNA含量越低、Bax mRNA含量越高。見表2。

表2 各組細胞Bcl-2、Baxm RNA含量比較（x±s）

2.3 各組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1mRNA含量比較

處理后24 h，TP組細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 mRNA含量均顯著高于NC組；TP劑量越大，細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 mRNA含量越高。見表3。

表3 各組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1m RNA含量比較（x±s）

3 討論

化療是目前臨床上治療晚期卵巢癌的主要方法，配合以放療能夠在一定程度上延長患者的生存時間，但是整體預后并不理想，5年生存率也較低［5-7］。癌細胞對化療藥物產生耐藥性是造成卵巢癌化療效果不佳的主要原因［8-9］，探尋更為有效的卵巢癌化療藥物一直是臨床學者研究的熱點。雷公藤是臨床上用于抗炎、抗腫瘤、兔疫調節等治療的中藥材，TP是從雷公藤中分離得到的二萜內酯類化合物，也是雷公藤的有效成分。已有離體研究證實，TP對子宮內膜癌、胰腺癌等惡性腫瘤細胞的增殖具有抑制效應，能夠造成DNA斷裂、染色質凝集以及凋亡小體形成［3-4］。

近年來，有國內學者報道了TP聯用紫杉醇、順鉑等化療藥物對卵巢癌細胞的體外活性具有抑制作用［10-11］，但是關于TP單藥處理對卵巢癌細胞的影響尚未見報道。本研究根據前期預實驗結果選擇10、20、40、80 nmol/L的TP來處理體外培養的卵巢癌細胞，通過測定細胞活力可知，TP能以劑量依賴性和時間依賴性的方式降低卵巢癌細胞的活力。由此初步證實，TP對卵巢癌細胞的增殖具有抑制效應，推測其具備用于卵巢癌治療的潛在價值。

線粒體凋亡途徑是調節細胞活力的重要機制，Bcl-2家族是介導線粒體凋亡途徑的主要分子［12-13］。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡分子，能與線粒體膜結合并形成滲透性膜轉移孔復合物，調節線粒體膜轉換孔的開放和關閉，誘導線粒體釋放細胞色素C并通過下游Caspase家族來造成細胞凋亡［14-15］；Bcl-2是Bcl-2家族中的抗凋亡分子，能與Bax形成異源二聚體，拮抗Bax誘導線粒體細胞色素C釋放的作用，從而抑制下游Caspase分子的活化及其所介導的細胞凋亡［16］。在使用TP處理后24 h檢測，TP能減少Bcl-2的mRNA含量，增加Bax的mRNA含量，且藥物劑量越大，細胞Bcl-2的mRNA含量越低、Bax的mRNA含量越高。這說明TP能通過Bcl-2/Bax所介導的線粒體凋亡途徑來調節卵巢癌的活力。

自噬是近年來新發現的細胞凋亡機制，又稱為Ⅱ型程序性死亡，指細胞通過溶酶體降解自身受損細胞器及異常大分子物質的過程［17-18］。在惡性腫瘤的發生和發展過程中，自噬過程顯著受到抑制，無法清除體內異常增殖的腫瘤細胞，從而造成腫瘤發生和發展［19］。LC3是公認的自噬標志分子，在自噬處于低水平時，非活化狀態的LC3-Ⅰ表達量高于活化狀態的LC3-Ⅱ；自噬被激活時，LC3-Ⅱ的表達顯著上調、LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ的比例增加［20-21］。同時，在自噬激活及自噬體形成的過程中，自噬相關基因ATG-6的同源基因Beclin-1高表達發揮了至關重要的作用［20，22-23］。TP處理后的細胞自噬水平測定結果顯示，TP能夠顯著增加細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例、Beclin-1含量，且TP劑量越大，細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例、Beclin-1含量越高。這說明自噬是TP調節卵巢癌細胞活力的另一個途徑。

綜上所述，TP能夠通過調節Bcl-2/Bax表達、細胞自噬的途徑來抑制卵巢癌SKOV-3細胞株的增殖。

［1］Nymoen DA，Hetland Falkenthal TE，Holth A，et al.Expression and clinical role of chemoresponse-associated genes in ovarian serous carcinoma［J］.Gynecol Oncol，2015，139（1）：30-39.

