犀牛源性成分PCR檢測(cè)方法的建立

邵建宏 趙福振 羅寶正 薄清如 沙才華 廖秀云 徐海聶

(珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局，國家外來病檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，珠海，519015)

犀牛源性成分PCR檢測(cè)方法的建立

邵建宏 趙福振 羅寶正*薄清如 沙才華 廖秀云 徐海聶

(珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局，國家外來病檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，珠海，519015)

犀牛源性成分；

(Zhuhai Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau，State Key Laboratory of Exotic Animal Diseases，Zhuhai，519015，China)

根據(jù)國際上物種分類研究，犀牛歸類于哺乳綱(Mammalia)奇蹄目(Perissodactyla)角型亞目(Ceratomorpha)犀科(Rhinocerotidae)，現(xiàn)存犀牛包括白犀(Ceratotheriumsimum)、黑犀(Dicerosbicornis)、印度犀(Rhinocerosunicornis)、爪哇犀(Rhinocerossondaicus)、蘇門答臘犀(Dicerorhinussumatrensis)5個(gè)物種。在生物學(xué)史上，犀牛曾遍布全球，其物種將近30個(gè)屬[1]。兩千多年來，犀牛被全人類視為珍稀藥用動(dòng)物，尤其是犀牛角，具有解熱、涼血、解痙、解毒、定驚等奇效[2]。在巨大利益的驅(qū)使下，獵殺犀牛、販賣犀牛角等非法行徑在全球范圍內(nèi)廣泛存在，犀牛數(shù)量急劇下降。國際動(dòng)物保護(hù)組織已禁止犀牛角的交易，并將犀牛所有物種列入《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約》附錄。國務(wù)院于1993年發(fā)布的第39號(hào)文件也明確禁止了犀牛角在我國的進(jìn)出境、貿(mào)易、郵寄、攜帶、制藥等行為。但是迄今為止，世界各國對(duì)于檢測(cè)和鑒定犀牛源性樣品的研究卻非常有限。為進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)現(xiàn)存犀科物種的保護(hù)，提高對(duì)非法販賣犀牛角及其制品的打擊力度，提升鑒定真假犀牛角及其制品的效率和準(zhǔn)確性，建立一種更加合適的對(duì)來源于犀牛的可疑樣品的檢測(cè)方法十分必要。

目前國內(nèi)外對(duì)于犀牛源性成分的分子生物檢測(cè)主要是基于線粒體DNA的Cytb和12S RNA基因的研究[3-4]，對(duì)犀牛角、犀牛皮的鑒定常局限于形態(tài)觀察法[5]、顯微鏡觀察比對(duì)法[6]、紫外燈熒光分析法[7]、紅外光譜分析法[8]。上述各種方法均具有一定的代表性，但在某些情況下也存在自身的劣勢(shì)，例如，形態(tài)觀察法過于淺表、局限性大且受到主觀因素和經(jīng)驗(yàn)主義的影響，無法鑒定非原始形狀的樣品和微量樣品；顯微鏡觀察比對(duì)法無法滿足快速和大批量檢測(cè)的需要，同時(shí)對(duì)檢驗(yàn)人員的要求較高，不易標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化；紅外光譜分析法需要特定的參照物，對(duì)成分的判斷和鑒定特異性較差；近年來也有利用DNA條形碼對(duì)動(dòng)物物種進(jìn)行鑒定的技術(shù)[9-10]，這種技術(shù)較為客觀，準(zhǔn)確性較高，但它受到DNA數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有物種種類的限制，也可能由于種內(nèi)最大遺傳距離和種間最小遺傳距離的重疊交叉導(dǎo)致得出錯(cuò)誤的鑒定結(jié)論；而目前關(guān)于犀牛源性成分檢測(cè)的分子生物學(xué)方法，其引物和擴(kuò)增產(chǎn)物均只包含于一種基因區(qū)域，在某些情況下可能較難區(qū)分相近物種。本研究擬建立一種PCR方法用以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)犀牛源性成分。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

