鞘內注射LY294002對保留性脊神經損傷大鼠脊髓中PI3K和pERK信號的影響

劉榮國， 米立梅， 徐雪汝， 方向宇， 林星武

?

鞘內注射LY294002對保留性脊神經損傷大鼠脊髓中PI3K和pERK信號的影響

劉榮國， 米立梅， 徐雪汝， 方向宇， 林星武

目的觀察保留性脊神經損傷(SNI)大鼠鞘內注射LY294002能否通過抑制脊髓中磷脂酰肌醇-3-激酶PI3K，進而影響pERK信號而緩解神經病理性疼痛。方法24只雄性SD大鼠隨機分為4組，即假手術(Sham)組、SNI組、SNI+二甲基亞砜(DMSO)組及SNI+LY294002(PI3K抑制劑)組，每組6只，其中SNI+LY294002組和SNI+DMSO組分別于SNI后第5天經鞘內注射LY294002和等體積DMSO，每天1次，直到SNI后第14天。SNI前和SNI后1，3，5，7，10，14 d，測定大鼠機械刺激縮足反應閾值(PWMT)和熱輻射刺激縮足反應潛伏期(PWTL)。SNI后第14天，大鼠麻醉后取腰段脊髓行Western-blot檢測PI3K和pERK的表達。結果與Sham組比較，SNI后各時點SNI組大鼠的PWMT和PWTL均下降，脊髓中PI3K和pERK表達則顯著增強(P<0.05)。與SNI組和SNI+DMSO組比較，SNI后各時點SNI+LY294002組大鼠的PWMT和PWTL均顯著增高(P<0.05)，PI3K和pERK的表達則下降(P<0.05)。結論經鞘內注射LY294002可抑制脊髓中PI3K，進而影響pERK信號而緩解SNI大鼠神經病理性疼痛。

神經病理性疼痛； 1-磷脂酰肌醇3-激酶； 細胞外信號調節MAP激酶類

國際疼痛研究學會把由于軀體感覺系統損傷或疾病所引起的疼痛定義為神經病理性疼痛[1]。一系列外周神經的損傷，包括糖尿病、艾滋病、帶狀皰疹等均可導致神經病理性疼痛的發生[2]。然而其發生機制尚未完全闡明，可能與初級感覺神經元興奮性異常增強有關，但其臨床療效欠佳。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)是一種與細胞內信號傳導有關的脂類第二信使，并參與病理性疼痛過程，有可能是病理性疼痛的治療靶點之一[3]。研究發現，采用脊神經結扎(spinal nerve liagation, SNL)模型，于SNL術前經鞘內給予LY294002(PI3K抑制劑)可以減緩疼痛形成[4]。但臨床上神經病理性疼痛的發生具有不可預測性，提前給予治療用藥不符合倫理和臨床實際。當神經病理性疼痛發生后，才能切合實際地使患者接受相關的藥物和技術治療。SNL和保留性脊神經損傷模型(spared nerve injury, SNI)同屬常見的神經病理性疼痛模型，SNI后經鞘內注射LY294002能否同樣緩解神經病理性疼痛的敏化形成，有待研究。已知神經損傷后可促發小膠質細胞中pERK的活化，而PI3K產生的第二信使可激活pERK[5-6]。本研究擬探討鞘內注射LY294002能否通過抑制SNI大鼠脊髓中的PI3K和pERK信號通路發揮鎮痛作用，為未來臨床應用PI3K抑制劑治療神經病理性疼痛提供實驗支持依據。

1　材料與方法

1.1動物及分組24只成年雄性健康SD大鼠，SPF級[福建省醫學科學研究院，許可證號：SYXK(閩)2011-0002]，體質量250～280 g，采用隨機數字表法分為4組(n=6)：假手術組(Sham)、SNI組、SNI+二甲基亞砜(DMSO)組及SNI+LY294002組。飼養環境為：室溫22～24 ℃，相對濕度50%左右，模擬晝夜照明周期為12 h∶12 h，自由攝水攝食。

