一體式微弱熒光檢測(cè)器的研究與設(shè)計(jì)*

姚定勇，蔡　強(qiáng)*，沈國金，王振華

（1.杭州電子科技大學(xué)電子信息學(xué)院，杭州310018；2.浙江清華長(zhǎng)三角研究院，浙江嘉興314006）

一體式微弱熒光檢測(cè)器的研究與設(shè)計(jì)*

姚定勇1，2，蔡強(qiáng)1，2*，沈國金2，王振華2

（1.杭州電子科技大學(xué)電子信息學(xué)院，杭州310018；2.浙江清華長(zhǎng)三角研究院，浙江嘉興314006）

設(shè)計(jì)完成了一體式微弱熒光檢測(cè)器，該檢測(cè)器可以檢測(cè)經(jīng)激發(fā)光照射后熒光染料、綠色熒光蛋白等物質(zhì)發(fā)出的微弱熒光信號(hào)，由此測(cè)得熒光素、綠色熒光蛋白等物質(zhì)的含量。檢測(cè)器由光源模塊、PN放大模塊、采樣控制模塊和通訊模塊組成。應(yīng)用測(cè)試結(jié)果表明該檢測(cè)器能檢測(cè)1 000個(gè)光子的微弱熒光強(qiáng)度變化，精度上可檢測(cè)3.0 pmol的熒光素，滿足一般的微弱熒光檢測(cè)需求。

光電檢測(cè)；一體式；熒光分析；跨阻放大電路；積分放大電路

熒光分析是定性或定量分析物質(zhì)特性的重要方法，具有靈敏度高，信號(hào)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)［1］。熒光分析法能夠提供熒光強(qiáng)度、熒光效率以及熒光壽命等重要參數(shù)信息［2］，廣泛應(yīng)用于工業(yè)分析、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥、生物等領(lǐng)域。對(duì)于很多樣本量或樣本體積較小的情況下，熒光強(qiáng)度較低，因此微弱熒光檢測(cè)具有重要意義。

微弱熒光檢測(cè)主要采用光電二極管或光電倍增管作為探測(cè)器。微弱熒光的檢測(cè)方法有兩類，一類是直接檢測(cè)法，另一類是基于互相關(guān)等數(shù)學(xué)原理的檢測(cè)法，如鎖相放大器［3］，取樣積分器［4］。直接檢測(cè)法原理簡(jiǎn)單，信噪比相對(duì)低，不受信號(hào)類型限制，容易調(diào)試，是目前最常用的微弱熒光檢測(cè)法；而鎖相放大器和取樣積分器，輸出信噪比高，會(huì)受信號(hào)類型限制，鎖相放大器適用于單頻和窄帶弱信號(hào)檢測(cè)，而取樣積分器適合檢測(cè)復(fù)雜的寬帶周期信號(hào)，且難以調(diào)試。目前，商用的熒光檢測(cè)器有島津ShimadzuRF-20A，沃特斯2475等，這些熒光檢測(cè)器通常結(jié)構(gòu)復(fù)雜，體積較大，不適合緊湊的儀器結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。因此，本文設(shè)計(jì)一體式微弱熒光檢測(cè)器模塊，為使模塊體積小，且易于調(diào)試，采用LED作為激發(fā)光源，使用直接檢測(cè)法，利用光電二極管結(jié)合放大、濾波等電路檢測(cè)微弱熒光信號(hào)，具有體積小，易于集成，適用范圍廣的特點(diǎn)。

1　整體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

本文設(shè)計(jì)的熒光檢測(cè)器是光學(xué)分析儀器的組成部分，因此要求該檢測(cè)器需具備模塊化，可集成，可控制，輸出數(shù)字信號(hào)的特點(diǎn)。考慮到光學(xué)分析儀器典型應(yīng)用領(lǐng)域，如生物樣品測(cè)定［5］等。本文設(shè)計(jì)的一體式微弱熒光檢測(cè)器要求精度達(dá)到3.0 pmol的熒光素，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為400 nm～750 nm，包括光路結(jié)構(gòu)和電路結(jié)構(gòu)兩部分。

1.1光路結(jié)構(gòu)

