食品動(dòng)物源沙門(mén)菌ESBLs和PMQR耐藥基因流行特征分析

付曉平

（廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510430）

食品動(dòng)物源沙門(mén)菌ESBLs和PMQR耐藥基因流行特征分析

付曉平

（廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510430）

本研究對(duì)從豬、鴨和鵝分離的31株沙門(mén)菌進(jìn)行耐藥性分析，調(diào)查ESBLs基因和PMQR基因在沙門(mén)菌的流行分布特征。結(jié)果顯示，31株沙門(mén)菌中只檢測(cè)到CTX-M型ESBLs，3株攜帶b1aCTX-M-14，3株攜b1aCTX-M-27基因；有13株攜帶b1aOXA型均為窄譜b1aOXA-1，6株攜帶b1aTEM型也為窄譜b1aTEM-1b。b1aSHV、b1aPER、b1aVEB、b1aGES等各型β-內(nèi)酰胺酶基因均未檢出。PMQR基因oqxAB和aac（6′）-Ibcr檢出率最高分別為39%和26%。4株鴨源和1株豬源沙門(mén)菌中都檢測(cè)到qnrA基因，而qnrD基因僅在一種豬源沙門(mén)菌中檢出。qnrB、qnrC、qnrS、qepA等基因均未檢出。研究發(fā)現(xiàn)有19株沙門(mén)菌同時(shí)攜帶β-內(nèi)酰胺酶和PMQR，其中一株鴨源沙門(mén)菌同時(shí)攜帶CTX-M-14 ESBLs和CMY-2 AmpC酶；有7株同時(shí)攜帶4-5種β-內(nèi)酰胺酶和PMQR基因。

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）PMQR；沙門(mén)氏菌

1 材料與方法

1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)保存的患病動(dòng)物或送檢動(dòng)物（包括豬、鴨和鵝）直腸拭子中分離鑒定的31株沙門(mén)菌用于調(diào)查ESBLs和PMQR的流行分布。質(zhì)控菌ATCC25922。

1.2 β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR基因的檢測(cè)

首先對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)蘇，然后采用水煮法提取細(xì)菌的總DNA，備用，參考已發(fā)表相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)、合成引物，對(duì)所有菌株采用PCR方法擴(kuò)增基因。陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送北京華大公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提呈NCBI進(jìn)行序列比對(duì)，確認(rèn)基因及確定受試菌株β-內(nèi)酰胺酶基因的亞型。

2 結(jié)果

對(duì)31株臨床分離沙門(mén)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到與陽(yáng)性對(duì)照一致大小的DNA片段（見(jiàn)圖1、2、3、4、5、6和7）。31株臨床分離沙門(mén)菌中，19株檢出攜帶一種或多種β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR耐藥基因，分別有blaCTX-M-9G（6株）、blaOXA（13株）、blaTEM（6株）、blaCMY-2（1株）、qnrA（5株）、qnrD（1株）、aac（6′）-Ib-cr（8株）和oqxAB（12株）。blaCTX-M型只有2種，分別為3株攜帶blaCTX-M—14（鴨3株），3株blaCTX-M—27（鴨2株，豬1株）。blaOXA型和blaTEM型基因各只有一種，都是窄譜的blaOXA-1和blaTEM-1b，本次研究中，blaSHV、blaPER、blaVEB、blaGES等各型β-內(nèi)酰胺酶基因均未檢出。PMQR基因中，aac（6′）-Ib-cr和oqxAB檢出率最高，豬和鴨中都檢出。在4株鴨源和1株豬源沙門(mén)菌中都檢測(cè)到qnrA基因，而qnrD基因僅在一種豬源沙門(mén)菌中檢出。31株沙門(mén)菌都沒(méi)有檢測(cè)到qnrB、qnrC、qnrS、qepA等基因（表1）。19株β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR陽(yáng)性菌株中，其中一株鴨源的同時(shí)攜帶ESBLs和AmpC酶（blaCTX-M-14和blaCMY-2），而2株blaCTX-M-27陽(yáng)性菌同時(shí)攜帶blaOXA-1。同時(shí)攜帶兩種以上PMQR基因沙門(mén)菌有8株。同時(shí)攜帶β-內(nèi)酰胺酶和PMQR基因的菌株有11株，而且攜帶的基因呈多樣性，其中有7株同時(shí)攜帶4-5種β-內(nèi)酰胺酶和PMQR基因。

