二十五味珊瑚丸的微生物限度檢查方法驗證

王 瑋 古桑德吉 德吉卓嘎

西藏自治區食品藥品檢驗所藥理室，西藏 拉薩 850000

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二十五味珊瑚丸的微生物限度檢查方法驗證

王 瑋 古桑德吉 德吉卓嘎

西藏自治區食品藥品檢驗所藥理室，西藏 拉薩 850000

目的：建立二十五味珊瑚丸微生物檢查方法。 方法：分別采用傾注法和薄膜過濾法對4種陽性菌株進行回收率實驗。結果：二十五味珊瑚丸有較強的抑菌作用，采用薄膜過濾法才能徹底消除其抑菌作用，3種菌株回收率均能達到50%。結論：采用薄膜過濾法測定二十五味珊瑚丸中的需氧菌，霉菌和酵母菌可按傾注法測定，控制菌可按常規法測定。

二十五味珊瑚丸；傾注法；薄膜過濾法

藏藥二十五味珊瑚丸(藏藥名：球瑪爾尼阿日布)由公元18世紀著名藏醫藥學家帝瑪爾·丹增彭措研制，轉載于公元19世紀藏醫藥學家迷旁·朗杰加措編撰的《集藥利樂庫》，該書記載了二十五味珊瑚丸的配方及功能主治，并沿用至今[1]，現收載于1995年版中華人民共和國衛生部藥品標準(藏藥第1冊)中。該藏藥由珊瑚、珍珠、訶子、木香、青金石、麝香、紅花等25味藏藥材組成的復方制劑，具有開竅、通絡、止痛等功效。用于“白脈病”神志不清、身體麻木、頭昏目眩、腦部疼痛、血壓不調、頭痛、癲癇及各種神經性疼痛。此標準中沒有規定具體的微生物限度檢查方法，為確保微生物檢查方法的科學性和結果的準確性，研究按照《中國藥典》2015年版第四部的規定對其微生物限度檢查進行方法驗證試驗。

1儀器與材料

1.1 樣品 二十五味珊瑚丸(A企業，批號141104;B企業，批號20150506；C企業，批號20150407；D企業，批號150401)。

1.2 試驗用培養基 胰酪大豆胨液體培養基(TSB，批號：151228)、胰酪大豆胨瓊脂培養基(TSA，批號：151230)、沙氏葡萄糖液體培養基(批號：151219)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(批號：151219)、RV沙門菌增菌液體培養基(批號：150916)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基(批號：151210)、麥康凱液體培養基(批號：151204)、麥康凱瓊脂培養基(批號：141016)均為北京陸橋技術股份有限公司產品。 1.3 試驗菌株 大腸埃希菌(CMCC(B)44 102)、金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26 003)、枯草芽孢桿菌(CMCC(B)63 501)、白色念珠菌(CMCC(F)98 001)、乙型副傷寒沙門菌(CMCC(B)50 094)均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.4 儀器 BPG-9200BH型高溫鼓風干燥箱(上海-恒科技有限公司)；SPX-250B型生化培養箱(上海躍進醫療器械廠)；PYX-PHS-60×75-BS-Ⅱ型隔水式電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠)；1300系列Ⅱ級A2型生物安全柜(美國熱電公司)；HTV-200型集菌儀(杭州泰林醫療器械廠)；2H-2型自動漩渦混合器(天津藥典標準儀器廠)；PL202-S電子天平(梅特勒-托多儀器(上海)有限公司)；YXQ-LS-50S11型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備 按照《中華人民共和國藥典》(2015版)四部非無菌產品微生物限度檢查[2]。2.1.1 菌液制備 接種大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門菌和金黃色葡萄球新鮮培養物至胰酪大豆胨瓊脂培養液中，30～35℃培養36h；接種白色念珠菌的新鮮培養物至沙氏葡萄糖液體培養基中，23～28℃培養36h。乙型副傷寒沙門菌為控制菌檢查用菌，不用于菌株回收率測定。

2.1.2 供試液制備 稱取樣品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，制成1∶10供試液；吸取1∶10供試液1mL，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至10mL，制成1∶100供試液。

2.1.3 試驗組 取上述制備好的供試液，加入制備好的菌液，混勻，分別制成每1mL含菌數為10～100CFU的試驗菌液。

2.1.4 供試液對照組 取“2.1.2”制備好的供試液，以稀釋液代替菌液其他同試驗組。

2.1.5 菌液對照組 取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗組操作加入菌液來進行微生物回收試驗。

2.2 傾注法

2.2.1 試驗組 取1∶10試驗菌液1mL注入平皿中，含白色念珠球菌組傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基15～20mL，除含白色念珠球菌組外傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基15～20mL，待凝固后，含白色念珠菌組置于25～28℃培養5d，除白色念珠菌組外置于30～35℃培養72h，觀察結果測定菌落數，每組實驗菌株平行制作2個平皿。

2.2.2 供試品對照組 取“2.1.4”試液1mL注入平皿中，按傾注法測定供試品本底菌數。

2.2.3 菌液對照組 取“2.1.5”試液1mL注入平皿中，其他同試驗組。

2.2.4 稀釋劑對照組 取稀釋液1mL注入平皿中，其他同試驗組。

2.2.5 結果 經試驗，表1中選取的4個廠家樣品均對白色念珠球菌無明顯抑制作用，回收率在50%以上，采用傾注法即可滿足對樣品中霉菌及酵母菌的檢查。樣品對大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌無明顯抑制作用，回收率在50%以上，但對枯草芽孢桿菌有明顯抑制作用，回收率大部分在50%以下。表2采用1∶100供試液測定了菌株的回收率，回收率大部分在50%以下。結果表明采用傾注法可能無法滿足對樣品中需氧菌的檢查，故接下來采用薄膜過濾法法對谷草芽孢桿菌回收率進行測定。表3為稀釋劑試驗用菌回收率。

