pH示差法測定不同品系元寶楓葉片花青苷含量

杜曉茜+豐震+楊麗娟+許超+喬謙+任紅劍+安凱

摘 要：采集秋季轉色后的元寶楓無性系葉片作為試驗材料，采用pH示差法測定其不同品系葉片中花青苷的含量。結果顯示：用恒溫震蕩培養箱25 ℃震蕩提取6 h提取效果最好；pH示差法選定pH 值是1.0和4.5，提取液的平衡時間是60 min。試驗的平均回收率是96.66%，由此可見，該方法能有效消除溶液中雜質對測定結果的影響，可用于元寶楓花青苷的定量分析。在所測量的5個品系中，花青苷含量最高的品系是1-7號，含量為0.845 3 mg·g-1，5個品系的平均花青苷含量是0.482 1 mg·g-1。

關鍵詞：元寶楓；pH示差法；花青苷

中圖分類號：Q946.83+6 文件標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.008

Abstract： In this study， the leaves of Acer truncatum Bunge were studied， and their total anthocyanin contents in different strains were investigated by pH-differential method. The results showed that using constant temperature oscillation incubator 25 ℃ oscillation extraction 6 hours it presented the best effect， and the pH selected were 1.0 and 4.0， and the buffering time was 60 minutes. By this method， the average recovery rate was 96.66%，therefore， this method can be used to the quantitative analysis of anthocyanins in Acer， and pH-differential method could eliminated the influence of impurities. Among the five strains，the content of anthocyanin in 1-7 was the highest ，which was 0.845 3 mg·g-1； the average anthocyanin content of these five strains was 0.482 1 mg·g-1.

Key words： Acer truncatum Bunge； pH-differential method； anthocyanin

元寶楓（Acer truncatum Bunge），槭樹科（Aceraceae）槭屬（Acer.L），是北方優良的園林綠化樹種。秋季元寶楓葉色轉為黃色、橙色或鮮紅色，花青苷含量非常豐富[1]。本試驗通過測定不同色系元寶楓葉片中花青苷含量，探討葉色與花青苷含量的關系，為高含量花青苷品系的開發利用奠定理論基礎。

花青苷廣泛存在于大多數彩色植物體內，是水溶性類黃酮物質的一種，同時也是一種天然的食用色素，具有很多優點，如水溶性好、食用安全等，目前已普遍被消費者所接受。此外，在健康養生方面花青苷也起到不可忽視的作用：能緩解視覺疲勞、增強記憶力，同時還能清除體內過多的自由基[2]，可以改善血液循環、預防心血管疾病、抗癌防癌[3]。元寶楓秋色葉中花青苷含量相當豐富，葉片中花青苷的開發利用價值潛力無限。

通過查閱文獻發現花青苷的測定一般有3種方法：高效液相色譜法、單一pH法和pH示差法。高效液相色譜法具備高效、樣品不被破壞、靈敏度高、分析速度快、易回收等優點，且方法精密度高、重復性好，但在不明確樣品中的花青苷單體組成時，該方法的使用受到限制；單一pH法雖操作簡單，但靈敏度低； pH示差法不僅操作方法簡便、設備儀器價格低廉、便于推廣，而且準確度較高、重現性好[4]。所以，本試驗用pH示差法測定新選育品系花青苷含量差異，以篩選出高含量品系，發掘高含量品系在食品及保健品方面的應用潛力，為元寶楓新品系的育種推廣提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

試驗材料：本試驗所用材料取自山東農業大學南校區試驗田，均為嫁接繁殖的元寶楓無性系。共5個品系：1-1、1-6、1-7、6-1、6-2，前3個為秋季紅色葉品系，后2個為秋季黃色葉品系。于2015年11月至12月期間葉片轉色后采集葉片并進行試驗。