犀牛角樣品1份，粉末狀，為本實(shí)驗(yàn)室留存樣品，使用標(biāo)準(zhǔn)方法(ZH2006-1，CNAS認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn))擴(kuò)增測(cè)序確認(rèn)為白犀，用作陽性對(duì)照。

參考動(dòng)物樣品13份，為鮮肉、熟肉、角制品和熟制標(biāo)本，均為本實(shí)驗(yàn)室留存樣品，使用標(biāo)準(zhǔn)方法(ZH2006-1，CNAS認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn))擴(kuò)增并測(cè)序，確認(rèn)為黃牛(Bostaurus)、水牛(Bubalusbubalis)、野牦牛(Bosgrunniens)、斑羚(Naemorhedusgoral)、山羊(Capraaegagrushircus)、綿羊(Ovisaries)、野馬(Equuscaballus)、驢(Equusasinus)、原麝(Moschusmoschiferus)、鹿(Cervidae)、野豬(Susscrofa)、貘(Tapiridae)和虎(Pantheratigris)。參考樣品用于驗(yàn)證方法的特異性。

送檢動(dòng)物樣品5份，為動(dòng)物頭角2份、骨骼1份、皮張2份，檢測(cè)項(xiàng)目為犀牛源性成分。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒：E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit，美國OMEGA公司產(chǎn)品。

PCR反應(yīng)試劑：TianGenTaqPCR Mastermix，中國天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

DNA Marker：DNA Marker DL 2000，日本TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器設(shè)備

PCR儀：Veriti 96-Well Thermal Cycler，美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

凝膠成像分析系統(tǒng)：Alpha Imager HP，美國Alpha Innotech公司產(chǎn)品。

高速冰凍臺(tái)式離心機(jī)：Sigma 3-18 K，德國Sartorius公司產(chǎn)品。

紫外分光光度計(jì)：NanoDrop ND - 1000 Spectrophotometer，美國 NanoDrop Technologies 公司產(chǎn)品。

1.4 DNA提取

使用經(jīng)高溫高壓處理的鑷子和藥匙對(duì)樣品取50 mg置于1.5 mL離心管中，使用DNA提取試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取。

1.5 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成

GenBank中公布的犀科物種線粒體全基因序列共有6個(gè)，分別為白犀(GenBank：Y07726.1)、黑犀(GenBank：FJ905814.1)、印度犀(GenBank：X97336)、爪哇犀(GenBank：FJ905815.1)、蘇門答臘犀(GenBank：FJ905816.1)和披毛犀(Coelodontaantiquitatis，GenBank：Y07726.1)。下載以上6個(gè)線粒體全基因序列，使用分子生物學(xué)軟件DNAMAN8.0進(jìn)行多序列比對(duì)，使用Oligo7.0在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)特異性PCR引物，其中上游引物在ND2基因區(qū)域，下游引物橫跨tRNA-Asn和tRNA-Ala基因區(qū)域。PCR產(chǎn)物橫跨多個(gè)基因的設(shè)計(jì)方法，有利于遺傳相近物種的區(qū)分。同時(shí)，上游引物中加入了兼并堿基，保證不同物種即使有序列差異，在擴(kuò)增過程中效率也不會(huì)下降或者漏檢。為了與鹿科動(dòng)物和馬科動(dòng)物的區(qū)分，設(shè)計(jì)下游引物的時(shí)候，在3′端3個(gè)堿基中設(shè)計(jì)了1個(gè)犀科動(dòng)物的特異性堿基，保證擴(kuò)增的特異性。引物由上海輝睿生物科技有限公司合成，序列見表1。

表1 PCR引物序列

Tab.1 Sequences of primers for PCR

1.6 PCR檢測(cè)方法建立

使用1.5中引物配制PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master mix 12.5 μL、10 μmol/L的F-primer 1.0 μL、10 μmol/L的R-primer 1.0 μL、DNA模版2.0 μL，余補(bǔ)水至總?cè)莘e25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物置于2 %瓊脂糖凝膠中，以110 V電壓進(jìn)行30 min電泳檢測(cè)，電泳結(jié)束后使用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄結(jié)果。

