Cyr61及MMP-3/TIMP-2在單側輸尿管梗阻大鼠腎組織中的表達①

王淑靜，李春玉，鄒艷紅，聶 磊，韓小唯，王麗敏

(佳木斯大學附屬第一醫院兒科,黑龍江 佳木斯 154003)

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Cyr61及MMP-3/TIMP-2在單側輸尿管梗阻大鼠腎組織中的表達①

王淑靜，李春玉，鄒艷紅，聶 磊，韓小唯，王麗敏

(佳木斯大學附屬第一醫院兒科,黑龍江 佳木斯 154003)

目的：觀察單側輸尿管梗阻大鼠(UUO)腎組織中富含半胱氨酸61(Cyr61)、基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)/金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)的相關性，探討Cyr61在腎間質纖維化過程中的作用。方法：將80只雄性SD幼年大鼠，隨機分為假手術組和模型組，結扎模型組大鼠左側輸尿管并離斷致UUO模型。分別在術后第1、3、7、14天每組每次各處死10只大鼠，取左腎標本，做HE和Masson染色，并用免疫組化SABC法檢測腎組織中Cyr61、MMP-3、TIMP-2的表達。結果：免疫組化的結果顯示在UUO模型大鼠腎組織中Cyr61在腎損傷初期大量表達，同時Cyr61與MMP-3/TIMP-2比值呈正相關(r=0.890,P<0.05)。結論：Cyr61在腎損傷的早期即發揮一定的保護作用，同時這種保護作用在MMP-3/TIMP-2比例的失衡中可能具有重要的調節的作用。

腎間質纖維化；富含半胱氨酸61；基質金屬蛋白酶-3；金屬蛋白酶組織抑制物-2

Cyr61(Cysteine-rich 61，Cyr61/CCN1)作為整合素的配體，是抗纖維化中重要的一個環節[1]。它可以誘導MMPs的表達，抑制TIMPs的生成。國內Cyr61的研究主要集中在肝纖維化、多囊腎、缺血性腎損傷、腎炎以及其對腎小管上皮細胞凋亡的影響[1，3，4]，而檢測其在單側輸尿管梗阻大鼠(unilateral ureteral obstruction,UUO)中的表達及其與MMP—3/TIMP—2相關性的研究尚未見報道，本實驗通過結扎單側輸尿管誘導建立腎間質纖維化的模型，分析Cyr61與MMP-3/TIMP-2比值的相關性，探討Cyr61對腎間質纖維化發展過程的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

80只4周齡清潔級SD雄性幼年大鼠，體重(150±50)g，隨機分為2組，假手術組和模型組各40只，假手術組尋找到左側輸尿管后僅游離處理,不做結扎和離斷，模型組大鼠以10%水合氯醛(0.4mL/100g)腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于手術板，剪毛后常規消毒、鋪巾，在無菌條件下選取左側脊柱旁1.5cm，左肋下1cm處做一縱行切口，依次切開皮膚、皮下組織、鈍性分離肌肉，切開后腹膜，沿左腎下極尋找左輸尿管，用玻璃分針將左輸尿管托起并將其游離，緊貼左腎下極結扎近端輸尿管，結扎輸尿管遠端后從中間離斷；逐層縫合、消毒。分別于術后1、3、7、14d，每組各處死10只幼年大鼠，取左腎標本，用10%中性甲醛充分固定后，石蠟包埋待用。

1.2 主要試劑

兔抗大鼠多克隆抗體Cyr61、MMP-3、TIMP-2，免疫組化試劑盒及DAB顯色盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病理學染色檢查及分析

腎組織經固定、脫水、石蠟包埋后，切成3μm厚度的組織標本，行HE 染色來評估腎小管間質損傷程度，改良 Masson三色法染色觀察腎小管損害及腎間質纖維化。在高倍鏡下(×400)每張標本的皮質部位，隨機切10個不含腎小球的不重疊的視野，按文獻[5]描述的方法進行半定量評分。