檢測(cè)器光路結(jié)構(gòu)如圖1所示。由光源模塊輸出的激發(fā)光入射到樣品孔后，激發(fā)熒光信號(hào)進(jìn)入熒光檢測(cè)光路中，檢測(cè)光路分為激發(fā)光路和發(fā)射光路兩部分。激發(fā)光路是將光源發(fā)射的單色光照射到樣品上，實(shí)現(xiàn)熒光激發(fā)。檢測(cè)光路采用濾光片組加光電二極管的方案，其中濾光片組用于選擇不同的激發(fā)波長(zhǎng)，而光電二極管能檢測(cè)微弱熒光信號(hào)的同時(shí)利用其體積小的特點(diǎn)，可縮短光路尺寸大?。?］，本設(shè)計(jì)選用濱松的S2387-66R型光電二極管。為了適應(yīng)不同場(chǎng)合的需求，光路結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)成插件形式，需根據(jù)檢測(cè)樣本的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)選擇合適的LED和濾光片組，實(shí)物如圖2。以實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)熒光染料Cy3為例，激發(fā)波長(zhǎng)為525 nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm。光源選用Thorlabs公司的LED525E型LED（規(guī)格：T 1-3/4），激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片分別為匯博光學(xué)的EF525-45（規(guī)格：D12×2 mm）和EF595-60（規(guī)格：D12×6 mm）型濾光片，二向色鏡為匯博光學(xué)DM560（規(guī)格：16×15×1 mm）型色鏡。

圖1　光路結(jié)構(gòu)圖

圖2　熒光檢測(cè)器實(shí)物照片

1.2電路結(jié)構(gòu)

檢測(cè)器采用低噪聲前置放大電路調(diào)理光電二極管輸出的光電流，隔離信號(hào)源與后級(jí)放大電路之間的耦合作用［6］。采用二級(jí)放大和濾波電路提高信號(hào)強(qiáng)度，抑制噪聲?？紤]到微弱熒光的激發(fā)光源易受溫度等外界因素干擾，因此本文采用反饋型光源驅(qū)動(dòng)電路，用光電二極管配合低噪聲光電檢測(cè)電路和信號(hào)調(diào)理電路，反饋控制光源驅(qū)動(dòng)電流的的檢測(cè)。實(shí)現(xiàn)激發(fā)光強(qiáng)的穩(wěn)定。電路結(jié)構(gòu)組成如圖3所示。

圖3　電路結(jié)構(gòu)圖

2　檢測(cè)電路設(shè)計(jì)

本文在檢測(cè)電路上采用了兩種方案：跨阻型檢測(cè)和積分型檢測(cè)。其中跨阻型放大器的檢測(cè)方案不受積分時(shí)間限制，因而檢測(cè)速度快，但靈敏度稍低，適用于檢測(cè)速度快，但靈敏度要求不高的場(chǎng)合；積分型因積分特性可以靈活控制檢測(cè)器的靈敏度，但不適合用在檢測(cè)速度要求高的場(chǎng)合。

2.1跨阻式檢測(cè)電路

2.1.1光電轉(zhuǎn)換電路

本設(shè)計(jì)使用日本濱松的S2387-66R型硅光電二極管作為探測(cè)器。用光電二極管組成的光電檢測(cè)電路，實(shí)際上是一個(gè)光→電流→電壓的變換器［7］。S2387-66R型光電二極管的靈敏度在光波長(zhǎng)為560 nm時(shí)典型值為0.33 A/W，暗電流最大50 pA，可以檢測(cè)nW級(jí)微光功率。考慮到在微弱光強(qiáng)信號(hào)測(cè)量中，暗電流帶來的噪聲非常明顯［8］，本設(shè)計(jì)采用零偏置工作的光伏模式，應(yīng)用于頻率不高的微弱光信號(hào)檢測(cè)［9，10］，電路如圖4所示。根據(jù)電路，輸出電壓為：

式中：S為光電二極管的靈敏度，P為入射光功率，入射光功率為nW量級(jí)甚至更低，Rf為數(shù)百kΩ到數(shù)十MΩ，輸出電壓Vo為幾mV到幾十mV。本設(shè)計(jì)為盡可能提取微弱熒光信號(hào)，反饋電阻大小選擇10 MΩ。電路中Cf用于防止電路自激振蕩，以保證電路能夠工作在良好的線性條件下［11］。