1.2方法

1.2.1各組大鼠處置方法Sham組僅暴露坐骨神經及其分支但不結扎；SNI組：暴露坐骨神經并結扎；SNI+DMSO組、SNI+LY294002組制備SNI模型并于SNI模型后第5天分別鞘內注射DMSO和LY294002。

1.2.2鞘內置管方法和給藥方法10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位，消毒鋪巾，以大鼠脊柱正中髂嵴連線水平為中心做縱向切口，分離并暴露L3-4間隙，于L3-4兩關節突結合處內側，用22G針頭刺穿黃韌帶，至大鼠甩尾后停止，拔出針頭，用鑷子輕輕地將PE-10導管向上置入，置入深度為1.5～2 cm，待大鼠出現甩尾反應，導管內有清亮的腦脊液流出，提示鞘內置管成功。4-0絲線固定導管于肌肉處，并經皮下隧道將導管引出至頸部皮膚，再次縫合固定。用0.1 mL生理鹽水沖洗導管，堵塞導管外口以避免腦脊液外溢。鞘內注射2%利多卡因20 μL后即刻出現雙下肢麻痹的大鼠提示置管成功，納入實驗組。SNI模型后第5～14天，SNI+LY294002組每天鞘內注射溶于10 μL DMSO的2.5 μg的LY294002，SNI+DMSO組鞘內注射10 μL的DMSO，之后用10 μL的生理鹽水沖洗管道。

1.2.3SNI模型成功鞘內置管后，參照Decosterd等的方法[7]，SD大鼠經腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉，俯臥位，在無菌環境下暴露坐骨神經及其分支(腓腸神經、腓總神經和脛神經)。4-0絲線結扎，切斷腓總神經和脛神經，保留腓腸神經。為保證實驗的一致性，手術操作均由同一人完成。大鼠SNI模型成功的標志為術側后爪不堪重負、足趾并攏外翻和自發性的縮足反應等。

1.2.4運動功能觀察所有SD大鼠在術前和術后均測體質量，作為健康狀況的評價指標。觀察動物自然狀態下隨意行走的步態，采用記分制：1分為正常步態、足無畸形；2分為正常步態伴明顯足畸形；3分為輕度步態障礙伴足下垂；4分為嚴重步態障礙伴肌無力。評分4分的大鼠剔除。

1.2.5疼痛行為學觀察和測量于術前和術后1，3，5，7，10，14 d實施行為學觀察，所有觀察均由同一人在固定時間(上午8:00～12:00)于安靜環境中進行。

1.2.5.1機械刺激縮足反應閾值(paw withdrawal mechanical thresholds，PWMT)按照Chaplan的方法[8]，用Von Frey纖維(Stoeling, Wood Dale，1L, USA)以up-and-down法測定PWMT，將透明玻璃箱置于金屬篩網上，大鼠適應15 min后，以Von Frey針絲垂直刺激大鼠術側后足掌部，彎曲至90°，持續6～8 s，每側足底測定5次，大鼠出現縮足或者舔足反應則為陽性反應。刺激力度從2 g開始，當刺激力度不足以引起陽性反應，則給予相鄰大一級的力度刺激，如此連續進行，直至出現第1次陽性反應，再連續測定4次，取平均值為閾值，最大力度為15 g，大于此值時記為15 g。每次刺激間隔30 s，每次測量時使尼龍絲彎曲到相同的弧度，以確保每次施加的刺激相同[9]。

1.2.5.2熱輻射刺激縮爪反應潛伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)按照Hargreaves的方法[10]，使用熱輻射測痛儀(BME410，天津中國醫學科學院生物醫學工程研究所)測定大鼠的熱痛閾。調整測痛儀的熱刺激強度，使正常熱痛閾為8～10 s。大鼠被置于單獨的透明有機玻璃容器中，預適應15 min，采用測痛儀對大鼠右側足底中部進行照射，記錄熱刺激縮足反射時間，讀數精確至0.01 s。每只大鼠每回測量5次，每回間隔6 min，取平均值為熱痛閾值。單次照射不超過30 s，以免損傷照射部位[11]。

