高糖環(huán)境對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞成骨分化能力及其機(jī)制探討

劉云平，劉勇，何延政

西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，四川瀘州 646000

高糖環(huán)境對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞成骨分化能力及其機(jī)制探討

劉云平，劉勇，何延政

西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，四川瀘州 646000

目的觀察高糖環(huán)境對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞成骨分化能力的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討分析。方法采用密度梯度離心法分離及培養(yǎng)取得EPCs（內(nèi)皮祖細(xì)胞），通過(guò)觀察3組（對(duì)照組20 μg/mL、觀察組60 μg/mL、實(shí)驗(yàn)組80 μg/mL）不同濃度高糖干預(yù)液對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移、增殖及凋亡等功能產(chǎn)生的影響，并對(duì)成骨鈣化基因進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，進(jìn)而觀察高糖環(huán)境對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞成骨分化能力所產(chǎn)生的影響。結(jié)果與對(duì)照組比較，觀察組及實(shí)驗(yàn)組可明顯抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移及增殖功能，加速其凋亡，可明顯促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞成骨分化，且觀察實(shí)驗(yàn)組變化最為顯著（P＜0.05）。結(jié)論高糖環(huán)境能明顯抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移及增殖能力，加速其凋亡，可明顯促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞成骨分化；對(duì)深入研究糖尿病血管鈣化機(jī)制有積極作用，為臨床干預(yù)治療提供新相關(guān)依據(jù)。

高糖環(huán)境；內(nèi)皮祖細(xì)胞；成骨分化；糖尿病

近年來(lái)，隨著我國(guó)生活水平的不斷提高，糖尿病發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，而糖尿病致殘及致死主要因素為糖尿病大血管并發(fā)癥。內(nèi)皮組細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞的前端，它對(duì)于血管的重生再造和血管皮膚的復(fù)原都有著十分重要的意義，而高糖環(huán)境可導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量急劇減少及遷移功能出現(xiàn)障礙，糖尿病大血管病變及并發(fā)癥的出現(xiàn)與內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及功能出現(xiàn)紊亂有著密切聯(lián)系；而血管鈣化是糖尿病病人最容易出現(xiàn)的癥狀，它是主血管被破壞的罪魁禍?zhǔn)住W(xué)者講過(guò)研究指出，血管鈣化涉及到多種的細(xì)胞，病變過(guò)程極其復(fù)雜，但是它與人類(lèi)骨骼的成長(zhǎng)過(guò)程差不多，它是一種可以掌控的、自發(fā)的生物發(fā)展程序。血管鈣化主要有兩種病變情況：一個(gè)是動(dòng)脈內(nèi)膜呈現(xiàn)粥狀的變硬，它的病理和脂質(zhì)代謝紊亂極其類(lèi)似，同時(shí)伴有發(fā)炎的情況。與此同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞遭到破壞，無(wú)法自動(dòng)修復(fù)和免疫病毒，遭到破壞的損壞細(xì)胞會(huì)沉積于血管底部，最終導(dǎo)致組織貧血；另外一個(gè)是動(dòng)脈中膜呈現(xiàn)線狀的變硬，它在脂質(zhì)沉積的部位和沒(méi)有炎癥的細(xì)胞軟浸區(qū)極易發(fā)生，這些沉積物最后會(huì)堵塞膠原蛋白的末端，它和平滑肌的分離有很大的關(guān)系。該文通過(guò)觀察高糖環(huán)境對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞成骨分化能力的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

CML-BSA購(gòu)于美國(guó)Cell-Biolabs公司（貨號(hào)STA-314），該產(chǎn)品不能直接使用，需要用PBS將其降低稀釋。美國(guó)公司HyClones出出品的的DMEM/F12；美國(guó)公司GIBCO出品的胎牛的血清（FetalCalfSerum，F(xiàn)BS）；由美國(guó)賽摩科技公司（ThermoFisherScientific）出品的型號(hào)HERACELL150i的CO2類(lèi)細(xì)胞的繁殖箱；流式細(xì)胞儀：美國(guó)BD公司，型號(hào)FACSCaliber；酶標(biāo)儀：美國(guó)BioTek公司，型號(hào)ELx800NB；倒置顯微鏡：日本OLYMPUS公司，型號(hào)IX71-A12FL/PH。