圖4　光電轉(zhuǎn)換電路

在微弱光信號(hào)檢測(cè)電路中，輸入光功率一般在0到幾十nW之間，根據(jù)所選光電池的靈敏度，輸出電流最多只有幾十nA。本設(shè)計(jì)選擇AD8667做為前級(jí)放大電路的運(yùn)放，其典型的輸入偏置電流為0.3 pA，輸入失調(diào)電壓為30 μV，該運(yùn)放輸入偏置電流比輸入信號(hào)小4個(gè)數(shù)量級(jí)，可以達(dá)到較好的信噪比［11］。放大器的輸入失調(diào)電壓是微伏級(jí)，低于目標(biāo)輸出電壓3個(gè)數(shù)量級(jí)，滿足使用要求。

圖5為光電二極管等效電路，輸入偏置電流Is經(jīng)I/V轉(zhuǎn)換后得到的輸出為IB·Rf，輸入失調(diào)電壓經(jīng)運(yùn)放后輸出為（1+Rf/Rs）/VB。AD8667的典型輸入偏置電流0.3 pA，輸入失調(diào)電壓為30 μV，光電二極管的并聯(lián)電阻 Rs典型值為 10 GΩ，反饋電阻Rf為 10 MΩ，因而，輸入偏置電流和輸入失調(diào)電壓對(duì)輸出電壓的影響為幾十μV，當(dāng)輸入光功率在nW級(jí)的時(shí)候，這種影響可以忽略不計(jì)。

圖5　光電二極管等效電路

2.1.2濾波電路

為了提高電路的信噪比，本設(shè)計(jì)在光電轉(zhuǎn)換電路后加入二階有源低通濾波器［12］，以濾除有用信號(hào)頻帶外的噪聲。光電二極管經(jīng)光電轉(zhuǎn)換后得到的是直流信號(hào)，噪聲主要來源于開關(guān)電源。因此，這里只要用低通濾波器濾除開關(guān)電源中引入的噪聲信號(hào)即可，放大器選用AD8667。

濾波電路如圖6所示，傳遞函數(shù)

由于實(shí)驗(yàn)中使用的開關(guān)頻率為100 kHz，為有效濾除開關(guān)噪聲，設(shè)置濾波器截止頻率為1 kHz，令R8=R9=15 kΩ，C16=C17=10 nF，得fH=1.061 kHz。

圖6　濾波電路

2.1.3放大電路

一級(jí)放大電路難以實(shí)現(xiàn)對(duì)微弱信號(hào)的放大，再加上放大器本身增益有限，而且信號(hào)還淹沒在噪聲中，輸入信噪比非常低，所以須采用多級(jí)放大電路來實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大處理［13］。電路如圖7所示，采用二級(jí)放大電路，二級(jí)放大電路與后端AD轉(zhuǎn)換電路結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單的程控放大。利用AD轉(zhuǎn)換芯片對(duì)兩級(jí)放大的輸出分別采樣，根據(jù)信號(hào)幅度取舍信號(hào)。這種方式不僅能夠?qū)崿F(xiàn)程控放大，還可以簡(jiǎn)化電路結(jié)構(gòu)。本設(shè)計(jì)采用OP2177作為主放大電路的放大器，其中

圖7　主放大電路

2.2積分式檢測(cè)電路

本設(shè)計(jì)使用TI公司的IVC102積分放大電路進(jìn)行微弱光功率的測(cè)量，電路如圖8所示。

圖8IVC102積分電路

IVC102是一種采用積分方式的放大器，內(nèi)部集成了100 pF的積分電容。具有積分時(shí)間可調(diào)，噪聲低，響應(yīng)速度快的幾大特點(diǎn)。IVC102的積分輸出為：

其中CINT是積分電容，積分電路的輸出實(shí)際只與IIN（t）有關(guān)。IIN（t）=IS（t）+IN（t），IS（t）光電池產(chǎn)生的電流；IN（t）為噪聲電流，主要來源是放大器的輸入偏置電流以及輸入噪聲電流。光電二極管產(chǎn)生的信號(hào)是直流信號(hào)，由此可以得到

式中，TINT為積分時(shí)間，從公式可知，積分輸出的趨勢(shì)呈線性，積分的結(jié)果是以犧牲時(shí)間為代價(jià)換取檢測(cè)靈敏度。IVC102對(duì)于輸入信號(hào)頻率大于1/TINT的頻率響應(yīng)為-20 dB/dec。因此，對(duì)于高頻信號(hào)而言不適合采用該芯片，而本設(shè)計(jì)的光電二級(jí)光輸出為直流信號(hào)，故適合使用。為增加檢測(cè)范圍，采取分段積分的方法，信號(hào)較弱時(shí)，設(shè)置積分時(shí)間200 ms，信號(hào)較強(qiáng)時(shí)，設(shè)置積分時(shí)間為20 ms。

