新型海參硫酸軟骨素葡萄糖受體及葡萄糖醛酸受體的高效合成

蘇凱強, 蔡 超, 于廣利, 管華詩, 李春霞

(中國海洋大學 醫藥學院 海洋藥物教育部重點實驗室 山東省糖科學與糖工程重點實驗室，山東 青島 266003)

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·研究論文·

新型海參硫酸軟骨素葡萄糖受體及葡萄糖醛酸受體的高效合成

蘇凱強, 蔡 超, 于廣利, 管華詩, 李春霞*

(中國海洋大學 醫藥學院 海洋藥物教育部重點實驗室 山東省糖科學與糖工程重點實驗室，山東 青島 266003)

以D-葡萄糖為起始原料，經9步反應合成了2-O-芐基-3-O-烯丙基-1-O-對甲氧基苯基-α-D-葡萄糖(9)；將9的6-位伯羥基經叔丁基二苯基硅烷基(TBDPS)保護，首次合成了正交保護的新型葡萄糖受體2-O-芐基-3-O-烯丙基-6-O-叔丁基二苯基硅烷基-1-O-對甲氧基苯基-α-D-葡萄糖(Ⅱ)，總收率28.2%；將9的6-位伯羥基氧化糖醛酸化后，再經甲酯化，以25.0%的總收率首次合成了新型葡萄糖醛酸受體2-O-芐基-3-O-烯丙基-1-O-對甲氧基苯基-α-D-葡萄糖醛酸甲酯(Ⅲ),化合物結構經1H NMR，13C NMR， IR和HR-MS(ESI)表征。

D-葡萄糖; 葡萄糖醛酸; 受體; 合成

1988年Vieira和Mour?o[1]從Ludwigothureagrisea海參體壁中分離得到了海參硫酸軟骨素，研究發現其主要由N-乙酰氨基D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸、L-巖藻糖及硫酸基組成；其中N-乙酰氨基D-半乳糖與D-葡萄糖醛酸通過β1→4糖苷鍵連接組成海參硫酸軟骨素的主鏈(硫酸軟骨素E骨架)，而巖藻糖以α1→3糖苷鍵連接在葡萄糖醛酸3-位羥基上；由于含有巖藻糖支鏈，因此又被稱為巖藻糖基化的硫酸軟骨素(Fucosylated chondroitin sulfate， FCS, Chart 1)。

Chart 1

研究表明FCS不僅具有抗凝血、抗血栓、抗炎、抗腫瘤、抗病毒及抗高血糖等多種藥理作用，還具有促進血管生成、調節免疫與細胞生長等多種生理活性[2]。其中FCS的抗凝血、抗血栓活性明顯優于肝素(UFH)、低分子量肝素(LMWH)及硫酸皮膚素(DS)[3]；并且FCS主要通過肝素輔因子Ⅱ發揮抗凝血作用而不依賴于抗凝血酶Ⅲ[4]，因此FCS引發出血的風險較小[5]。2006年，Mour?o等[6]研究發現FCS經口服后依然可以表現出良好的抗凝血和抗血栓活性，這一顯著特點克服了肝素類抗凝血藥物只能通過注射給藥的局限性，增加了治療的方便性；因此FCS有望被開發為新型的抗凝血、抗血栓藥物。

目前FCS的獲取主要依靠天然產物的提取分離與純化，但是由于FCS在自然界中含量少、結構復雜，因此很難分離純化得到結構均一、確證的FCS寡糖，嚴重阻礙了FCS的作用機制及構效關系的深入研究。通過化學合成的方法獲取不同聚合度、不同硫酸化模式的FCS寡糖及其衍生物無疑是解決這一問題的有效途徑。通過化學合成法制備FCS寡糖，需要分別制備氨基半乳糖、巖藻糖及葡萄糖醛酸砌塊，由于N-乙酰氨基D-半乳糖及L-巖藻糖分別以β1→4和α1→3糖苷鍵連接在葡萄糖醛酸上，因此尋找一種合適的策略構建葡萄糖醛酸砌塊是制備FCS寡糖的關鍵。