1.2 方法

首先需要對(duì)一個(gè)健康的成人核細(xì)胞進(jìn)行分解，所用的方法為EPSs分解繁殖不同密度離心法。經(jīng)過(guò)此方法后，將有促進(jìn)血管內(nèi)皮發(fā)育的因子以及堿性纖維發(fā)育因子和10%的幼牛血清放入M199培養(yǎng)基進(jìn)行放置，3 d之后除去沒(méi)有貼壁的細(xì)胞，至于貼壁的細(xì)胞，將其繼續(xù)添加生長(zhǎng)銀子，每3 d重新放置，等到第八天的時(shí)候貼壁細(xì)胞被消化吸收殆盡，這時(shí)使用激光式共聚焦顯微鏡額細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.3 分組

為對(duì)比、觀察、實(shí)驗(yàn)（對(duì)比組20 μg/mL、觀察組60 μg/mL、實(shí)驗(yàn)組80 μg/mL），每組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)/d。

1.4 衡量檢測(cè)和所用方式

首先在EPCs96孔式的能力檢測(cè)板上添加100微毫升兩千個(gè)沒(méi)有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，在經(jīng)過(guò)1 d的同步之后，對(duì)他們進(jìn)行不同的處理，每個(gè)小孔添加10 μL升LCCK-8液體繼續(xù)繁殖2 h，酶標(biāo)儀450 nm來(lái)檢測(cè)對(duì)光感應(yīng)程度，最后根據(jù)小孔和對(duì)比孔的對(duì)光感應(yīng)程度分析出EPCs的增加數(shù)量。每一個(gè)小組必須做五次反復(fù)嘗試。然后EPCs死亡能力相關(guān)測(cè)驗(yàn)將處理后的細(xì)胞加入195 μLAnnexinV-FITC結(jié)合液（1X）重懸細(xì)胞。加入5 μL AnnexinV-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min，1000 g離心5 min，棄上清，加入190 μLAn-nexinVFITC組合水微微重新懸掛細(xì)胞。加入10 μmL碘化丙啶染色液體，慢慢地把他們搖勻，在低溫中清晰盡量躲開(kāi)陽(yáng)光。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢查。每組反復(fù)重新做五次。接下來(lái)是EPCs發(fā)育成功的骨頭基因探測(cè)，該探測(cè)采用SYBRGreenI嵌合熒光法在illumna公司的E-coTM-Real.TimePCR儀上進(jìn)行Real.TimePCR實(shí)驗(yàn)，所使用的試劑盒為SYBRPremixExTa qII（TliRNaseHPlus，TaKaRacode：DRR820），反應(yīng)條件為預(yù)見(jiàn)變化95度30 s、PCR對(duì)應(yīng)40個(gè)循環(huán)95度5 s60度30 s、溶解曲線式的解析和總結(jié)。最后是用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行解析，計(jì)量單位用%表示，均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差相等，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度高糖干預(yù)液內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移、增殖及凋亡情況比較

與對(duì)照組比較，觀察組及實(shí)驗(yàn)組可明顯抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)其凋亡，其中實(shí)驗(yàn)組最為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)表1。

表1 各組內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移、增殖及凋亡情況比較

2.2 各組內(nèi)皮祖細(xì)胞成骨分化基因表達(dá)情況比較

與對(duì)照組比較，觀察組及實(shí)驗(yàn)組可明顯增加內(nèi)皮祖細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因BMP2、ALP、RUNX2、OCN的表達(dá)，其中實(shí)驗(yàn)組最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)表2。

