釀酒酵母高產乙醇工程菌選育研究進展

馬亢 胡廣宇

摘要：能源危機背景下，近年來由于釀酒酵母在生物質能源中的潛力而被廣泛關注，但是目前釀酒酵母在高溫、產物抑制耐性等方面仍然有諸多不足之處，這無疑提高了生產的工業成本。人們在解決生物質能源發酵過程中需要獲取更高產的菌株。文章梳理了近年來選育釀酒酵母高產乙醇菌種的研究進展，以期為廣大研究者提供研究思路。

關鍵詞：釀酒酵母;生物質能源;工程菌種;育種;生物質能源文獻標識碼：A

中圖分類號：TS261文章編號：1009-2374（2016）04-0067-02DOI：10.13535/j.cnki.11-4406/n.2016.04.034

釀酒酵母被廣泛應用于食品行業及釀酒行業，人們一直以來都在利用各種技術對其進行選育和改良，諸如傳統誘變、自然選育等，研究人員更是試圖尋找優良的菌株應用于食品等行業的生產。近年來，基因技術的快速發展使人們在分子層面上對釀酒酵母更加了解，釀酒酵母作為經典模式生物其基因序列已于1996年完成。此外，當今社會能源資源大量消耗，環境問題日益突出，尋找可再生新能源已是人們擺脫能源危機的重要途徑，乙醇作為生物質能源代替化石燃料已成為人們的普遍共識。盡管目前有很多種生產乙醇的方法，使用的工程菌種也多種多樣，但是釀酒酵母產生乙醇的方式仍然是最有效的途徑。因此，利用現在的基因技術對產乙醇的釀酒酵母進行改造，力求提高乙醇的產量，不僅對食品釀酒行業產生巨大的影響，同時對緩解能源危機也產生深遠的影響。所以近年來在酵母方面的研究大多著力于改良提高釀酒酵母的乙醇產量。本文梳理了近年來釀酒酵母的研究進展，以期為廣大研究者提供研究思路。

1 釀酒酵母的選育

1.1 釀酒酵母的常規育種

一直以來，人們利用各種方法選育優良菌株，常規育種技術包括自然選育和誘變育種，自然選育是外界環境對菌種的選擇，也是生物生存的法則，利用生物內部諸如半保留復制、DNA修復等機制產生的不定向變異，經定向篩選保存留下有利的變異，從而獲得有利的優良工程菌種，常規育種是目前人們獲得優良菌種的簡單有效的方法。

誘變育種是利用外在的條件諸如物理的、化學的手段對菌種施加外源影響，增加突變頻率再來選擇優良菌種的方法。我們經常使用的紫外誘變來對釀酒酵母進行篩選。李艾，李云凱等以實驗室保存的釀酒酵母菌種為原始菌株利用紫外誘變，獲得了一株高溫下仍高產乙醇的菌株。另外，利用誘變育種和基因重拍技術相結合即紫外誘變篩選出耐高溫且產量高的菌株，再進行雜交獲得產量優異的菌株。

1.2 原生質體融合

原生質體融合是人們利用兩個不同的原生質體在克服細胞壁的天然障礙后進行融合，由于其集中了兩核的遺傳物質，能夠獲得更多的遺傳信息，產生更大的遺傳優勢，同時也克服遠源不能雜交的障礙。挑選性能較好的釀酒酵母菌株，利用原生質體融合技術，可以為我們提供性能優異的高產釀酒酵母菌株。Choi等早已利用此技術將貝酵母（S.bayanus KCMM12633）原生質體和釀酒酵母（S.cerevisiae CHY1011）原生質體進行融合獲得的CHFY0321菌株具有較高的發酵性能，乙醇產量得到較大的提高。原生質體融合為我們選育釀酒酵母提供了一條新的途徑。

2 基因工程選育釀酒酵母

基因工程應用廣泛。基因工程即基因拼接技術，是現代一門新型分子生物技術，它利用分子遺傳學理論，將體外的外源基因經質粒構建后導入細胞內，獲得轉基因細胞，由于基因在體外構建，可以更好地按自己的目的去設計我們所需的產品。近年酵母的分子生物研究進展揭示了在釀酒酵母的GC含量較高的地方發生基因重組的頻率較高其中在16條染色體中較短的染色體相對整個基因組水平其重組頻率較高。這為我們對釀酒酵母的改良提供了研究方向，利用這些容易發生重組的基因區可以讓我們篩選到較好的產乙醇菌株。徐國強、吳滿珍等利用功能基因組學的方法研究了釀酒酵母的116個單基因缺失菌株發酵試驗，其結果表明不同的缺失基因，乙醇產率會有較大的區別，盡管沒有進行大規模的試驗，但這為研究人員利用基因工程技術對酵母菌株進行改良提供了基礎。例如，與釀酒酵母乙醇產率相關基因hsf1過量表達后，乙醇的產量大大增加，其產物耐性增強，并且產物的高溫耐性也增加。如果敲除釀酒酵母的gpd1和gpd2基因（這兩個基因控制碳流方向）反而可以獲得更高的乙醇產量。我們對釀酒酵母的產物耐性的相關基因已經有所了解，對于與釀酒酵母產物耐性有關的諸多基因，如果我們單從考慮某一個基因或者某一類基因都不能獲得更好的發酵用菌株。現有研究已經通過基因技術對一種酵母的基因組進行改良，并且取得了較為理想的效果。如Wei等對克魯斯假絲酵母的多個基因進行改造，所獲得的菌株在各個方面的性能都顯示出了比野生型菌株更加優異。