1.2.6Western-blot法檢測PI3K、pERK的表達大鼠腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉后，迅速取L4-5脊髓節段置于液氮中保存待測。檢測時取EP管，分別稱質量標記，把組織剪切成小塊裝EP管中，稱質量。按每20 mg組織加200～400 μL的比例加入裂解液，取出脊髓組織放入勻漿器，冰上機械勻漿裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，小心吸取上清，采用BCA法測定蛋白樣品濃度，蛋白樣品煮沸5 min變性，等量蛋白樣品經10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后，以濕轉法電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃輕搖過夜，加入辣根氧化物酶標記物的羊抗兔IgG(1∶5 000，美國Thermo公司)，室溫孵育1 h，加ECL(美國Thermo公司)化學發光液，凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad公司)成像，以目的蛋白條帶光密度值與制模前條帶光密度值的比值反映蛋白表達水平。

2　結　果

2.1一般行為學觀察SNI模型建立后的第2天，大鼠即出現不同程度的神經損傷，表現為同側足趾并攏外翻、跛行、下肢軟弱無力、舔舐等行為學改變，神經損傷側后足觸碰地面后即刻抬起，無任何刺激的條件下，SNI大鼠均自發縮足。Sham組的大鼠行動自如，情況良好。SNI+LY294002組大鼠在給予LY294002后，上述癥狀減輕。造模前各組大鼠體質量均為250～280 g，造模后各組大鼠體質量按正常增加。

2.2PWMT的變化4組大鼠術前PWMT比較，無顯著性差異(P>0.05)。SNI后1，3，5，7，10，14 d，Sham組的PWMT高于其他3組，差別有統計學意義(P<0.05)。SNI+LY294002組的PWMT均高于SNI組和SNI+DMSO組(P<0.05)，提示LY294002提高了大鼠的機械痛閾。SNI組和SNI+DMSO組間差別則無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1　鞘內注射LY294002對SNI大鼠右足機械痛閾的影響

n=6.Sham：假手術；SNI：保留性脊神經損傷模型； SNI+LY294002：保留性脊神經損傷模型+PI3K抑制劑； SNI+DMSO：保留性脊神經損傷模型+二甲基亞砜.與Sham組比較，☆：P<0.05； 與SNI+LY294002組比較，#：P<0.05.

2.3PWTL的變化 4組大鼠術前PWTL無差異(P>0.05)，SNI術后1，3，5，7，10，14 d，Sham組的PWTL均高于其他3組，差別有統計學意義(P<0.05)。SNI+LY294002組的PWTL均高于SNI組和SNI+DMSO組(P<0.05)，提示LY294002增強了大鼠的熱痛閾。SNI組和SNI+DMSO組間差別則無統計學意義(P>0.05，表2)。

2.4PI3K和pERK表達SNI+LY294002組中，術后第14天大鼠脊髓中PI3K和pERK含量較SNI組和SNI+DMSO組有所減少，差別有統計學意義(P<0.05)，提示LY294002減少了PI3K和pERK的表達。SNI組大鼠脊髓中PI3K和pERK含量高于Sham組(P<0.05)；SNI組和SNI+DMSO組差別無統計學意義(P>0.05，圖1)。

表2　鞘內注射LY294002對SNI大鼠右足熱痛閾的影響

n=6.Sham：假手術； SNI：保留性脊神經損傷模型； SNI+LY294002：保留性脊神經損傷模型+PI3K抑制劑； SNI+DMSO：保留性脊神經損傷模型+二甲基亞砜.與Sham組比較，☆：P<0.05；與SNI+LY294002組比較，#：P<0.05.

3　討　論

神經病理性疼痛為疑難痛癥，臨床表現為針刺樣、燒灼樣、電擊樣痛，并伴有感覺超敏、感覺過敏或感覺異常。與傷害感受性疼痛相比，該類疼痛在發生機制上更加復雜，不僅包含了中樞神經和外周神經敏化引發的疼痛信號放大，更可能與初級感覺神經元興奮性異常增強有關。既往研究發現，大鼠足趾切口痛會促使小膠質細胞中的PI3K激活，抑制PI3K會緩解切口部位的急性疼痛[12]。骨癌患者小膠質細胞中PI3K增加，抑制其活性亦可減輕癌性疼痛[13]。上述研究提示，PI3K參與了急性疼痛與癌性疼痛的信號傳導。選擇經鞘內注射給藥方式位點準確。因此，本研究選擇經鞘內注射PI3K抑制劑LY294002，進一步探索抑制脊髓中的PI3K-pERK通路能否緩解神經病理性疼痛。

