腺病毒及脂質(zhì)體法介導臍靜脈內(nèi)皮細胞轉染的實驗研究

李　彪　蘭　靜　肖　鳴（內(nèi)江市第一人民醫(yī)院口腔科內(nèi)江641000）

腺病毒及脂質(zhì)體法介導臍靜脈內(nèi)皮細胞轉染的實驗研究

李彪蘭靜肖鳴（內(nèi)江市第一人民醫(yī)院口腔科內(nèi)江641000）

目的：利用腺病毒載體和脂質(zhì)體轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞探討轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞的理想條件。方法：分別使用腺病毒載體和Lipofectamine 2000脂質(zhì)體介導VEGF165基因轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞。轉染后通過倒置熒光顯微鏡檢測轉染效率，對比探討轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞的理想方法。結果：采用脂質(zhì)體法轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞效果不理想，轉染率約11.60％。采用腺病毒載體轉染率明顯高于脂質(zhì)體法，且隨感染復數(shù)增加而增加。結論：采用腺病毒介導VEGF165轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞較脂質(zhì)體法轉染效率高，當M0I= 50時可作為轉染安全有效的條件．這為細胞轉染技術在臍靜脈內(nèi)皮細胞的研究提供實驗基礎。

臍靜脈內(nèi)皮 細胞細胞轉染 腺病毒載體 脂質(zhì)體轉染

種子細胞的培養(yǎng)是組織工程的基本要素，VEGF是目前已知誘導血管再生作用最強的生長因子，但人工添加VEGF的活性時間短。Hudson N等[1]研究認為如果在正常氧分壓下VEGF165的生物半衰期30～45min，在低氧環(huán)境下是6～8h。參與血管形成的主要細胞是內(nèi)皮細胞，通過內(nèi)皮細胞的遷移、增殖、分化和結構重建形成新的毛細血管網(wǎng)[2]。許多研究證實，通過將特定的目的基因轉染到細胞內(nèi)可以使目的基因長期穩(wěn)定持續(xù)性表達。如能將VEGF基因轉導至內(nèi)皮細胞，使其能保持局部VEGF高濃度活性促進血管再生。轉染的關鍵之一是將VEGF基因安全有效轉入靶細胞中并持續(xù)表達，因此需要尋求轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞的合適方法。本實驗選擇臍靜脈內(nèi)皮細胞為實驗對象，用不同腺病毒滴度及不同脂質(zhì)體濃度轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞，探討適合臍靜脈內(nèi)皮細胞轉染的有效條件。

1　材料與方法

1.1材料：腺病毒過表達載體pHBAd-MCMV-GFP-VEGF165以及質(zhì)粒pIRES-GFP-VEGF165構建（漢恒生物有限公司），HUVECs（Sciencell公司），DMEM培養(yǎng)基（北京賽默飛世爾生物化學有限公司），胎牛血清（FBS）（北京賽默飛世爾生物化學有限公司），二甲基亞砜（美國Sigma公司），0.25％胰蛋白酶（美國Sigma公司），Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）。

1.2臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）的復蘇培養(yǎng)：快速將凍存管從液氮罐里拿出，放入37℃水浴鍋升溫，2min內(nèi)將凍存管中液體解凍。復溫后吸出細胞至15mL離心管，1∶1緩慢加入培養(yǎng)液，離心去除培養(yǎng)液后用新鮮培養(yǎng)液重懸細胞，轉移到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.3脂質(zhì)體（Lipofectamine 2000）轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞：臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)至約80％～90％融合時，消化成細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)，按1×105個細胞每孔接種到24孔板，加入培養(yǎng)基500μL混勻放進37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。細胞貼壁后小心棄掉舊培養(yǎng)基，各孔中加入400μL培養(yǎng)基，按每孔4μg質(zhì)粒和10μL Lipofectamine 2000脂質(zhì)體，輕輕搖晃孔板混合后在37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h觀察轉染情況。