1.3.2 腎標本免疫組化染色及分析

采用SABC法，按說明書步驟進行(稀釋一抗比例Cyr61：1：80，MMP-3:1：100，TIMP-2：1:150)。在高倍鏡下(×400)，每張切片隨機選取10個腎小管間質的視野， DAB顯色的陽性區域可出現對比鮮明的棕黃色(均質或者顆粒)為特異性陽性反應。用圖像分析儀對所選取的圖像進行分析，計算各因子陽性表達的累計光密度值(IOD)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠腎小管及間質病理學改變

HE和Masson染色光鏡下檢查可見模型組大鼠術后1d，遠端腎小管無明顯擴張，腎小球結構正常；術后3d，遠端腎小管可見明顯擴張，腎間質可見輕度水腫，間質內可見少量的炎性細胞浸潤，腎間質未見明顯纖維化；術后7d各級腎小管均出現明顯擴張，部分腎小管管腔內可見少許脫落的上皮細胞及蛋白管型，間質增寬中可見增多的炎性細胞及部分間質的纖維化；術后第14天可見近端、遠端腎小管及集合管成囊狀擴張，腎小管結構嚴重破壞，腎間質中大量炎性細胞浸潤及間質的纖維化。見圖1。

圖1 模型組與假手術組同一時間點腎小管間質損害程度

*P<0.05；表示模型組內各時間點腎小管間質損害程度相比，﹟P<0.05。

2.2 實驗大鼠腎間質中Cyr61陽性的表達

光鏡下，Cyr61在假手術組腎小管上皮細胞少量表達，在腎小球無表達。模型組術后1d腎小管間質中Cyr61表達明顯增加，主要集中在近曲腎小管中。術后第7天Cyr61的表達明顯減少，陽性表達較術后3d及術后1d明顯減少，其差異具有統計學意義(P<0.05)；術后14d，Cyr61在腎小管間質中呈現低表達(P<0.05)。見圖2 。

圖2 各組大鼠腎組織中Cyr61、MMP-3、TIMP-2的表達

*P<0.05；表示模型組內各時間點相比，﹟P<0.05。

2.3 各時間點實驗大鼠MMP-3、TIMP-2陽性的表達

光鏡下，假手術組MMP-3在遠端腎小管上皮細胞的胞漿中及腎小球上皮細胞可見少量的表達。模型組在術后第1天可見到MMP-3的表達明顯增多，術后7天，MMP-3的表達到高峰后逐漸降低。TIMP-2在假手術組腎小管上皮細胞中可見少量的表達，模型組主要表達在腎小管、集合管的上皮細胞、腎間質細胞中，腎小球可見少量表達，其表達隨梗阻時間的延長表達呈現增長趨勢。見圖2。

2.4 腎小管的損傷程度、Cyr61與MMP-3/TIMP-2比值相關性的分析

觀察各時間點腎小管間質的損害程度與Cyr61的表達發現，二者之間呈負相關(r=-0.737，P<0.05)，即隨著腎小管損害程度的增加，Cyr61的表達逐漸降低;而Cyr61的表達與MMP-3/TIMP-2比值之間呈正相關(r=0.890,P<0.05)。見圖3。

圖3 相關分析散點圖

3 討論

大量的研究證實：腎小管間質損害的程度與腎功能的下降密切相關，其損害的嚴重程度也是判斷各種腎臟疾病預后的重要指標。早期判斷腎小管損害程度并盡早的進行干預治療，對腎臟病患兒的康復起著決定性的意義。

有研究表明，在腎缺血損害后3～6 h近端腎小管直部即可迅速誘導Cyr61的表達[6]。本實驗發現，在梗阻損害發生后，模型組大鼠腎組織中Cyr61首先在近端腎小管曲部大量表達，隨梗阻時間的延長，在遠端腎小管、集合管均有表達。實驗中，我們觀察到各時間點中Cyr61的表達與腎小管及間質的損害程度呈負相關，近曲小管是物質重吸收和利用的部位，也是藥物損傷的部位，這表明Cyr61作為一種即刻蛋白，可能在腎損傷的早期發揮一定的負向調節作用，這與前人的研究一致[7]，同時這種負向調節作用可能也持續存在于梗阻所致的腎纖維化過程中。