表2 各組內(nèi)皮祖細(xì)胞成骨分化基因表達(dá)情況比較

表2 各組內(nèi)皮祖細(xì)胞成骨分化基因表達(dá)情況比較

組別例數(shù)BMP2ALP RUNX2OCN對(duì)照組觀察給實(shí)驗(yàn)組8 8 8 6.51±0.29 3.89±0.25 7.05±0.39 1.69±0.24 2.45±0.14 12.98±0.011 1.11±0.09 3.01±0.21 10.13±0.39 3.43±0.08 4.49±0.11 10.01±0.29

3 討論

血糖升高是糖尿病病理的重要標(biāo)志，患者血糖控制良好與否直接關(guān)系到血管并發(fā)癥的發(fā)病率；糖尿病患者一般情況下有血管并發(fā)癥狀，血管中最重要的內(nèi)皮祖細(xì)胞大量減少，并且遭到毀滅性的損害，這意味著，糖尿病后期的血管病變癥狀與內(nèi)阻皮細(xì)胞的總量聯(lián)系密切，并且內(nèi)皮祖細(xì)胞最大的敵人就是高血糖。除此之外，高血糖對(duì)細(xì)胞的破壞已經(jīng)得到相關(guān)研究確定，很多種特殊情況都可以使得細(xì)胞被破壞。比如線粒體的激活，破壞相關(guān)基因的失衡，細(xì)胞的發(fā)育異變等等。從這次的實(shí)驗(yàn)可以看出，糖分過(guò)多可以回使得

EPCs大量死亡。因而，研究高糖環(huán)境對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移、增殖及凋亡等一些生物的特點(diǎn)的變化和相應(yīng)的改變有很重要的作用。

綜上所述，高糖環(huán)境能明顯抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移及增殖能力，加速其凋亡，可明顯促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞成骨分化；對(duì)深入研究糖尿病血管鈣化機(jī)制有積極作用，為臨床干預(yù)治療提供新相關(guān)依據(jù)。

［1］高冬，焦雨歡，武一曼，等.血府逐瘀湯誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞參與缺血區(qū)血管新生的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32（2）：224-228.

［2］鐘鈞琳，彭隆，羅艷婷，等.瑞舒伐他汀抑制C-反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)［J］.中國(guó)病理生理雜志，2013，29（4）：597-602.

［3］秦臻，黃水清.當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔內(nèi)皮祖細(xì)胞及血清VEGF、SDF-1的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2012，28（2）：211-215.

［4］卓裕豐，許頂立，程穎，等.不同劑量阿托伐他汀對(duì)擴(kuò)張型心肌病患者外周血內(nèi)皮微粒及內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響比較［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（11）：1759-1761.

［5］王娟，周兵，王欣欣，等.Fe3 O4納米粒子與慢病毒載體共同感染內(nèi)皮祖細(xì)胞的促血管新生和MRI示蹤的應(yīng)用［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2016，37（6）：1148-1153.

［6］林海泓，施海明，肖萍，等.普伐他汀對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化及分泌功能的影響［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù).2008（34）

［7］徐展望，張建新，譚國(guó)慶，等.中藥骨碎補(bǔ)提取液對(duì)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外成骨分化的影響［J］.中醫(yī)正骨，2006（6）：69-70.

［8］劉大慶，楊印祥，高艷紅，等.胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中SSEA-4陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的分離和檢測(cè)［J］.科學(xué)通報(bào).2006（11）：59.

［9］馬慧萍，賈正平，張汝學(xué)，等.淫羊藿總黃酮含藥血清促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨性分化［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志. 2004（4）：102-104.

［10］許春姣，翦新春，成洪泉，等.黃芪對(duì)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖和向成骨細(xì)胞分化的影響［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2004（4）：25.

R587.1

A

1672-4062（2016）10（b）-0065-02

10.16658/j.cnki.1672-4062.2016.20.065

2016-07-26）

劉云平（1988.2-），男，四川成都人，碩士研究生，實(shí)習(xí)生，研究方向：血管外科。

何延政（1965.9-），男，四川巴中人，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：周?chē)芡饪苹A(chǔ)與臨床。