3 討論

圖1 b1aCTX-M-9G基因的PCR電泳圖M為DL2000 markers，1～6為樣品PCR產(chǎn)物，7為陰性對(duì)照，8為陽(yáng)性對(duì)照

圖2 b1aTEM基因的PCR電泳圖M為DL2000 markers，1～6為樣品PCR產(chǎn)物，7為陰性對(duì)照，8為陽(yáng)性對(duì)照

圖3 b1aOXA基因的PCR電泳圖M為DL2000 markers；1～7為樣品PCR產(chǎn)物；8為陰性對(duì)照；9為陽(yáng)性對(duì)照

圖4 qnrA基因的PCR電泳圖M為DL2000 markers；1～4為樣品PCR產(chǎn)物；5為陰性對(duì)照；6為陽(yáng)性對(duì)照

圖5 aac（6′）-Ib-cr基因的PCR電泳圖M為DL2000 markers，1～6為樣品PCR產(chǎn)物，7為陰性對(duì)照，8為陽(yáng)性對(duì)照

圖6 oqxA基因的PCR電泳圖M為DL2000 markers，1～7為樣品PCR產(chǎn)物，8為陰性對(duì)照，9為陽(yáng)性對(duì)照

圖7 oqxB基因的PCR電泳圖M為DL2000 markers，1～12為樣品PCR產(chǎn)物，8:陰性對(duì)照，9:陽(yáng)性對(duì)照

越來(lái)越多研究表明（引用其他研究結(jié)果），無(wú)論是人還是動(dòng)物分離的革蘭氏陰性菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥主要是產(chǎn)生了ESBLs。產(chǎn)ESBLs細(xì)菌呈世界流行，各個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行特征各不相同。近幾年國(guó)內(nèi)外大量研究報(bào)道了在食品動(dòng)物源細(xì)菌中檢測(cè)到ESBLs，食品動(dòng)物可作為耐藥基因儲(chǔ)存庫(kù)，選取更多的ESBLs成員，最終轉(zhuǎn)移給人類(lèi)，加大了人類(lèi)和動(dòng)物間ESBLs相互轉(zhuǎn)移的擔(dān)憂(yōu)。

本研究對(duì)31株沙門(mén)菌調(diào)查結(jié)果顯示，blaCTX-M型ESBLs只有2種，分別blaCTX-M—14和blaCTX-M—27，都是印第安納血清型，可以看出沙門(mén)菌攜帶ESBLs的數(shù)量和種類(lèi)遠(yuǎn)不如大腸桿菌的復(fù)雜和多。本研究中3株產(chǎn)blaCTX-M-14和2株產(chǎn)blaCTX-M-27沙門(mén)菌都是從鴨分離，而豬源沙門(mén)菌只檢測(cè)到1株產(chǎn)blaCTX-M-27沙門(mén)菌。2009年本實(shí)驗(yàn)室調(diào)查食品動(dòng)物源大腸桿菌的結(jié)果，鴨源產(chǎn)blaCTX-M-14大腸桿菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)豬源大腸桿菌。鴨是水禽，與水環(huán)境接觸密切，而blaCTX-M-14是首次在我國(guó)醫(yī)院分離大腸桿菌和肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)，目前是我國(guó)最流行的blaCTX-M型ESBLs。本研究中僅鴨源沙門(mén)菌檢測(cè)到blaCTX-M-14，可以推測(cè)blaCTX-M-14在我國(guó)動(dòng)物、人、環(huán)境已廣泛流行分布，并通過(guò)水環(huán)境加速其傳播。