表1 傾注法測定各實驗菌株的回收率 (%)

表2 傾注法測定實驗菌株的回收率 (%)

表3 稀釋液對照組實驗菌株的回收率 (%)

2.3 薄膜過濾法

2.3.1 試驗組 取1∶10試驗菌液2mL注入薄膜過濾器中，用100mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，使分散均勻，全量過濾，再以pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100mL沖洗4次，全量濾過，轉帖至胰酪大豆胨瓊脂培養基上。由表1中看出樣品對于枯草芽孢桿菌的抑制作用比較強，先進行枯草芽孢桿菌回收率的測定。

2.3.2 供試品對照組 取“2.1.4”制備的試液2mL加入薄膜過濾器中，不加試驗菌液，其它同試品驗組。

2.3.3 菌液對照組 取“2.1.5”制備的試驗液2mL加入薄膜過濾其中，用100mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，使分散均勻，全量過濾，轉帖至胰酪大豆胨瓊脂培養基上。

2.3.4 稀釋劑對照組 取稀釋液2mL薄膜過濾器中，用100mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，使分散均勻，全量過濾，轉帖至胰酪大豆胨瓊脂培養基上。

2.3.5 結果 表4中，1∶10供試液任對試驗菌有一定的抑制作用。表5為稀釋液對照組實驗菌株的回收率。表6中，用同樣薄膜過濾法法取1∶100供試液測定了菌株的回收率，結果表明，各試驗菌株回收率均大于50%，故采用1∶100供試品溶液進行薄膜過濾法，適用于二十五味珊瑚丸的細菌的微生物限度測定試驗。

表4 薄膜過濾法測定實驗菌株的回收率 (%)

表5 稀釋液對照組實驗菌株的回收率 (%)

表6 薄膜過濾法測定各實驗菌株的回收率 (%)

2.4 控制菌檢查法的驗證 本品為含藥材原粉的固體口服藥，因此以大腸埃希菌和沙門菌為控制菌進行驗證。

2.4.1 試驗組 取1∶10供試液10mL及大腸埃希試驗菌液1mL加入100mL胰酪大豆胨液體培養基中；直接稱取供試品10g及乙型副傷寒沙門菌液1mL加入200mL胰酪大豆胨瓊脂培養液中，依相應控制菌檢查法進行檢查。試驗菌液溶度均在10～100CFU。

2.4.2 供試品對照組 其他同供試品組但不加入試驗菌液。

2.4.3 稀釋劑對照組 取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液1mL加入10mL胰酪大豆胨液體培養基中。

2.4.4 結果 采用常規控制菌檢查法，均能檢出試驗菌，表明此法可適用于二十五珊瑚丸的控制菌檢查。結果見表7。

表7 控制菌驗證結果

3 討論

二十五味珊瑚丸是含有多種成分的復合制劑，通過傾注法不難發現二十五味珊瑚丸是一種抑菌作用較強的藥品，在本次驗證過程中首先考慮增加稀釋液和薄膜過濾法聯用來去除藥品中的抗菌活性。薄膜過濾法能很好的把外界影響和操作者的主觀因素減少到最低，所以該方法更為客觀，能夠全面反映藥品的染菌情況[3]。

由于西藏自然環境特殊，海拔高，含氧量僅為平原地區的60%左右，在制備金黃色葡萄球菌和其他試驗用菌時，需將培養時間由《中國藥典》2015年版第四部中規定的18～24h延長至36h，才能良好生長,故將試驗用菌培養時間延長至36h。

[1] 杜文兵，黃福開，羅遠帶，等. 二十五味珊瑚丸藥理及臨床研究進展[J].世界中西醫結合雜志，2013，8(5)：537-540.

[2]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(四部)[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：1105-1106.

[3]王亞婷. 薄膜過濾法在藥品微生物限度檢查中的應用[J].河北化工，2013，36(4)：8-9.

(編輯：程鵬飛)

Validation Method for Microbial Limit of Ershiwuwei Shanhu Wan

WANG wei GU Sangdeji DEJi zhuoga

Pharmacological Room,Tibet Institute for Food and Drug Control,Lhasa 850000,China

Objective Set up Ershiwuwei shanhu wan microbiological examination method. Methods Pouring method and membrane filtration method were used respectively for four kind of positive strain rate experiments. Result Ershiwuwei shanhu wan strong bacteriostasis, finally USES the membrane filtration method can eliminate the bacteriostatic action, Three strains of recovery rate can reach 50%.Conclusion Using the membrane filter method for determination of aerobe in Ershiwuwei shanhu wan,Mold and yeast can press pour method,Control bacteria can according to the conventional method.

Ershiwuwei Shanhu Wan;Pour Method;Membrane Filtration Method

2016-07-21

王瑋(1985-)，女，漢族，本科，研究方向為藥品微生物限度。E-mail:67597683@qq.com

R284

A

1007-8517(2016)20-0027-03