西林火姜健康組培苗快繁體系的建立

黃皓　周生茂　尚小紅　郭元元　文俊麗　班美玲　王玲平　陶偉　車江旅　陳振東

西林火姜健康組培苗快繁體系的建立

黃皓周生茂尚小紅郭元元文俊麗班美玲王玲平陶偉車江旅陳振東

為了篩選出西林火姜健康組培苗快繁體系，以西林火姜的莖尖為組培材料，對其組培苗分化、增殖和生根同步培養基進行了篩選，并對組培苗進行了病菌和病毒檢測。試驗結果顯示，適合西林火姜分化、增殖和生根一步成苗的培養基配方為MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；在組培苗后期壯苗時加入蔗糖、活性炭和多效唑的濃度分別以4%、0.10%和0.05%最佳；目前生產中對于常用的生姜健康組培苗還不能完全脫除病菌和脫毒，表明生姜健康組培苗快繁體系因生姜基因型而異，而且目前的脫病菌和脫毒技術還需改進。

生姜（Zingiber officinale Roscoe）為姜科姜屬多年生草本宿根單子葉植物，富含揮發油和姜辣素等功能性有效成分，以地下肥大的肉質根狀莖為食用器官，是典型的藥食兩用的經濟作物，在我國中部、東南部和西南部各省廣泛種植［1，2］。我國生姜常年種植面積達63萬hm2，年產量已達1 000萬t，約占世界產量的45%，出口量居世界第一［3］。廣西是我國生姜的主要產區之一，據農業部門統計，常年種植面積達5萬hm2，主要分布在桂西北的石山區和鄰近云貴高原的縣市區域，是當地農戶的主要收入來源。因此，生姜產業對于廣西乃至我國生姜種植戶增收和實現小康極為關鍵。

生姜依照姜塊大小和品質優劣可分為小姜型、中姜型和大姜型［4］，在廣西上述3種類型都有種植，其中小姜型種植面積最大，因為其藥食和加工兼用。因為生姜在我國栽培時極少開花，即使開花，也常常無花粉，無法進行雜交種生產，所以，長期以來生產上主要靠塊根進行無性繁殖，但無性繁殖會導致姜體積累大量的病菌和病毒［5］。其中，姜瘟病和花葉病毒病是生姜栽培中最主要的病害，一般產量損失可達20%～30%，重則50%～70%［5，6］，嚴重制約了生姜產業可持續發展。

植物組培快繁技術快速發展，并成功應用于生姜組培苗的脫菌、脫毒，其作用明顯，不僅提高了生姜的產量和品質，而且降低了姜種成本，獲得了較好的經濟效益［7］。但是在生姜組培苗生產過程中，也存在許多因素制約了產業的進一步發展，比如組培分化繼代的時間過長、后期移栽成活率不高、種塊生產成本過高等［8］。而且培養基還存在生姜基因型差異，比如先前利用萊蕪大肉姜組培苗生產所用培養基進行西林火姜繼代，但未獲得理想的繼代系數。為了解決這些問題，許多研究者根據試材特性，篩選更適合組培苗生長的配方，例如分化、增殖和生根一步成苗的配方；為提高后期移栽成活率，進一步摸索更好的壯苗配方；為繼續壓低組培苗生產過程中的成本，利用木薯粉替代蔗糖［9］或使用液體培養基［10］，取得了很好的效果。

為了建立廣西地方生姜品種西林火姜健康組培苗快繁體系，生產更多脫菌脫毒的姜種，促進西林火姜健康組培苗產業可持續發展，以西林火姜為組培材料，開展了西林火姜分化、增殖和生根一步成苗和培育健壯組培苗的培養基篩選試驗。

1　材料與方法

1.1試驗材料

西林火姜姜種由廣西西林匯浤工貿有限責任公司提供。西林火姜又名細肉姜、小黃姜，株高80 cm，分枝較多，姜球較小，個體勻稱，呈雙層排列，根、莖、皮、肉皆為淡黃色，嫩芽紫紅色，肉質致密，辛辣味濃，是制作烤姜塊（片）的主要原料。