本研究觀察大鼠SNI模型后和給予鞘內注射LY294002后疼痛的變化，結果顯示，SNI后，大鼠痛閾明顯下降，鞘內注射LY294002后痛閾則增加；同時，SNI組大鼠脊髓中的PI3K表達量強于SNI+LY294002組。再次表明，PI3K在神經病理性疼痛中發揮了重要作用，經鞘內注射LY294002也可緩解早期形成的神經病理性疼痛。

ERK是絲裂原激活蛋白激酶家族中的一種，pERK能夠傳遞大量的細胞外信息到細胞內。有研究發現，小膠質細胞中的ERK信號通路介導了各種各樣的疼痛，抑制ERK的活性能減緩相應的疼痛[14-15]。本試驗觀察SNI后14 d大鼠脊髓中的pERK變化，結果發現，SNI組pERK含量顯著高于對照組，與之前的研究結果一致[16]。再次提示，pERK信號通路在神經病理性疼痛中發揮了重要作用。值得注意的是，在炎性疼痛和骨癌痛中，pERK的活性可被PI3K抑制劑所抑制[17-18]。為了確認上述發現是否在神經病理性疼痛中同樣存在，在SNI后第5～14天，每日實施鞘內注射LY294002，同時觀察大鼠脊髓中pERK含量的變化。結果發現，經鞘內注射PI3K抑制劑后，大鼠脊髓中pERK含量下降，同時痛閾上升。這一結果提示，PI3K抑制劑可以影響ERK磷酸化的表達。

綜上所述，在SNI模型中，PI3K和pERK含量同時增加，給予PI3K抑制劑后，在減緩疼痛的同時pERK表達下降。

[1]Treede R D, Jensen T S, Campbell J N,etal. Neuropathic pain: redefinition and a grading system for clinical and research purposes [J].Neurology, 2008, 70(18): 1630-1635.

[2]Biggs J E, Lu V B, Stebbing M J,etal. Is BDNF sufficient for information transfer between microglia and dorsal horn neurons during the onset of central sensitization [J]?MolPain, 2010,6:44.

[3]官學海，武靜茹. 磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路與疼痛的研究進展[J]. 國際麻醉學與復蘇雜志，2010，31(4)：346-348.

[4]Xu J T, Tu H Y, Xin W J,etal. Activation of phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B/Akt in dorsal root ganglia and spinal cord contributes to the neuropathic pain induced by spinal nerve ligation in rats [J].ExpNeurol, 2007,206(2):269-279.

[5]Zhuang Z Y, Gerner P, Woolf C J,etal. ERK is sequentially activated in neurons, microglia, and astrocytes by spinal nerve ligation and contributes to mechanical allodynia in this neuropathic pain model [J].Pain, 2005,114(1-2):149-159.

[6]Pezet S, Marchand F, D’Mello R,etal. Phosphatidylinositol 3-kinase is a key mediator of central sensitization in painful inflammatory conditions [J].JNeurosci, 2008,28(16):4261-4270.

[7]Decosterd I and Woolf C J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain [J].Pain, 2000, 87(2): 149-158.

[8]Chaplan S R, Bach F W, Pogrel J W,etal. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw [J].JNeurosciMethods, 1994, 53(1): 55-63.

[9]劉榮國，徐雪汝，米立梅，等. 鞘內注射IRF反義寡核苷酸對CCI模型大鼠痛域的影響[J]. 中國疼痛醫學雜志，2015,21(5)：351-356.

[10]Hargreaves K, Dubner R, Brown F,etal. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia [J].Pain, 1988,32(1):77-88.

[11]劉益鳴，張挺杰，馮藝，等. 脈沖射頻對CCI大鼠背根神經節HCN通道的影響[J]. 中國疼痛醫學雜志，2013,19(6)：323-329.