根據FCS的結構特點，在合成葡萄糖醛酸砌塊時需要將葡萄糖醛酸的2,3,4-位仲羥基進行區分保護，使葡萄糖醛酸的3,4-位羥基可以選擇性裸露，以便進行FCS寡糖骨架的構建。而葡萄糖醛酸一般由葡萄糖經氧化反應轉化而來，因此FCS寡糖中葡萄糖醛酸砌塊主要可通過以下兩種合成策略構建：(1)先糖苷化再氧化，即先制得正交保護的葡萄糖受體，糖苷化偶連之后再將葡萄糖的6-位伯羥基裸露進而氧化為糖醛酸；(2)先氧化再糖苷化，即直接將葡萄糖經氧化反應制得葡萄糖醛酸受體，再經糖苷化反應制得FCS寡糖。關于FCS寡糖的葡萄糖受體的研究報道較少，僅Tamura等[7]于2013年以化合物4,6-O-苯亞甲基縮醛基-1-O-對甲氧基苯基-β-D-葡萄糖為起始原料，經6步反應合成了葡萄糖受體2-O-芐基-3-O-對甲氧基苯甲酰基-6-O-叔丁基二苯基硅烷基-1-O-對甲氧基苯基-β-D-葡萄糖(Ⅰ, Chart 2)，但是該合成方法反應條件苛刻，我們多次嘗試均未獲得目標產物；而關于FCS寡糖的葡萄糖醛酸受體的合成研究則至今未見報道。為了快速高效地合成FCS寡糖，需要發展一種操作簡便、適合大量制備的方法來合成FCS寡糖的葡萄糖醛酸砌塊。

Chart 2

本課題組在合成FCS寡糖的過程中，首次設計合成了兩個新型的葡萄糖受體(Ⅱ和 Ⅲ， Chart 2)，并比較了合成策略的優劣。

以廉價易得的D-葡萄糖為起始原料，在路易斯酸FeCl3的催化下與丙酮反應制得1,2,5,6-O-雙異亞丙基-α-D-呋喃葡萄糖(1)； 1依次經烯丙基化、酸解及乙酰化反應制得1,2,4,6-O-四乙酰基-3-O-烯丙基-β-D-葡萄糖(4)[8]； 4在BF3Et2O催化下與對甲氧基苯酚(MEHQ)反應制得3-O-烯丙基-2,4,6-O-三乙酰基-1-O-對甲氧基苯基-α-D-葡萄糖(5)； 5脫除乙酰基后用苯亞甲基縮醛基保護4,6-位羥基制得3-O-烯丙基-4,6-O-苯亞甲基縮醛基-1-O-對甲氧基苯基-α-D-葡萄糖(7)；在7的2-位引入芐基后，再將苯亞甲基縮醛基脫除制得2-O-芐基-3-O-烯丙基-1-O-對甲氧基苯基-α-D-葡萄糖(9)； 9的6-位伯羥基經叔丁基二苯基硅烷基(TBDPS)保護合成了新型葡萄糖受體2-O-芐基-3-O-烯丙基-6-O-叔丁基二苯基硅烷基-1-O-對甲氧基苯基-α-D-葡萄糖(Ⅱ， Scheme 1)，共10步反應，總收率28.2%。另外選擇性地將9的6-位羥基氧化后，再經甲酯化，經11步反應以25.0%總收率合成了葡萄糖醛酸受體2-O-芐基-3-O-烯丙基-1-O-對甲氧基苯基-α-D-葡萄糖醛酸甲酯(Ⅲ， Scheme 1)，化合物結構經1H NMR，13C NMR， IR和HR-MS(ESI)表征。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WRS-2型微機熔點儀；P-1020型旋光儀；安捷倫DD2 500-MR型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內標)；NEXUS 470型紅外光譜儀(KBr壓片)；Micromass Q-TOF Ultima Global型和InoSpec 4.7 Tesla FTMS (MALDI/DHB)型質譜儀。

化合物2～4按文獻方法[8]合成；D-葡萄糖，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；其余所用試劑均為分析純，其中溶劑使用前均經無水處理。