試驗儀器：UV-1600 型紫外-可見分光光度計（ 尤尼科儀器有限公司） 、電子分析天平（ 上海越平科學儀器有限公司） 、PHSJ-4A 型酸度計（ 上海雷磁創益儀器儀表有限公司） 、RE52CS-1 型旋轉蒸發器 （ 上海亞榮生化儀器廠）、HZ-8211K型恒溫震蕩箱。

1.2 試驗試劑

1.2.1 試驗試劑 無水乙醇、濃鹽酸、檸檬酸、檸檬酸鈉（天津市凱通化學試劑有限公司） 等。以上試劑均為分析純。

1.2.2 試劑的配制 1%鹽酸乙醇：濃鹽酸與無水乙醇體積比1∶99配制。1.2 mol·L-1鹽酸-70%乙醇溶液：濃鹽酸、無水乙醇與去離子水體積比是1∶7∶2。pH計緩沖液：pH計自帶的pH值為4.0和6.86的緩沖劑粉配制。

1.3 元寶楓花青苷含量的定性分析

1.3.1 最佳浸提溫度的選擇 稱取1 g植物材料迅速放入研缽中，液氮研磨成粉狀，溶于50 mL 1%鹽酸乙醇溶液中，放于4 ℃冰箱靜置過夜。另外，稱取5份1 g植物材料研磨成粉后，然后放入裝有1%鹽酸乙醇溶液50 mL的錐形瓶中，至于 160 r·min-1震蕩培養箱中避光震蕩提取6 h，震蕩溫度分別設置成15，25，35，45，55 ℃[5]。浸提完成后過濾，殘渣于530 nm處分別測定吸光度，確定最佳浸提溫度。

1.3.2 pH值的選擇 pH示差法pH值的確定：將上述浸提液10倍稀釋后，用檸檬酸或檸檬酸鈉調節其pH值構建pH梯度[6]，以pH值為橫坐標繪制pH值-OD值曲線，確定測量最佳pH值及pH示差法的最適pH值。要求所選定的兩個pH 值在其左右變動時OD值變化不大。

1.3.3 浸提液平衡時間的確定 在選定的最合適浸提溫度下浸提后，對浸提液進行稀釋，然后在選定的兩個pH值條件下每隔10 min測1次提取液的吸光度，記錄OD值隨時間的變化。

1.3.4 回收率的計算 通過加入回收法測定本試驗回收率和相對標準偏差。

1.3.5 不同品系花青苷含量的測定 將浸提液靜置至反應平衡后，在已測得的最佳 pH 值下，測量花青苷的OD值，平行測定6 次，算出花青苷含量。

花青苷含量計算公式：花青苷含量（mg·g-1） = ΔDVFM × 1 000 /（εm）[7]

式中：ΔD為 pH 值為1.0，4.5 時吸光度的差值； V為稀釋體積（單位，L）； F為稀釋倍數； M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質量449.2 g·mol-1；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數26 900 L·（mol·cm） -1；m為樣品質量（單位，g）。

2 結果與分析

2.1 最佳浸提溫度

相關研究表明，溫度對花青苷的穩定性有顯著影響。當溫度升高到60 ℃時，浸提液中的絕大多數的花青苷會變成查爾酮式結構[8-9]，而浸提液的顏色也幾近無色。所以，本試驗以溫度為變量設置溫度梯度，以溫度為橫坐標繪制溫度-OD值柱形圖，通過OD值的測定來確定最佳浸提溫度，結果如圖1示。在溫度為25 ℃時，浸提液的OD值最高；且通過對比發現當溫度為15，25，35，45 ℃時浸提液的OD值相差不大，即浸提溫度在15～45 ℃之間浮動時對花青苷浸提效果的影響較小；當溫度為5 ℃時，浸提液的OD值相對較小，可見溫度太低時，葉片中的花青苷會浸提不完全；在浸提溫度為55 ℃時浸提液的OD值開始下降，即高溫造成了花青苷結構的轉變。綜上所述，25 ℃為花青苷浸提的最佳溫度。