3　光源驅(qū)動(dòng)電路設(shè)計(jì)

在光電檢測(cè)電路中，除系統(tǒng)本身產(chǎn)生的噪聲，包括光電檢測(cè)器件以及檢測(cè)電路的固有噪聲會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，外部噪聲包括光輻射源的隨機(jī)波動(dòng)和附加的光調(diào)制、光路傳輸介質(zhì)的湍流和背景起伏、雜散光的入射以及檢測(cè)系統(tǒng)所受到的電磁干擾等也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性［14］。因此，本設(shè)計(jì)除通過遮光和加濾光片來減小外部噪聲，還增加了一個(gè)帶光強(qiáng)反饋的驅(qū)動(dòng)電路，穩(wěn)定輻射光源功率，減小外部噪聲干擾。

光源驅(qū)動(dòng)電路采用ADI公司的ADN2830集成電路構(gòu)成，電路如圖9所示。ADN2830是帶有光強(qiáng)反饋功能的光源驅(qū)動(dòng)器。輸出電流范圍在4 mA到200 mA。使用時(shí)需要外接反饋光電二極管，控制回路通過調(diào)節(jié)驅(qū)動(dòng)發(fā)光二極管的電流大小來保持反饋光電二極管的恒定電流，從而使得發(fā)光二極管的光功率恒定。光功率的大小在硬件電路上調(diào)節(jié)。支持可編程報(bào)警機(jī)制，可軟件控制光源驅(qū)動(dòng)器。并提供兩種驅(qū)動(dòng)模式：恒定光功率模式和恒流源模式。恒流源模式可使發(fā)光二極管電流恒定，但無法保證光源的穩(wěn)定，因此這里采用恒定光功率的模式。

圖9　光源驅(qū)動(dòng)電路

4　信號(hào)采集電路設(shè)計(jì)

為直觀讀取微弱光檢測(cè)電路的輸出結(jié)果，需要經(jīng)過數(shù)據(jù)的采集和顯示環(huán)節(jié)［15］。信號(hào)采集電路采用TI公司的ADS1254芯片，它是24 bit高精度串行模數(shù)轉(zhuǎn)換器，運(yùn)用逐次逼近的原理，四通道輸入，模擬電壓的輸入范圍為±10 V，采樣速率可通過外部時(shí)鐘調(diào)節(jié)，最大采樣頻率20 kHz，采用SPI通信方式。采樣電路示意圖如圖10所示，利用STM32作為數(shù)據(jù)采集與傳輸核心，MAX3232是數(shù)據(jù)傳輸?shù)臉蛄?。采樣頻率由CLK決定，本設(shè)計(jì)采用STM32輸出2 M的PWM波作為采樣時(shí)鐘，采樣速率5 kHz，輸出24 bitAD數(shù)據(jù)。STM32單片機(jī)接收采樣指令后進(jìn)行采樣，然后以指令形式返回采樣結(jié)果。

圖10　信號(hào)采集電路示意圖

5　通信協(xié)議設(shè)計(jì)

通信協(xié)議設(shè)計(jì)是基于Modbus-RTU協(xié)議的下發(fā)指令和上傳數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)通信采用主從查詢模式，數(shù)據(jù)校驗(yàn)使用Modbus CRC校驗(yàn)。本設(shè)計(jì)使用Modbus協(xié)議中的03功能，即讀單個(gè)或多路寄存器。接收、發(fā)送指令的格式與具體指令如表1所示。

表1　通信協(xié)議格式

6　應(yīng)用測(cè)試

為測(cè)試一體式熒光檢測(cè)器，本文以生物熒光分析領(lǐng)域的典型應(yīng)用為背景，建立測(cè)試方法，優(yōu)化設(shè)計(jì)方案。測(cè)試方法采用熒光染料Cy3，采用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液稀釋法配置不同濃度待測(cè)溶液，用Thorlabs公司的LED525E型中心波長(zhǎng)為525 nm的LED激發(fā)熒光染料。并用單光子計(jì)數(shù)器的測(cè)試結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)參照。圖11是測(cè)試裝置。測(cè)試方法是將微弱光檢測(cè)模塊掛載在托盤上方，將待測(cè)樣品加在96孔微孔板中，通過主控板控制步進(jìn)電機(jī)的精準(zhǔn)走位，使檢測(cè)模塊的激發(fā)光對(duì)準(zhǔn)樣品孔，熒光染料經(jīng)激發(fā)后發(fā)射微弱熒光信號(hào)被位于孔正上方的檢測(cè)器檢測(cè)，再被主控板讀取并傳送至上位機(jī)顯示。檢測(cè)時(shí)裝置外殼是完全封閉的，避免受外界光干擾。