轉染效率（％）=熒光視野下細胞數(shù)/普通視野下細胞數(shù)×100％

1.4腺病毒感染臍靜脈內(nèi)皮細胞：臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)至約80％～90％融合時，消化成細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)，按1×105個細胞每孔接種到24孔板，加入培養(yǎng)基500μL混勻放進37℃5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。各孔以10、25、50、100的感染復數(shù)加入攜帶VEGF165的腺病毒載體，培養(yǎng)72h后觀察轉染情況。

轉染效率（％）=熒光視野下細胞數(shù)/普通視野下細胞數(shù)×100％

1.5統(tǒng)計學方法：采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1脂質(zhì)體轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞：采用脂質(zhì)體轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞，轉染率低，100倍顯微鏡下拍照后采用Image-pro Plus軟件分析測得熒光蛋白表達量。結果示轉染率為11.60％。見圖1。

2.2腺病毒轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞：采用腺病毒轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞，當MOI=10，25，50時見有少量懸浮死細胞，HUVECs細胞形態(tài)無明顯變化，在M0I=100有較多懸浮死細胞，HUVECs細胞收縮，變圓，胞核不清，核仁消失。鏡下拍照后Image-pro Plus軟件分析測得熒光蛋白表達量，結果提示，感染復數(shù)為10、25、50、100時轉染率分別為10.80％、45.37％、90.85％和94.7％，轉染率明顯高于脂質(zhì)體法，但當感染復數(shù)為100時鏡下見培養(yǎng)基中有較多漂浮的死細胞。所以M01=50為最佳感染復數(shù)。見圖1。

3　討論

細胞轉染技術是指將有生物功能的外源性基因片段導入細胞并使其表達的技術。隨著細胞生物學及分子生物學等研究的不斷發(fā)展，其應用越來越廣泛。選擇理想載體是基因轉染的重要環(huán)節(jié)，合適的載體會有更高的轉染效率，因此基因轉染需要根據(jù)實驗條件，選擇更好的載體及轉染方法。本實驗通過腺病毒及脂質(zhì)體法轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞，探討臍靜脈內(nèi)皮細胞轉染的理想條件。

目前，用做基因轉染的載體主要有病毒載體和非病毒載體兩大類。常用的病毒類載體有4種：逆轉錄病毒、慢病毒、腺相關病毒以及腺病毒。逆轉錄病毒只能用于轉染分裂期細胞，轉染率高、基因表達穩(wěn)定；慢病毒可轉染非分裂期和分裂期細胞，可攜帶基因片段較長，目的基因表達效率較高，但慢病毒載體的生物安全性低；腺相關病毒是目前可攜帶外源基因容量最大的，轉染效率高，但細胞毒性大；腺病毒載體以其低毒性，相比之下安全性能高，可轉染非分裂期及分裂期細胞，宿主范圍廣，不整合入宿主細胞染色體，可攜帶的外源性基因量較大等優(yōu)越性能成為應用最廣泛的病毒載體[3]。非病毒載體轉染法包括脂質(zhì)體介導轉染、DEAE葡聚糖介導轉染、陽離子聚合物介導轉染、磷酸鈣介導轉染及電擊基因轉導等[4～5]，在非病毒載體中脂質(zhì)體介導轉染法最為常用。本實驗采用脂質(zhì)體介導和腺病毒載體這兩種方法轉染臍靜脈內(nèi)皮細胞。實驗結果發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體轉染法對臍靜脈內(nèi)皮細胞的轉染率較腺病毒載體低，在使用腺病毒作為轉染載體時轉染率隨MOI的增加而升高，當MOI=50時，轉染率為90.85％。腺病毒是一種線性雙鏈病毒，無包膜，直徑60～90nm，廣泛分布于自然界。腺病毒可分為禽腺病毒屬和哺乳動物腺病毒屬，其中人腺病毒是哺乳動物腺病毒屬的代表，人腺病毒可分為A-F六種亞型及50多個血清型，其中血清型C組2和5型目前應用較多，常用的腺病毒刪除了其中基因組E1區(qū)因此可避免腫瘤的發(fā)生安全性較高[6]。腺病毒可分為三代：第一代腺病毒載體刪除了基因序列中E1和E3表達盒，由于僅E1區(qū)缺失它在能夠為其提供E1缺失蛋白的宿主細胞時可能會引起細胞病變；第二代腺病毒載體在第一代基礎上刪除了E2a和E4表達盒修正了不足并降低了免疫性，不過目標基因持續(xù)表達時間仍較短；第三代腺病毒載體只保留包裝信號和復制信號去除了大部分腺病毒基因，可攜帶的外源基因較大，持續(xù)表達目的基因的時間也大大提高，轉染后無病毒自身蛋白表達并且避免了免疫反應，擁有很好的應用前景[7]。腺病毒載體具有許多優(yōu)點，但MOI過高會造成細胞毒性，本實驗中腺病毒載體轉染時轉染率隨MOI增加而增加，感染復數(shù)為10、25、50、100時轉染率分別為10.80％、45.37％、90.85％和94.7％，同時在MOI=10、25、50時可見有少量懸浮死細胞，HUVECs細胞形態(tài)無明顯變化，而在M0I=100有較多懸浮死細胞，HUVECs細胞收縮，變圓，胞核不清，核仁消失，這可能是由于腺病毒載體濃度過高引起宿主細胞中毒。由此可見，當MOI=50時腺病毒載體對臍靜脈內(nèi)皮細胞的轉染率高，同時無明顯毒性作用，這為臍靜脈內(nèi)皮組織工程的研究提供實驗基礎。