1.7 PCR產(chǎn)物測(cè)序確認(rèn)

將電泳后有目的條帶的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司進(jìn)行測(cè)序，使用NCBI中BLAST功能對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，確定物種來源。

1.8 PCR方法特異性試驗(yàn)

以13份參考動(dòng)物樣品提取的DNA為模板，采用上述方法進(jìn)行PCR檢測(cè)，驗(yàn)證所建立的PCR方法的特異性。

1.9 PCR方法靈敏度試驗(yàn)

將犀牛陽性對(duì)照樣品PCR擴(kuò)增目的條帶送北京六合華大基因科技股份有限公司武漢分公司進(jìn)行TA克隆，并以此重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。將重組質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)換算為目的基因拷貝數(shù)。提取陽性克隆質(zhì)粒并測(cè)定濃度后，按10倍梯度倍比稀釋，對(duì)經(jīng)梯度稀釋后的陽性對(duì)照進(jìn)行PCR檢測(cè)，所能檢出的最低模板拷貝數(shù)為PCR方法的靈敏度。

1.10 樣品檢測(cè)和鑒定

以5份送檢樣品提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，將電泳后有目的條帶的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司進(jìn)行測(cè)序，使用NCBI中的BLAST功能對(duì)序列進(jìn)行檢索比對(duì)，確定樣品物種。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)方法建立

使用設(shè)計(jì)的引物配制PCR反應(yīng)體系，按照反應(yīng)條件對(duì)陽性對(duì)照犀牛的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和凝膠電泳，得到了明顯的電泳條帶，產(chǎn)物大小約360 bp，與預(yù)期基本一致(圖1)。

2.2 特異性試驗(yàn)

特異性試驗(yàn)的比對(duì)物種涵蓋牛科、馬科、鹿科、豬科、獏科和貓科。其中，牛科、鹿科(麝、獐除外)和本研究對(duì)象犀科涵蓋了現(xiàn)存已知的所有有角哺乳動(dòng)物(包括洞角、實(shí)角、叉角羚角、長頸鹿角、表皮角)，馬科、獏科和本研究對(duì)象犀科涵蓋了現(xiàn)存已知的所有奇蹄目動(dòng)物，所選特異性試驗(yàn)的比對(duì)物種具有高度代表性和廣泛性。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，僅犀牛樣品出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增條帶，其他動(dòng)物樣品均未呈現(xiàn)擴(kuò)增條帶(圖2)。

圖1 犀牛樣品PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR Results for sample of rhinoceros 注：M：DNA Marker DL2 000；1：犀牛樣品1；2：犀牛樣品2；N：陰性對(duì)照；B：空白對(duì)照 Note：M：DNA Marker DL2 000；1：sample of rhinoceros 1；2：sample of rhinoceros 2；N：negative control；B：blank control

圖2 PCR方法特異性試驗(yàn)Fig.2 Specificity assay for the PCR assay 注：M：DNA Marker DL2 000；1～14依次為犀牛、黃牛、水牛、牦牛、羚羊、山羊、綿羊、馬、驢、麝、鹿、豬、獏、虎；N：陰性對(duì)照；B：空白對(duì)照 Note：M：DNA Marker DL2 000；1 to 14：the sample of rhinoceros，scalper，buffalo，yak，antelope，goat，sheep，horse，donkey，musk，deer，pig，tapirus and tiger by order；N：negative control；B：blank control

2.3 靈敏度試驗(yàn)

靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示犀牛樣品在100個(gè)拷貝仍呈現(xiàn)較明顯的擴(kuò)增條帶，10 拷貝所呈現(xiàn)的擴(kuò)增條帶微弱，判定該方法靈敏度為100個(gè)拷貝(圖3)。

2.4 樣品檢測(cè)

樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，有2份樣品呈現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，即判定為含有犀牛源性成分，另外3份樣品未呈現(xiàn)擴(kuò)增條帶，則判定為不含有犀牛源性成分(圖4)。檢測(cè)陽性的2份樣品經(jīng)PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果證實(shí)均為白犀。

圖3 PCR方法靈敏度試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity assay for the PCR assay 注：M：DNA Marker DL2 000；1～9依次為109、108、107、106、105、104、103、102、101拷貝；N：陰性對(duì)照；B：空白對(duì)照 Note：M：DNA Marker DL2 000；1 to 9：109，108，107，106，105，104，103，102 and 101 copies of recombinant plasmids by order；N：negative control；B：blank control

圖4 樣品檢測(cè)Fig.4 Sample detection 注：M；DNA Marker DL2 000；1～5：5份待檢測(cè)樣品；P：陽性對(duì)照；N：陰性對(duì)照；B：空白對(duì)照 Note：M：DNA Marker DL2 000；1 to 5：the samples to be tested；P：positive control；N：negative control；B：blank control

3 討論

PCR技術(shù)以其能將微量DNA大幅擴(kuò)增且高特異性、高靈敏度的特點(diǎn)，普遍被應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域的檢測(cè)[11-14]。無論是古生物化石、殘骸，還是若干前遺留的毛發(fā)、皮膚或血液等所有“微量證據(jù)”，只要能夠在DNA完全分解前(DNA半衰期為521 a)對(duì)其進(jìn)行分離提取，結(jié)合所設(shè)計(jì)的特異性引物，通過PCR技術(shù)的應(yīng)用都能對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，并通過后續(xù)的電泳、測(cè)序、比對(duì)流程對(duì)目標(biāo)樣品的成分進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

本研究所建立的方法對(duì)犀牛樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，樣品DNA序列與GenBank中白犀的線粒體序列同源性最高為100 %，準(zhǔn)確性高。從擴(kuò)增條帶判斷，本方法在現(xiàn)存已知的所有有角哺乳動(dòng)物、現(xiàn)存已知的所有奇蹄目動(dòng)物當(dāng)中都具有高度特異性，與其他常見偶蹄動(dòng)物如豬科的豬、野生保護(hù)動(dòng)物如貓科的老虎也能有效進(jìn)行區(qū)分，所能檢出的最低模板為100個(gè)拷貝，具有較高靈敏度。

本方法可用于動(dòng)物、動(dòng)物產(chǎn)品、加工工藝品等物品中犀牛源性成分的檢測(cè)和鑒定，在動(dòng)物保護(hù)、取締各類非法行徑和打擊假冒偽劣產(chǎn)品方面都具有顯著的實(shí)際意義。值得注意的是，我們?cè)谝镌O(shè)計(jì)的時(shí)候，包括了犀科的所有物種，包括已經(jīng)滅絕1萬年的披毛犀。所以在司法鑒定需要的時(shí)候可以進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序，確認(rèn)截獲到該物種再出具相應(yīng)的檢測(cè)報(bào)告。本方法檢測(cè)過程中需要取樣，將會(huì)對(duì)物品本身產(chǎn)生一定破壞，故對(duì)部分名貴物品、觀賞品的取樣過程應(yīng)謹(jǐn)慎操作或應(yīng)進(jìn)一步對(duì)其可能產(chǎn)生的破壞情況做出預(yù)評(píng)估。同時(shí)，由于犀牛樣品的稀缺，本研究未能收集到所有犀科物種的樣品，需要在檢測(cè)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1] 劉元.地球上的犀牛[J].野生動(dòng)物，1997，18(1)：3-5.

[2] 甄權(quán).藥性論[M].安徽：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，2006.

[3] Hsieh H M，Huang L H，Tsai L C，et al.Species identification of rhinoceros horns using the cytochromebgene[J].Forensic Science International，2003，136(1-3)：1-11.

[4] 趙竹，宋云，許瑾，等.基于COI基因?qū)ο枪に嚻氛鎮(zhèn)蔚蔫b別[J].植物檢疫，2013，27(2)：68-71.