［2］劉賢蓮，楊蕾.細胞減滅術輔助術后腹腔熱灌注化療聯合靜脈化療對卵巢癌患者血清惡性生物學指標的影響［J］.海南醫學院學報，2015，21（10）：1411-1414.

［3］王曉菲，吳強，孫志華，等.雷公藤甲素通過依賴于caspase的線粒體途徑促進子宮內膜癌細胞凋亡［J］.南京醫科大學學報：自然科學版，2013，33（2）：168-170.

［4］孫運良，馬建霞，吳紅玉，等.雷公藤內酯醇對人胰腺癌PANC-1細胞的抑制作用及其可能的機制［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2013，20（4）：432-436.

［5］Recchia F，Candeloro G，RosselliM，et al.Adjuvant ovarian suppression，high-dose chemotherapy and immunotherapy for premenopausal patients with high-risk breast cancer［J］.Anticancer Res，2015，35（12）：6847-6853.

［6］Zhou J，Zheng H，Wu SG，et al.Influence of different treatmentmodalities on survival of patients with low-grade endometrial stromal sarcoma：a retrospective cohort study［J］. Int JSurg，2015，23（Pt A）：147-151.

［7］張利亞，鄭愛文.熱灌注化療治療卵巢癌合并腹腔積液療效觀察［J］.中國現代醫生，2014，52（29）：146-148，151.

［8］Zhu LC，Gao J，Hu ZH，et al.Membranous expressions of Lewis y and CAM-DR-related markers are independent factors of chemotherapy resistance and poor prognosis in epithelial ovarian cancer［J］.Am JCancer Res，2015，5（2）：830-843.

［9］Hu Z，Zhu L，Gao J，et al.Expression of FOXP1 in epithelial ovarian cancer（EOC）and its correlation with chemotherapy resistance and prognosis［J］.Tumour Biol，2015，36（9）：7269-7275.

［10］朱四紅，譚布珍，，鏗，等.雷公藤內酯醇聯合紫杉醇對人卵巢癌耐順鉑細胞株體外活性的影響及機制［J］.山東醫藥，2011，51（47）：15-17.

［11］胡輝，譚布珍，，鏗，等.雷公藤內酯醇對耐順鉑人卵巢癌細胞株（COC1/DDP）體外活性影響機制的初步探討［J］.現代婦產科進展，2011，20（11）：846-850.

［12］Chen X，Wei S，Ma Y，et al.Quantitative proteomics analysis identifiesmitochondria as therapeutic targets ofmultidrug-resistance in ovarian cancer［J］.Theranostics，2014，4（12）：1164-1175.

［13］廖文珺.術前子宮動脈栓塞化療對宮頸癌組織中凋亡、侵襲和兔疫分子表達的影響［J］.海南醫學院學報，2015，21（6）：778-780.

［14］Zeren T，Inan S，Vatansever HS，et al.Significance of apoptosis related proteins on malignant transformation of ovarian tumors：a comparison between Bcl-2/Bax ratio and p53 immunoreactivity［J］.Acta Histochem，2014，116（8）：1251-1258.

［15］Park ST，Byun HJ，Kim BR，et al.Tumor suppressor BLU promotes paclitaxel antitumor activity by inducing apoptosis through the down-regulation of Bcl-2 expression in tumorigenesis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，435（1）：153-159.

［16］Yasmeen A，Beauchamp MC，Piura E，et al.Induction of apoptosis by metformin in epithelial ovarian cancer：involvement of the Bcl-2 family proteins［J］.Gynecol Oncol，2011，121（3）：492-498.

［17］Zi D，Zhou ZW，Yang YJ，et al.Danusertib induces apoptosis，cell cycle arrest，and autophagy but inhibits epithelial tomesenchymal transition involving PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in human ovarian cancer cells［J］.Int JMol Sci，2015，16（11）：27228-27251.