[12]Xu B, Guan X H, Yu J X,etal. Activation of spinal phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B mediates pain behavior induced by plantar incision in mice [J].ExpNeurol, 2014,255:71-82.

[13]Jin D, Yang J P, Hu J H,etal. MCP-1 stimulates spinal microglia via PI3K/Akt pathway in bone cancer pain[J].BrainRes, 2015,1599:158-167.

[14]Khan N, Gordon R, Woodruff T M,etal. Antiallodynic effects of alpha lipoic acid in an optimized RR-EAE mouse model of MS-neuropathic pain are accompanied by attenuation of upregulated BDNF-TrkB-ERK signaling in the dorsal horn of the spinal cord [J].PharmacolResPerspect, 2015,3(3): e00137.

[15]Zhang X, Zhang H, Shao H,etal. ERK MAP kinase activation in spinal cord regulates phosphorylation of Cdk5 at serine 159 and contributes to peripheral inflammation induced pain/hypersensitivity [J].PLoSOne, 2014,9(1): e87788.

[16]Guo Y J, Shi X D, Fu D,etal. Analgesic effects of the COX-2 inhibitor parecoxib on surgical pain through suppression of spinal ERK signaling [J].ExpTherMed, 2013,6(1):275-279.

[17]Wang H, Qin J, Gong S,etal. Insulin-like growth factor-1 receptor-mediated inhibition of A-type K(+) current induces sensory neuronal hyperexcitability through the phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathways, independently of Akt [J].Endocrinology, 2014,155(1):168-179.

[18]Guan X H, Fu Q C, Shi D,etal. Activation of spinal chemokine receptor CXCR3 mediates bone cancer pain through an Akt-ERK crosstalk pathway in rats [J].ExpNeurol, 2015,263:39-49.

(編輯：何佳鳳)

Intrathecal LY294002 Injection Inhibits Spinal PI3K and pERK Induced by SNI in Rats

LIU Rongguo, MI Limei, XU Xueru, FANG Xiangyu, LIN Xingwu

Department of Pain Management, Fujian Provincial Hospital, Provincial Clinical College,Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China

ObjectiveTo observe whether intrathecal LY294002 injection could inhibit PI3K-pERK to alleviate neuropathic pain induced by SNI in rats.Methods24 adult male rats of Sprague Dawley (SD) were randomly divided into four groups: Sham, SNI (spared nerve injury), SNI+DMSO and SNI+LY294002 (n=6).Rats in SNI+ LY294002 group and SNI+DMSO group received intrathecal LY294002(PI3K inhibitor) and DMSO daily from day 5 to day 14 after SNI, respectively.Paw withdrawal mechanical thresholds (PWMT) and paw withdrawal thermal latency (PWTL) were measured on the 1st day before SNI and 1, 3, 5, 7, 10 and 14 days after SNI.On day 14 after SNI, all rats were killed under deep anesthesia, and their lumbar spinal cords were dissected to detect the levels of PI3K and pERK with western blot analysis (n=6).ResultsCompared with those in Sham group, the PWMT and PWTL in SNI group were all decreased, whereas the PI3K and pERK levels were increased on day 14 after SNI(P<0.05).Compared with those in SNI and SNI+DMSO group after SNI, the PWMT and PWTL in SNI+LY294002 group were all up-regulated (P<0.05), however, the PI3K and pERK levels were down-regulated on day 14 after SNI (P<0.05), which indicated that LY294002 relieved mechanical allodynia and thermal hyperalgesia induced by SNI.ConclusionsThe results from this study show that intrathecal LY294002(PI3K inhibitors) inhibits PI3K and pERK, therefore it can alleviate neuropathic pain induced by SNI in rats.

neuropathic pain; 1-phosphatidylinositol 3-kinase; extracellular signal-regulated MAP kinases

2016-02-29

福建省科技計劃重點資助項目(2014Y0010);福建省衛生系統第四批學術技術帶頭人培養基金

福建醫科大學 省立臨床醫學院，福建省立醫院 疼痛科，福州350001

劉榮國(1970-)，男，主任醫師，醫學博士. Email: lrgfw88@sina.com

R319； R-332； R345.57； R741.02； R977.3

A

1672-4194(2016)05-0290-05