[5] 李正勇.偽品犀角的鑒別[J].西北藥學(xué)雜志，1990，5(2)：17-18.

[6] 周晶梅，金煜，胡紅.犀牛角及其制品的快速鑒定方法[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，38(5)：140-141.

[7] 周晶梅.犀牛角及其制品鑒定識(shí)別方法的研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2010：1-41.

[8] 李圣清.犀牛角及其仿制品的研究[D].昆明：昆明理工大學(xué)，2011：1-57.

[9] 彭居俐，王緒楨，何舜平.DNA條形碼技術(shù)的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J].水生生物學(xué)報(bào)，2008，32(6)：916-919.

[10] 杜啟艷，常童杰.DNA條形碼在鑒定物種中的應(yīng)用[J].生物學(xué)教學(xué)，2010，35(12)：60-61.

[11] Ilhak O I，Arslan A.Identification of meat species by polymerase chain reaction(PCR)technique[J].Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences，2007，31(3)：159-163.

[12] Porter J S，Skibinski D O F，Leamon J，et al.Technique for analysis of bryozoan mitochondrial DNA[J].Molecular Ecology Notes，2001，1(1-2)：103-105.

[13] Rensen G J，Smith W L，Jaravata C V，et al.Development and evaluation of a real-time FRET probe based multiplex PCR assay for the detection of prohibited meat and bone meal in cattle feed and feed ingredients[J].Foodbourne Pathogens & Disease，2006，3(4)：337-346.

[14] 周用武.DNA技術(shù)鑒定動(dòng)物物種研究評(píng)述[J].通化師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29(2)：48-51.

Rhinoceros-derived ingredients；

Establishment of PCR Assay for the Detection ofRhinoceros-Derived Ingredients

Shao Jianhong Zhao Fuzhen Luo Baozheng*Bo Qingru Sha Caihua Liao Xiuyun Xu Hainie

To effectively identify rhinoceros-derived ingredients，we designed specific PCR primers using software Oligo 7.0 based on the mitochondrial DNA sequence of rhinoceros.We established PCR assay for the detection of rhinoceros-derived ingredients with newly designed primers.The sample of rhinoceros was amplified using rhinoceros-specific PCR primers，and specific bands were observed after gel electrophoresis.The assay had high specificity and results for all other thirteen samples were negative.This assay method was highly sensitive：the minimum amount of DNA detectable was 100 copies of recombinant plasmid DNA template.Five samples were examined with this assay.Two samples were positive and three were negative，which was consistent with the result of DNA sequencing.The result indicated that this newly established assay can be used for detecting rhinoceros-derived ingredients in samples.

稿件運(yùn)行過程

2016-04-22

修回日期：2016-06-01

發(fā)表日期：2016-11-10

PCR；

檢測(cè)

PCR；

Detecting

Q953+.5

A

2310-1490(2016)04-316-05

為了對(duì)犀牛源性成分進(jìn)行有效鑒定，根據(jù)犀科(Rhinocerotidae)動(dòng)物線粒體DNA(mitochondrial DNA)序列，使用分子生物學(xué)軟件Oligo 7.0設(shè)計(jì)了特異性引物，用來建立PCR檢測(cè)犀牛源性成分的方法。結(jié)果顯示，建立的PCR方法可以對(duì)犀牛陽性樣品進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳呈現(xiàn)特異性條帶。方法特異性好，13份其他物種的樣品均為陰性結(jié)果。方法靈敏度較高，可檢測(cè)到100拷貝重組質(zhì)粒DNA模板。對(duì)5份送檢樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)2份犀牛樣品，與測(cè)序結(jié)果一致。結(jié)果表明，新建立的方法可應(yīng)用于樣品中犀牛源性成分的檢測(cè)。

國家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)2014IK234)資助

邵建宏，男，33歲，學(xué)士，獸醫(yī)師；主要從事動(dòng)物源性成分檢測(cè)方向研究。

*通訊作者：羅寶正，E-mail：bzluo@163.com