本研究從一株鴨源印第安納沙門(mén)菌中檢測(cè)到blaCMY-2，值得注意的是，該菌同時(shí)攜帶blaCTX-M-14。醫(yī)院病人分離的沙門(mén)菌blaCMY-2與其他ESBLs共同存在于一株沙門(mén)菌上，組合方式有blaCMY-7+blaSHV-9+blaOXA-30，blaCMY-2-+blaSHV-2+blaTEM-1，blaCMY-2+blaCTX-M-37+blaTEM-63，blaCMY-2+blaTEM-63，目前還鮮有研究報(bào)道動(dòng)物源沙門(mén)菌blaCMY-2與ESBLs共同存在于一株菌上。有研究報(bào)道，blaCMY-2細(xì)菌的出現(xiàn)于食品動(dòng)物中使用第三代頭孢菌素頭孢噻呋有關(guān)。和ESBLs不同，質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶具有更加廣泛的耐藥譜，其水解底物范圍更廣，耐藥質(zhì)粒往往同時(shí)攜帶氨基糖苷類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、氯霉素、四環(huán)素等抗菌藥耐藥基因，造成嚴(yán)重的多重耐藥性。在本研究blaCMY-2和blaCTX-M-14共同存在于一株印第安納沙門(mén)菌中，使用其他抗生素也可能篩選出blaCTX-M-14陽(yáng)性菌并促進(jìn)其擴(kuò)散傳播，提示在食品動(dòng)物要慎用動(dòng)物專(zhuān)用頭孢噻呋。

本研究首次在沙門(mén)菌中檢測(cè)到oqxAB基因，31株沙門(mén)菌中有12株攜帶OqxAB基因，檢出率為39%。

本研究31株沙門(mén)菌中，有11株菌同時(shí)攜帶β-內(nèi)酰胺酶和PMQR基因的菌株，而且攜帶的基因呈多樣性，其中有7株同時(shí)攜帶4-5種β-內(nèi)酰胺酶和PMQR基因，blaCTX-M-14和blaCTX-M-27分別和三種PMQR基因（qnrA+aac（6'）-Ib-cr+oqxAB_）共同存在一株菌中，對(duì)頭孢噻肟和環(huán)丙沙星都表現(xiàn)高水平耐藥。2005年我國(guó)香港報(bào)道4株對(duì)環(huán)丙沙星和頭孢噻肟耐藥的沙門(mén)菌同時(shí)攜帶qnrA和blaCTX-M-14基因，有幾個(gè)研究都指出ESBLs基因與PMQR基因之間可能存在一定的聯(lián)系。這些同時(shí)檢測(cè)到PMQR和ESBLs相關(guān)基因的菌株不僅對(duì)第三代頭孢菌素高度耐藥，對(duì)氟喹諾酮類(lèi)等抗菌藥物的耐藥性也明顯高于其他菌株，呈現(xiàn)多重耐藥。

［1］ 俞云松. 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶研究進(jìn)展.中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86（9）：641-644.

［2］ Kim BH，Wang，MH，Park CH，et al.OqxAB Encoding a Multidrug Efflux Pump in Human Clinical Isolates of Enterobacteriaceae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2009，53（8）：3582-3584.

［3］ Brinas L，Moreno MA，Teshager T et al. Monitoring and Characterization of Extended-Spectrum β-Lactamases in Escherichia coli Strains from Healthy and Sick Animals in Spain in 2003. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY，2005，47（3）：1262-1264.

［4］ Cavaco LM，Hasman H，Xia S，et al. qnrD，a Novel Gene Conferring Transferable Quinolone Resistance in Salmonella enterica Serovar Kentucky and Bovismorbificans Strains of Human Origin. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY，2009，10（2）：603-608.

［5］ Carattoli A. Animal reservoirs for extended spectrum beta-lactamase producers. Clin Microbiol Infect，2008，14（1）：117-123.

［6］ Dierikx C，van Essen-Zandbergen A，Veldman K，et al. Increased detection of extended spectrum beta-lactamase producing Salmonella enterica and Escherichia coli isolates from poultry. Vet Microbiol，2010，145（3-4）：273-278

［7］ Govinden U，Mocktar C，Moodley P，et al. Geographical evolution of the CTX-M β-lactamase—an update. African J Biotechnol，2007，6（15）：831-839.

［8］ Hansen L H，Johannese E，Burmolle M，et al.Plasmid-encode multidrug efflux pump conferring resisitance to olaquindox in Escherichia coil［J］. Antimicrob AgentsChemother，2004，48（5）：3332-3337.

［9］ Jacoby GA. AmpC β-lactamases［J］. Clin Microbio Rev，2009，22（1）：161-182.

［10］ Terenee KMC，Yiu WC，Man YC，et al.Plasmid-mediated resistanee to ciprofloxacin and ceoftaxime in clinical isolates of Salmonella enterica serotype Enteritidis in HongKong.Jounral of Antinlieorbial ChemothearPy，2005，56（25）：586-589.