圖11　測(cè)試裝置

測(cè)試數(shù)據(jù)如表2所示，分別列出了單光子計(jì)數(shù)器的檢測(cè)結(jié)果和熒光檢測(cè)器的檢測(cè)結(jié)果，表中給出了熒光染料中熒光素的含量，以光子的變化量作為光強(qiáng)變化的依據(jù)，與檢測(cè)結(jié)果做對(duì)比。

表2　一體式熒光檢測(cè)器檢測(cè)結(jié)果

從前述方案設(shè)計(jì)和檢測(cè)結(jié)果可以看出：（1）兩種方案的檢測(cè)器精度均可以達(dá)到3.0 pmol的熒光素，可以滿足一般微弱熒光的檢測(cè)。通過對(duì)樣本的重復(fù)測(cè)試得出兩種方法隨機(jī)誤差均小于8%，積分型檢測(cè)器的檢出限為2.9 pmol熒光素，線性度為99.02%；跨阻型檢測(cè)器的檢出限為12.7 pmol熒光素，線性度為99.5%，積分型和跨阻型檢測(cè)器測(cè)量范圍均不超過6.0 nmol熒光素。（2）積分型檢測(cè)器的靈敏度更高，但犧牲了檢測(cè)時(shí)間。（3）積分型檢測(cè)器電路結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但采用IVC102作為積分器其頻率特性使其只適合檢測(cè)低頻微弱熒光信號(hào)；跨阻型檢測(cè)器電路復(fù)雜，但可通過調(diào)整濾波器頻率滿足多數(shù)微弱熒光信號(hào)的檢測(cè)需求。

7　結(jié)論

本文依據(jù)市場(chǎng)上現(xiàn)有熒光檢測(cè)器的不足，結(jié)合微弱熒光檢測(cè)的需求，設(shè)了一體式微弱熒光檢測(cè)器。并根據(jù)檢測(cè)速度和靈敏度要求的不同，給出了兩種方案，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種方案均可用于檢測(cè)熒光分析法中的微弱熒光信號(hào)。其模塊化的特點(diǎn)也為相關(guān)儀器的集成提供了極大的方便。

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姚定勇（1991-），男，漢族，安徽六安人，杭州電子科技大學(xué)在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境檢測(cè)儀器技術(shù)，嵌入式系統(tǒng)，479334246@qq.com；

蔡強(qiáng)（1972-），男，漢族，安徽蚌埠人，浙江清華長(zhǎng)三角研究院分析測(cè)試中心研究員，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境檢測(cè)儀器技術(shù)研究，caiq@tsinghua.edu.cn。

Research and Design of the Integrated Detector for Weak Fluorescence Signal*

YAO Dingyong1，2，CAI Qiang1，2*，SHEN Guojin2，WANG Zhenhua2
（1.Electronic Information Institution of Hangzhou Dianzi University，Hangzhou 310018，China；2.Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University，Jiaxing Zhejiang 314006，China）

A integrated detector is designed and accomplished for weak fluorescence signals，aiming at the detection of the fluorescence intensity emitted by Fluorescent dyes，Green fluorescent protein or other material.The detector can be used to measure the concentration of the Fluorescent dyes，Green fluorescent protein or other material.The detector can be made up of several modules，which are the source of light，the amplifier of PN，sampling control unit and the communication unit.Application of the test results show that the detector can detect weak fluorescence intensity of 1 000 photons change，3.0 pmol Fluorescein.It can be used for general needs of weak fluorescence detection. Key words:photoelectric detection；integrated；fluorescence analysis；conventional transimpedance amplifier；integrating transimpedance amplifier

TP211.6

A

1005-9490（2016）05-1129-06

項(xiàng)目來源：國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)目（2012YQ15008705）；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014F10059）

2015-10-10修改日期：2015-10-27

EEACC:425010.3969/j.issn.1005-9490.2016.05.022