2.2 pH值的選擇

花青苷是極性化合物，易溶于水等非極性有機溶劑，在pH值不同的溶劑中由于分子結構的不同會呈現不同的顏色。在pH值小于或等于3的酸性條件下可以穩定存在，其顏色也隨pH值的變化而變化，pH<7時為穩定存在的紅色，pH>7時不能穩定存在[10]，所以，本試驗在酸性介質中測定。以pH值為變量繪制的pH值-OD值曲線如圖2所示。由此圖可以得出：在pH值等于1的時候，花青苷含量最高即在pH值等于1時花青苷最穩定；且pH值在0.5～1.5、4.0～5.0之間變動時OD值上下變動幅度不大，花青苷存在相對穩定，符合pH示差法的試驗要求。可以得出結論：本試驗中示差法選定的pH值為1.0，4.5。

2.3 浸提液平衡時間

花青苷在不同pH 值的溶液中存在狀態不一樣[11]，在加入不同pH值的緩沖液后，必須靜置一段時間，使溶液達到動態平衡后，再進行吸光度的測定。通過對浸提液稀釋后吸光度的測定，結果見表1。結果表明，樣品稀釋60 min后OD值不再變化，因此，本試驗選擇的平衡時間為60 min。

2.4 回收率計算

將浸提液10倍稀釋后取兩份等體積的溶液（標號A、B）放入干燥器內50 ℃以下干燥。材料A完全干燥后一份加入之前一樣體積的浸提液；另一份加入等體積的1.2 mol·L-1鹽酸-70%乙醇溶液，測得量為加標量；將材料A測得的花青苷含量減去原花青苷浸提液中的含量計為實際測得量，重復測定3次。測定結果如表2所示。結果表明：樣品最高回收率是97.14%，最低回收率是96.39%，平均回收率為96.66%，相對標準偏差是0.42%；回收率和標準偏差均符合試驗要求，所以用本方法測定花青苷含量準確可靠。

2.5 不同無性系花青苷含量的測定

通過pH示差法測得的元寶楓各個品系的花青苷含量如表3所示。可以看出：花青苷含量最高的是1-7，含量為0.845 3 mg·g-1；花青苷含量最低的是6-1，含量為0.134 8 mg·g-1；5個品系的平均花青苷含量是0.482 1 mg·g-1。紅色品系（1-1、1-6、1-7）花青苷平均含量是0.766 4 mg·g-1，黃色品系（6-1、6-2）的花青苷平均含量是0.194 8 mg·g-1，紅色品系中花青苷平均含量是黃色品系平均含量的4倍。由此可知：本試驗田所培育的無性系元寶楓葉片中花青苷的含量非常豐富，尤其是紅色品系中的1-7號，高含量的花青苷使其在花青苷的提取應用方面起到不容忽視的作用，如加工成食品及保健產品。同時，高含量的花青苷使其葉色更鮮紅，在秋季表現出優良的觀賞特性，在同類型的秋季觀葉樹種中更具有園林應用的優勢[12-14]。

3 結論與討論

本試驗從山東農業大學南校區試驗田選擇了5個不同品系的元寶楓，3個紅色品系，2個黃色品系，通過pH示差法對其花青苷含量進行測定比較，同時對其浸提條件也進行了比較優化。試驗結果顯示：浸提溫度和pH值對花青苷含量的測定有很大的影響，在溫度為25 ℃和pH值為1的條件下浸提效果最佳；花青苷含量最高的是無性系1-7號，含量為0.845 3 mg·g-1；5個品系的平均花青苷含量是0.482 1 mg·g-1，紅色品系（1-1、1-6、1-7）花青苷平均含量是0.766 4 mg·g-1，黃色品系（6-1、6-2）的花青苷平均含量是0.194 8 mg·g-1，紅色品系中花青苷平均含量是黃色品系平均含量的4倍。因此，高含量的花青苷使本試驗田中的紅色品系在提取色素和秋季葉顯色方面都有很強的優勢。

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