1.2試驗方法

①分化、增殖和生根同步培養基的篩選a.培養基配制。為篩選出脫毒姜的分化、增殖和生根同步化培養基，首先，以MS培養基為組培的基本培養基，向MS中分別添加6-BA（以A表示，下同）、NAA（以B表示，下同）和IBA（以C表示，下同）3種激素，每種激素設4個濃度，然后，按正交設計表L16（43）確定組合處理數為 16個，除 1號處理為對照1外，另分別以僅加0.2 mg/L NAA（17號）、0.2 mg/L IBA（18號）和MS培養基（即無激素，19號）作為其他3個對照（表1）。

b.外植體培養與接種。西林火姜姜塊用50%多菌靈800倍液浸泡處理30 min后撈出晾干，置于催芽盒中，在25℃條件下恒溫催芽。當姜芽長到1～2 cm及時切下，先表面清洗，再用0.1%HgCl2溶液消毒并沖洗干凈，在解剖鏡下剝取大小為0.2～0.5 mm的莖尖，接種于培養基上。

每個處理10瓶，每瓶 2個單芽，60 d后統計并計算每個處理的平均分化率、芽增殖倍數和生根率，以此確立西林火姜芽尖分化、增殖和生根同步培養基。

②病原檢測a.細菌檢測。在超凈工作臺上選取每瓶組培苗根部組織和附近瓊脂的混合樣本約0.5 g，用總土壤DNA提取試劑盒 （美國Mpbio公司）提取樣本總DNA。以提取的總DNA為模板，大腸桿菌活化菌株為陽性對照，用篩選出來的細菌16S rRNA擴增引物進行擴增，并電泳檢測其條帶的大小，以判斷樣品是否含有細菌。

b.病毒檢測。利用ELISA試劑盒（購自上海裕平生物科技有限公司），對組培苗中的煙草花葉病毒進行檢測。檢測方法依照試劑盒說明進行，根據酶聯板樣品的顯色情況，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中煙草花葉病毒（TMV）濃度。

③不同因素對組培苗后期壯苗的影響為培育壯苗，提高后期移栽的成活率，分別探討了蔗糖、活性炭和多效唑濃度3個因素對西林火姜組培苗生根后期生長發育的影響。基本培養基為MS+ 4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，蔗糖濃度設0、4%、6%、8%4個梯度；活性炭濃度設0、0.05%、0.10%、0.20%4個梯度；多效唑濃度設0、0.5%、1.0%、1.5% 4個梯度。將通過檢測的健康組培苗的芽分別接到含有不同濃度蔗糖、活性炭和多效唑的培養基中，每個芽長3 cm左右，每個處理20瓶，每瓶2個單芽，至第30天測定增殖數、株高、單株質量、單株生根率、單株生根數和單株平均根長等指標。

1.3數據統計

采用SPSS 18.0統計軟件對數據進行統計，采用SSR法進行方差分析。

表1　西林火姜分化、增殖和生根同步培養基激素篩選的正交試驗設計L16（43）表

2　結果與分析

2.1不同濃度6-BA、NAA和IBA對西林火姜平均分化率的影響

從表2結果可知，在3種激素不同濃度組合的處理中，6-BA濃度為3、4、5 mg/L組合處理的平均分化率均較高，都達到60%以上，而含2 mg/L 6-BA組合處理的平均分化率低于50%，不含6-BA的對照17、18、19號處理的平均分化率更是低于10%。且方差分析顯示，6-BA濃度為3、4、5 mg/L的處理組合與濃度0、2 mg/L的組合處理差異顯著，后2個處理間差異也達顯著水平，說明培養基中添加6-BA顯著促進姜芽分化；在6-BA濃度為3、4、5 mg/L的組合處理中，3、4 mg/L濃度組合處理的平均分化率普遍比5 mg/L的組合處理的高，處理5、6、9、11號的平均分化率超過70%，6號的最高，達75.05%，說明添加6-BA的濃度超過5 mg/L，組培西林火姜的分化率反而降低。當6-BA濃度在一定范圍內，盡管NAA和IBA濃度不同，組培西林火姜的分化率差異變化不大，其中，以0.1 mg/L NAA的分化率較高，而不同IBA濃度誘導的分化率間不存在顯著差異。說明3種激素中6-BA對西林火姜分化誘導作用最大，而NAA和IBA誘導作用較小，其中6號（A2B2C1）處理（MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）的誘導作用最優。