［18］Khurana A，Roy D，Kalogera E，et al.Quinacrine promotes autophagic cell death and chemosensitivity in ovarian cancer and attenuates tumor growth［J］.Oncotarget，2015，6（34）：36354-36369.

［19］Lang F，Qin Z，Li F，et al.Apoptotic cell death induced by resveratrol is partially mediated by the autophagy pathway in human ovarian cancer cells［J］.PLoS One，2015，10（6）：e0129196.

［20］Valente G，Morani F，Nicotra G，et al.Expression and clinical significance of the autophagy proteins BECLIN 1 and LC3 in ovarian cancer［J］.Biomed Res Int，2014，2014：462658.

［21］Wen Y，Graybill WS，Previs RA，et al.Immunotherapy targeting folate receptor induces cell death associated with autophagy in ovarian cancer［J］.Clin Cancer Res，2015，21（2）：448-459.

［22］江麗琴，周靜，黃偉政.Livin、Beclin1在上皮性卵巢癌中的表達及與腫瘤侵襲轉移的關系［J］.中國現代醫生，2014，52（23）：135-137.

［23］Correa RJ，Valdes YR，Shepherd TG，et al.Beclin-1 expression is retained in high-grade serous ovarian cancer yet is not essential for autophagy induction in vitro［J］.J Ovarian Res，2015，4（8）：52.

Experimental study on the effect of triptolide on m alignant biological behavior of ovarian cancer cell line SKOV-3

GUOHui
Department of Pharmacy，Maternal and Child Health Hospital of Yichun City，Jiangxi Province，Yichun 336000，China

Objective To study the effect of triptolide（TP）onmalignant biological behavior of ovarian cancer cell line SKOV-3.M ethods Ovarian cancer SKOV-3 cellswere cultured，treated with 0，10，20，40，80 nmol/L TP and 0 nmol/L TP treatmentwas NC group，10，20，40，80 nmol/L TP treatmetwas 10 nmol/L TP group，20 nmol/L TP group，40 nmol/L TP group，80 nmol/L TP group respectively.Cell viability and mRNA contents of Bcl-2，Bax，LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ，Beclin-1 were determined.Resu lts TP decreased cell viability of ovarian cancer cell on dose dependent and time dependentmanner，there were significant differences on cell viability in different time points the same group and the same time point between groups（P＜0.05）.Bcl-2mRNA contents（0.83±0.11，0.68±0.07，0.54±0.08，0.33±0.04）of 10 nmol/L TP group，20 nmol/L TP group，40 nmol/L TP group，80 nmol/L TP group were lower than that of NC group（1.00± 0.15）；BaxmRNA contents（1.32±0.15，1.66±0.21，2.19±0.35，3.22±0.63）of 10 nmol/L TP group，20 nmol/L TP group，40 nmol/L TP group，80 nmol/L TP group were higher than that of NC group（1.00±0.13）；Beclin-1 mRNA contents（1.44±0.18，1.76±0.24，2.51±0.32，3.10±0.47）of10 nmol/L TP group，20 nmol/L TP group，40 nmol/L TPgroup，80 nmol/L TP group were higher than that of NC group（1.00±0.18）；LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ（1.33±0.19，1.81±0.22，2.49±0.31，3.41± 0.51）of 10 nmol/L TP group，20 nmol/L TP group，40 nmol/L TP group，80 nmol/L TP group were higher than that of NC group（1.00±0.17），with statistical differences（P＜0.05）.Bcl-2，Bax，Beclin-1mRNA contents and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰin different doses of TP group were compared，with statistical differences（P＜0.05）.Conclusion TP can inhibit the proliferation of ovarian cancer cell line SKOV-3 through regulating the expression of Bcl-2/Bax and cell autophagy.

Ovarian cancer；Triptolide；Proliferation；Autophagy

R737.31

A

1673-7210（2016）05（a）-0024-04

2016-01-16本文編輯：李亞聰）