1.2 合成

(1) 1的合成

(2) 5的合成

將4[8]0.9 g(2.32 mmol)和MEHQ 574 mg(4.64 mmol)溶于DCM(15 mL)中，冰浴冷卻，攪拌下加入BF3Et2O 584 μL(4.63 mmol)，反應20 min；撤去冰浴，于室溫反應48 h(TLC監測)。用Et3N淬滅反應，加入DCM 10 mL，用DCM(3×20 mL)萃取，合并有機相，依次用飽和NaHCO3水溶液(2×20 mL)和飽和NaCl溶液(2×20 mL)洗滌，無水Na2SO4干燥，減壓濃縮后經硅膠柱層析(洗脫劑：A=8 ∶1)純化得白色固體5 768 mg，收率73.3%，Rf0.50(展開劑：A=1 ∶1), m.p.120.5～121.7 ℃，1H, 4-H), 4.93(dd,J=3.7 Hz, 10.0 Hz, 1H, 2-H), 4.24(ddt,。

(3) 6的合成

(4) 7的合成

(5) 8的合成

(6) 9的合成

(7) Ⅱ的合成

(8) Ⅲ的合成

將9 245 mg(0.59 mmol)加至二氯甲烷/水(V/V=2 ∶1)混合溶劑10 mL中，N2保護下依次加入四甲基哌啶氮氧化物(TEMPO)18.5 mg(0.12 mmol)和碘苯二乙酯(DAIB)475 mg(1.48 mmol)，加畢，劇烈攪拌反應30 min(TLC監測，展開劑：A=1 ∶1， 1滴甲酸)。加入飽和Na2S2O3水溶液2 mL淬滅反應，蒸干，殘余物用乙酸乙酯(20 mL)溶解，依次用少量1 mol·L-1鹽酸洗滌，乙酸乙酯(3×20 mL)萃取，合并有機相，依次用水(2×20 mL)和飽和NaCl溶液(2×20 mL)洗滌，無水Na2SO4干燥，減壓濃縮后真空干燥得黃色油狀液體。

本研究以廉價易得的D-葡萄糖為原料，在無水FeCl3催化下與丙酮反應，以77.8%的收率制得1。采用無水FeCl3作為催化劑的優點在于反應條件較為溫和、適合大量制備、反應時間短、產率較高，并且后處理簡單，水洗即可除去雜質無需硅膠柱層析分離。而文獻方法中經常采用濃硫酸作為催化劑，其用量在放大制備時很難控制，并且在反應結束后中和多余的酸時會劇烈放熱，導致大量副產物生成，必須經硅膠柱層析分離才能得到純凈產物1，因此產率比較低。

參考Qu等[8]報道的方法，將化合物1的3-位羥基經烯丙基化后，在酸性條件下脫除雙異亞丙基縮酮，同時由呋喃糖異構化為吡喃糖制得3。隨后將3在酸酐/乙酸鈉作用下，將裸露的羥基全部乙酰化制得4[8]，四步反應中僅一步反應需要硅膠柱層析分離，總收率61.4%。

為了使葡萄糖受體的端基在糖苷化反應時不被活化，選擇對甲氧基苯基保護1-位羥基，參考文獻[9]方法，以73.3%的收率得到化合物5，脫除三個乙酰基后，再與苯亞甲基二甲縮醛反應，選擇性的保護4,6-位羥基則得到了2-位羥基裸露的化合物7，兩步反應均無需硅膠柱層析分離，直接濃縮或經乙醇重結晶即可得到純凈的產物，且產率均較為理想。在化合物7的2-位引入永久保護基芐基后，再將4,6-位羥基上的苯亞甲基縮醛基脫除得到化合物9，兩步反應總收率為80.9%。選擇性地將9的6-位伯羥基經TBDPS保護后，則首次合成了正交保護的葡萄糖受體Ⅱ；另外將9的6-位伯羥基氧化為羧基后，再經甲酯化，則首次得到了正交保護的葡萄糖醛酸受體Ⅲ。

該路線的優點為反應步驟較少、操作簡單、適合大量制備，并且其2-位羥基的保護基可以根據需求進行變換。例如，當葡萄糖砌塊作為受體時，其2-位羥基可以選用永久保護基Bn保護，有利于減少后續FCS三糖分子硫酸化完成后脫保護基的步驟；當葡萄糖砌塊轉化作為供體時，其2-位羥基選用Bz等有鄰基參與作用的酰基類保護基保護，有利于1,2-trans-β-糖苷鍵的構建。

以D-葡萄糖為起始原料，分別經10和11步反應，分別以28.2%和25.0%的總收率合成了兩個新型葡萄糖受體和葡萄糖醛酸受體。該方法試劑廉價低毒，操作簡便易行，收率高且適合大量制備，為海參硫酸軟骨素寡糖的合成奠定了基礎，也為其它硫酸軟骨素類寡糖的合成提供了參考。

[1] Vieira R P, Mour?o P A. Occurrence of a unique fucose-branched chondroitin sulfate in the body wall of a sea cucumber[J].Journal of Biological Chemistry,1988,263(34):18176-18183.