2.2不同濃度6-BA、NAA和IBA對西林火姜平均芽增殖倍數的影響

表2結果顯示，在3種激素不同濃度組合處理中，6-BA濃度為0、2 mg/L的組合處理的芽增殖倍數均小于3（2號除外）；而6-BA濃度為3、4、5 mg/L的組合處理的芽增殖平均倍數都大于4，在其他條件相同時，4 mg/L 6-BA組合處理的芽增殖倍數偏高；各處理間方差分析結果顯示，3、4、5 mg/L組合處理的芽增殖倍數顯著高于0、2 mg/L的組合處理，說明在培養基中添加6-BA有利于西林火姜組培的芽增殖。在相同6-BA濃度處理下，11號（A3B2C1）有最高的芽增殖平均倍數。這些結果說明，與NAA和IBA相比，6-BA對西林火姜組培芽增殖平均倍數的促進作用最大。

2.3不同濃度6-BA、NAA和IBA對西林火姜平均生根率的影響

從表2分析知道，除了1、19號組合處理外，其他組合處理的平均生根率均超過90%外；與對照19號相比，盡管1號處理與其促進生根作用的差異不顯著，但是在培養基中添加NAA和IBA后，6-BA具有輔助促進生根的作用。在相同6-BA濃度條件下，西林火姜組培的平均生根率隨著NAA濃度的增加而增加；在相同NAA濃度條件下，西林火姜組培的平均生根率也隨著6-BA濃度的增加而增加；在相同的IBA濃度下，低濃度的NAA表現出低的平均生根率，但高濃度的NAA并不表現出高的平均生根率；上述結果說明，在促進西林火姜組培苗的生根作用上，NAA起主導作用，作用最大，6-BA與NAA起協調正向作用，而IBA的作用因濃度及其與不同濃度的6-BA和NAA組合而異。

綜合分析認為，對西林火姜組培分化、增殖和生根影響最主要的因素為6-BA，其次是NAA，IBA雖然對后期生根有一定的影響，但作用的效果有抑有促，且不顯著，另外，IBA對前期分化和增殖都起抑制作用，因此，研究認為西林火姜組培分化、增殖和生根同步培養基的適宜配方為 MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

表2　西林火姜分化、增殖和生根同步培養基中不同濃度激素組合處理的結果

2.4病原檢測

①細菌檢測圖1顯示，以提取的樣本總DNA為模板，用篩選出來的細菌16S rRNA擴增引物進行擴增，陽性對照擴增出大概1 500 bp左右的單一目的帶，空白對照（陰性對照）沒有條帶，部分樣品也出現目的帶，說明部分樣品可能帶有內生菌。此檢測方法可以快速方便地檢測出組培苗是否含有細菌，達到快速篩選的目的。

②病毒檢測用ELISA試劑盒對組培苗中的煙草花葉病毒進行檢測。目前檢測了部分組培苗煙草花葉病毒的含量，每1 g樣品超過閾值4 ng TMV的有5個，占全部送樣的30%左右，說明病毒脫毒率在70%左右。用莖尖培養出來的組培苗少部分還帶有病毒，可能和莖尖大小、操作方法等因素有關。

2.5不同因素對組培苗后期壯苗的影響

①蔗糖濃度對組培苗壯苗的影響從表3可以看出，經過30 d培養后，隨著蔗糖濃度的升高，平均增殖數和平均株高呈逐漸降低的趨勢，這可能和較高濃度的蔗糖抑制芽的生長速率有關，但是平均單株質量、根長、根粗和生根數卻先增加后減少，說明適當濃度的蔗糖能夠促進根的生長。綜合來說，添加4%、6%蔗糖的培養基中組培苗的平均單株質量、根長、根粗和生根數比其他蔗糖濃度高，其中添加4%蔗糖的培養基中組培苗增殖數相對較高，組培苗比較粗壯，而且根系較發達，葉色濃綠，說明4%是培育健壯組培苗的最佳蔗糖濃度。

②活性炭濃度對組培苗壯苗的影響從表4可以看出，加了不同濃度活性炭的培養基的組培苗平均增殖數都低于基本培養基，這可能與活性炭吸附部分激素導致激素不夠有關。添加0.2%活性炭培養基的芽增殖數最低，但株高最高，較細弱。加了0.1%活性炭的培養基的平均根長、根粗和生根數都最高，說明0.1%活性炭可以適當促進組培苗根的生長，且苗粗壯、翠綠。