腎纖維化的特點是ECM成分的過多積累和沉淀[8]。MMPs及其組織抑制因子TIMPs是調節ECM 動態平衡的最重要的酶系之一，其活性的變化及比例的失衡是最終導致腎臟纖維化發生的主要機制。趙麗君等人在2013年的研究中顯示大鼠單側輸尿管梗阻后出現的腎間質纖維化病理損害和與 MMP-3/TIMP-2 的表達失衡有關[9]。本實驗通過免疫組化的方法，觀察MMP-3、TIMP-2在單側輸尿管梗阻大鼠腎組織中的表達與趙麗君等人的研究相符，但本研究發現MMP-3的表達在梗阻后的7天就出現了下降，在梗阻后14天則出現了明顯的下降。其原因主要考慮為：①所取樣本量不同；②標本部位存在差異；③觀察陽性表達的選取的時間點存在差異。

LI-GANG JIE等人在類風濕關節炎滑膜細胞的增殖與侵襲試驗中觀察到Cyr61可以顯著上調MMP-3的表達[10]。在我們的研究中同樣也觀察到MMP-3的增高，同時我們的實驗還發現，隨著梗阻時間的延長，Cyr61的表達同MMP-3/TIMP-2的比值存在著正相關，這表明Cyr61可能也通過調控MMP-3/TIMP-2的平衡，在腎纖維化的過程中發揮重要作用。研究中我們還發現，各時間點假手術組中MMP-3/TIMP-2的比值幾乎無差異，而模型組中，隨著梗阻時間的延長其比值出現下降，這個比值是否可以作為判斷腎小管損害程度及判斷預后的標準，在阻斷腎間質纖維化的發展過程中，為臨床預防和阻斷腎間質纖維化發生、發展提供一個新的治療環節，未來我們需要更大量的實驗數據進一步的研究驗證。

[1]張承彥.CCN家族在纖維化中的研究進展[J].基礎醫學與臨床，2014,34(3)：410-413

[3]田壽福，王筱霞，汪年松.CCN1與腎臟疾病的研究進展[J].中國中西醫結合腎病雜志，2011,12(9)：831-833

[4]徐巖，國敏，董暉，等.富含胱氨酸蛋白61對缺氧狀態下腎小管上皮細胞的保護作用[J].中華腎臟病雜志，2015，31(6):451-455

[5]李麗，王長山，李懷荊，等.黃茂當歸合劑對梗阻性腎病大鼠E-cadherin和a-SMA表達的影響[J].黑龍江醫藥科學，2015，38(6)：4-8

[6]李榮山.急性腎損傷的生物標志物[J].中華腎病研究雜志，2013,2 (3)：134-137

[7]Chun-Fu Lai,Shuei-Liong Lin,Wen-Chih Chiang,et al.Blockade of cysteine-rich protein 61 attenuates renal inflammation and fibrosis after ischemic kidney injury[J].Am J Physiol Renal Physiol,2014,11(307):581-592

[8]劉中柱，潘明陽，劉艷妹，等.厄貝沙坦對單側輸尿管梗阻人鼠腎間質纖維化干預作用[J].黑龍江醫藥科學，2014，37 (2) :50-51

[9]趙麗君，崔建軍，李秀花.MMP-3和TIMP-2在UUO大鼠腎間質的表達[J].中國中西醫結合腎病雜志，2013，14(3):212-214

[10]LI-Gang jie,RUN-Yue huang，WEI-Feng sun,et al.Role of cysteine-rich angiogenic inducer 61 in fibroblast-like synovial cell proliferation and invasion in rheumatoid arthritis[J].Molecular Medicine Reports,2015,11:917-923

佳木斯大學研究生科技創新項目，編號：LM2015_021。

王淑靜(1988～)女， 河南濮陽人，在讀碩士研究生。

王麗敏(1964～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，教授，碩士研究生導師。E-mail:wanglimin6518@163.com。

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