[2] Pomin V H. Holothurian fucosylated chondroitin sulfate[J].Marine drugs,2014,12(1):232-254.

[3] Mour?o P A S, Boisson-Vidal C, Tapon-Bretaudière J,etal. Inactivation of thrombin by a fucosylated chondroitin sulfate from echinoderm[J].Thrombosis research,2001,102(2):167-176.

[4] Fonseca R J, Santos G R, Mour?o P A. Effects of polysaccharides enriched in 2,4-disulfated fucose units on coagulation,thrombosis and bleeding[J].Thrombosis and Haemostasis,2009,102(5):829-836.

[5] Minamiguchi K, Nagase H, Kitazato K T,etal. Interaction of a new depolymerized holothurian glycosaminoglycan with proteins in Human plasma[J].Thrombosis research,1996,83(3):253-264.

[6] Fonseca R J, Mour?o P A. Fucosylated chondroitin sulfate as a new oral antithrombotic agent[J].Thrombosis and Haemostasis,2006,96(6):822-829.

[7] Tamura J, Tanaka H, Nakamura A,etal. Synthesis ofβ-D-GalNAc(4,6-diS)(1-4)[α-L-Fuc(2,4-diS) (1-3)]-β-D-GlcA,a novel trisaccharide unit of chondroitin sulfate with a fucose branch[J].Tetrahedron Letters,2013,54(30):3940-3943.

[8] Qu H, Sun W, Zhang Y,etal. Synthesis and NMR elucidation of four novel 2-(trimethylsilyl) ethyl glycosides[J].Research on Chemical Intermediates,2014,40(4):1557-1564.

[9] Zong G, Cai X, Liang X,etal. Facile syntheses of the disaccharide repeating unit of theO-antigenic polysaccharide of Burkholderia pseudomallei strain 304b and its dimer and trimer[J].Carbohydrate research,2011,346(16):2533-2539.

Efficient Synthesis of Novel Glucose and Glucuronic Acid Acceptors for Sea Cucumber Chondroitin Sulfate Preparation

SU Kai-qiang, CAI Chao, YU Guang-li, GUAN Hua-shi, LI Chun-xia*

(Key Laboratory of Glycoscience and Glycotechnology of Shandong Province, Key Laboratory of Marine Drugs,Ministry of Education, School of Medicine and Pharmacy, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

p-Methoxyphenyl 2-O-benzyl-3-O-allyl-α-D-glucopyranoside(9) was synthesized from D-glucose by nine step reactions. The primary hydroxyl of 9 was protected by tert-butyldiphenysilyl(TBDPS) to afford the novel orthogonal protected glucose acceptorp-methoxyphenyl 2-O-benzyl-3-O-allyl-6-O-tert-butyldiphenysilyl-α-D-glucopyranoside(Ⅱ) for the first time, in total yield of 28.2%. Oxidation of the primary hydroxyl of 9, followed by esterification with iodine methane, provided the new glucuronic acid acceptor methyl (p-methoxyphenyl 2-O-benzyl-3-O-allyl-α-D-glucopyranoside) uronate(Ⅲ), in total yield of 25.0%. The structures were characterized by1H NMR,13C NMR and HR-MS(ESI).

D-glucose; glucuronic acid; acceptor; synthesis

2016-03-09；

2016-09-06

資助： 國家自然科學基金委員會-山東省人民政府聯合資助海洋科學研究中心項目(U1406402)； 海洋公益性行業科研專項基金資助項目(201405038)； 青島市自主創新重大專項(15-4-13-zdzx-hy)

蘇凱強(1987-)，男，漢族，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事藥物化學的研究。 E-mail： sukaiqiang.luck@163.com

李春霞，教授， Tel. 0532-82032030， E-mail： lchunxia@ouc.edu.cn

O629.11

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.10.16068