③多效唑濃度對組培苗壯苗的影響從表5可以看出，隨著多效唑濃度的升高，平均增殖數和株高呈逐漸降低的趨勢，可能和多效唑促進側芽生長從而降低生長速率有關。平均單株質量、根長和根粗隨著多效唑濃度升高而增加，但平均生根數卻逐漸減少，說明較高濃度的多效唑促進根增粗、增長，但高濃度抑制根數的增多，也不利于根系的發育。添加0.05%多效唑培養基的組培苗相對較壯實，根系也較長、較粗，但較脆且易斷，可能和多效唑促進橫向增長且纖維減少有關，還需要進一步的研究。

圖2　西林火姜組培苗脫菌檢測示意

3　討論與結論

隨著植物組織培養技術的發展和應用，生姜健康種苗得到很好的開發，脫菌、脫毒效果明顯，但是在組培培養基的利用上存在基因型的差異［5，11］。與韋坤華等［12］通過正交試驗研究出萊蕪大姜的繁殖生根同步化培養基為MS+2.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+0.2～0.3 mg/L ABT相比，本研究利用西林火姜為試材，結果是 MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA更適合增殖和生根，而過高濃度的6-BA反而抑制分化且容易使芽產生玻璃化現象，且過高濃度NAA也不能顯著促進根的生長發育，反而會降低芽的增殖倍數。齊蘭等［14］以海南小黃姜的莖尖為外植體，摸索出適合外植體增殖和生根的培養基為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，而Sathyagowri等［13］以本地生姜莖尖為材料，認為適合繼代和生根的培養基為MS+5.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。研究結果的不一致可能和生姜基因型和培養方式不同等因素有關。

表3　不同濃度蔗糖處理30 d后對生姜組培苗增殖和生根的影響

表4　不同濃度活性炭處理30 d后對生姜組培苗增殖和生根的影響

表5　不同濃度多效唑處理30 d后對生姜組培苗增殖和生根的影響

組培苗后期壯苗的培養也是一個重要的環節，培養出健壯的組培苗不僅能大大提高煉苗和移栽成活率，還可進一步降低生產成本。生姜組培主要用蔗糖作為碳源，不同時期需要的蔗糖濃度不一樣。隨著蔗糖濃度的增加，組培苗前期生長受到明顯的抑制，部分表現出葉偏黃、生長緩慢等現象，但后期逐漸變壯，塊根質量、根長和根數明顯增加［14］。本研究結果表明，以4 mg/L蔗糖濃度為宜，過高濃度的蔗糖會抑制組培苗生長，因為組培苗難以承受過高的滲透壓，這與周遜等［15］和Abbas等［16］的研究結果一致。活性炭也是影響壯苗的一個因素，它能吸附有害物質并提供暗環境促進根部發育。本研究發現，加入0.05%活性炭的培養基培育的苗最健壯且根部發達，適宜后期煉苗移栽，張華峰［17］研究表明，組培苗生根培養基中加入活性炭最合適的濃度為0.03%，而郭英華［18］研究則認為活性炭對根狀莖誘導沒有明顯作用，因為過高濃度的活性炭會吸附過多的激素造成激素不足。多效唑大多用于培養試管姜，陳傳紅等［19］和王志敏等［20］研究多效唑對生姜組培苗和試管姜形成的影響時發現，一定濃度范圍內的多效唑有利于組培苗的生長，并能提高組培苗的抗性。本研究發現，在培養基中加了0.05%多效唑，組培苗更壯實，根系更粗，但相對不加多效唑的培養基，組培苗根數減少，根系也相對脆，不太利于后期的移栽，這些問題有待于進一步的研究。綜合來看，本研究的結論是生姜健康組培苗快繁體系因生姜基因型而異，而且目前的脫病菌和脫毒技術還需改進。

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10.3865/j.issn.1001-3547.2016.20.012

廣西科學研究與技術開發計劃項目（桂科轉14125003-2-10）；廣西農業重點科技計劃項目（NY2014004）；廣西農業科學院科技成果轉化項目（農成轉2015008）；廣西農業科學院基本科研業務專項項目（2015YZ03）；物種資源保護費項目（1120162130135252038）

黃皓，廣西農業科學院蔬菜研究所，南寧，530007，

電話：0771-3247318，E-mail：804667483@qq.com

周生茂，通信作者，廣西農業科學院蔬菜研究所，

E-mail：maomaozhou70@gxaas.net

尚小紅，郭元元，文俊麗，陳振東，廣西農業科學院蔬菜研究所

班美玲，廣西環境保護科學研究院

王玲平，浙江省農業科學院蔬菜研究所

陶偉，車江旅，廣西農業科學院

2016-06-21