[1]Hudson N,Powner MB,Sarker MH.Differential apicobasal VEGF signaling at vascular blood-neural barriers.DevCell.2014 Sep 8；30（5）∶541-52.

[2]Ahsan A,Han G,Pan J,Tang Z.Phosphocreatine protects endothelial cells from oxidized lowdensity lipoprotein induced apoptosis by modulating the PI3K/Akt/eNOS pathway.Apoptosis[J]. 2015 Dec；20（12）∶1563-76.

[3]胡奇嬋，陳玥，王麗，等.腺病毒載體用于基因治療的研究進展[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2011，5∶76-80.

[4]Pang P,Wu C,Gong F,Zhu K,Meng X.Nanovector for Gene Transfection and MR Imaging of Mesenchymal Stem Cells.Biomed Nanotechnol[J].2015 Apr；11（4）∶644-56.

[5]Su CH，Wu YJ，Wang HH，Yeh HI.Nonviral gene therapy targeting cardiovascular system[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2012，303（6）：H629-H638.

[6]ChailertvanitkulVA，PoutonCW.Adenovirus∶ablueprintfor non-viral gene delivery[J].Curr Opin Biotechnol，2010，21（5）：627-632.

[7]李愛玲.腺病毒載體在基因治療研究中的應用[J].陜西農(nóng)業(yè)科學，2012，5∶103-104.

Experimental reserch of human umbilical vein endothelial cells transfected by adenovirus and liposome

Li biao Lan jing Xiao ming（The first people's hospital of neijiang，department of stomatology，Sichuan Neijiang，641000）

Objective∶To discuss the ideal conditions for transfection of human umbilical vein endothelial cells by adenovirus and Liposomes.Method∶Transfection VEGF165 gene into human umbilical vein endothelial cells by using adenovirus vector and Lipofectamine 2000.After transfection，the transfection efficiency was detected by inverted fluorescence microscope to explore the ideal way of transfection umbilical vein endothelial cells.Result∶By liposome transfection of human umbilical vein endothelial cells is not satisfactory as the expression was measured rate of about 11.6％.The transfection efficiency of adenovirus vector was significantly higher than that of liposome，and increased with the increase of the number of infection.Conclusion∶The transfection efficiency of human umbilical vein endothelial cells transfected with adenovirus vector was higher than that of liposome method，and when M0I=50 can be used as a safe and effective transfection，which provides experimental basis for the research of human umbilical vein endothelial cells.

Human umbilical vein endothelial cells Cell transfection Adenovirus vector Lipofection

R 543

B

1672-8351（2016）11-0130-02