除此之外，利用基因工程技術對釀酒酵母進行定向改良已是我們的研究熱點，高麗麗等就通過基因敲除和反義RNA技術在釀酒酵母細胞內影響ERG7基因。再者對于酵母來說，其代謝過程也是由諸多相關基因構成的，有研究就對代謝過程進行了定向改造，通過對釀酒酵母代謝過程的轉錄因子SPT3進行隨機突變，然后篩選到了耐乙醇性能的菌株，這項研究為我們利用基因工程改造釀酒酵母又提供了一個靶基因。

釀酒酵母發酵過程中有乙酸和甘油兩種主要副產物，曹羅元等人通過構建反義表達載體抑制釀酒酵母Y01工程菌中甘油脫氫酶關鍵基因GPD1轉錄，同時刪除了釀酒酵母DY1工程菌中的乙醛脫氫酶ALD4基因，抑制了酵母發酵中甘油的產量，進而獲得了乙醇產量更高的新型工程菌株——DRY01，其相對原種Y01甘油產量降低了19%，乙醇產量提高了14%。這意味著通過改變釀酒酵母的代謝方向可以更好地利用甘蔗等高糖類植物更高效的生產乙醇。此外影響釀酒酵母大規模生產乙醇的還存在經濟問題，目前釀酒酵母生產乙醇主要依賴谷物和甘蔗等高糖類植物，這些植物本身就是糧食或經濟作物，用來生產乙醇未免過于浪費資源，而且成本很高，這與人們追求廉價、清潔可再生能源的目的相抵觸。野生型釀酒酵母只能有效利用葡萄藤發酵乙醇，但是不能利用木糖。理想情況下應該使用大量廢棄的農產品的副產物，例如秸稈、稻殼、葉片等。限制大規模使用此類副產物的主要問題是需要先經稀酸水解木質纖維素才能被釀酒酵母有效分解，這既增加成本又破壞了環境。為了解決這個問題，需要為釀酒酵母增加木糖代謝途徑。陸亮、涂振東等人通過將導入5種外源的木糖代謝基因（平滑假絲酵母中的木酮糖激酶基因xks1、熱帶假絲酵母中的木糖醇脫氫酶基因xyl2、樹干畢赤酵母中的木酮糖激酶基因xks1、釀酒酵母內源的轉醛酶基因tal和轉酮酶基因tkl1做成轉基因工程菌），隨后在木糖/葡萄糖比例為1∶5的碳源培養基中，乙醇得率為74.85%，有效糖利用率為96.78%，較為有效地利用了木糖。此外區健發、朱明軍等人通過RACE獲得了葡萄牙假絲酵母、管囊酵母和紅法夫酵母中的新型木糖還原酶（XR）、木糖醇脫氫酶（XDH）基因，并聯合嗜熱厭氧桿菌的木糖異構酶（XI-PB8），將其重組到釀酒酵母中，獲得同時具有三條外源木糖代謝途徑的重組工程菌，并證明了其具有木糖代謝能力。

3 結語

在大力開發生物質能源的背景下，我們需要盡可能地提高生產乙醇的效率，這其中涉及改造釀酒酵母的耐性、產物抑制效應、更廣泛的發酵底物、提高碳源利用效率等。目前雖有一些生物能源公司發酵獲得乙醇或甲醇，但由于其發酵是使用大量糧食作物作為底物，在社會上飽受抨擊，所以最好的方式是將能源生產和環境保護相結合，盡量利用農業生產中的廢棄物如秸稈、葉片、葉柄、木屑等木質纖維素發酵，但是野生的釀酒酵母不能代謝纖維素，所以近期的研究熱點是通過基因工程的方式將外源的木糖代謝相關基因導入釀酒酵母形成轉基因工程菌種。目前此類研究發展很快，研究人員已通過各種途徑獲得了一些能夠利用木糖的工程菌，雖然還存在一些產量低、性能不穩定等生產工藝問題，尚不能投入實際使用，但是通過基因工程的方式將外源的木糖代謝相關基因導入釀酒酵母，形成轉基因工程菌種，進而有效利用纖維素資源的方式，是解決生物質能源的一種有效途徑。

參考文獻

[1] 李艾，李云凱，程磊.紫外誘變釀酒酵母篩選耐高溫菌株[J].唐山學院學報，2013，26（3）.

[2] 葉世超，薛婷，王曉斐，等.釀酒酵母耐高溫提高技術的研究進展[J].中國農學通報，2013，29（21）.

[3] 葉世超，薛婷，何文錦，等.釀酒酵母育種技術的研究進展[J].食品工業科技，2013，34（16）.

[4] 徐國強，吳滿珍，吳瑤瑤，等.利用功能基因組學方法研究釀酒酵母乙醇生物合成的調控機理[J].微生物學雜志，2013，33（6）.

[5] Wei P，li Z，He P，et al.Genome shuff in the ethanologenic yeast Candida krusei to improve acetic acid tolerance[J].Biotechnol APPl Biochem，2008，49.

[6] 高麗麗，楊金玲，朱平.采用基因敲除和反義技術抑制釀酒酵母ERG7基因表達[J].菌物研究，2013，11（2）.

[7] 趙心清，姜如嬌，李寧，等.利用SPT3的定向進化提高工業釀酒酵母乙醇耐受性[J].生物工程學報，2010，26（2）.

（責任編輯：秦遜玉）