核糖體小亞基蛋白S7對結腸癌細胞HCT116遷移的作用初探

段　娟， 徐　燕， 廖之君， 鄭志竑， 何　艷

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核糖體小亞基蛋白S7對結腸癌細胞HCT116遷移的作用初探

段娟， 徐燕， 廖之君， 鄭志竑， 何艷

目的探討核糖體小亞基蛋白S7(RPS7)對結腸癌細胞HCT116遷移的作用及機制。方法以3種基因型人結腸癌HCT116細胞株(p53野生型，p53-/-，p21-/-)為研究對象，利用pCDNA3.1-s7質粒對rps7基因進行過表達，rps7小分子干擾RNA對rps7基因進行沉默，實時定量PCR檢測轉染前后細胞rps7 mRNA的表達變化，Transwell細胞遷移實驗觀察細胞遷移能力的改變。結果3種不同的HCT116細胞株轉染了pCDNA3.1-s7質粒后，rps7基因的表達均明顯上調，且遷移能力均受到顯著促進，增幅大小依次為HCT116 (p53-/-)>HCT116(WT)>HCT116 (p21-/-)；而轉染了rps7 siRNA后，rps7基因的表達均明顯下調，且遷移能力均受到顯著抑制，減幅大小依次為HCT116 (p53-/-)>HCT116 (p21-/-)>HCT116(WT)。結論RPS7對結腸癌細胞HCT116遷移運動的促進作用顯著，且該作用與細胞內的P53水平有關，提示RPS7可能通過P53通路或者其他機制在結腸癌細胞HCT116的遷移中發揮重要作用。

核糖體蛋白質類/*生物合成； RNA，小分子干擾； 基因，p53； 細胞運動； 結腸腫瘤； HCT116細胞

結腸癌是臨床常見的消化系統腫瘤，居我國惡性腫瘤第3位，其發病率與死亡率有逐年上升的趨勢[1]。腫瘤轉移是結腸癌高死亡率的主要原因[2]。結腸癌的轉移機制非常復雜，這一過程涉及癌細胞的上皮-間質轉化、侵襲黏附能力、血管生成、胞外基質降解以及微環境趨化作用[3-4]。研究發現，核糖體小亞基蛋白S7(ribosomal protein S7, RPS7)能夠在乳腺癌細胞中與MDM2結合，抑制MDM2調節的P53的泛素化，從而激活P53[5]；而且在斑馬魚模型中，RPS7也能夠通過P53通路影響斑馬魚胚胎的發育[6]；在卵巢癌中，RPS7能夠通過PI3K/AKT和MAPK信號通路抑制卵巢癌的增殖和轉移，值得注意的是，RPS7的缺失同樣可以下調p53重要的下游基因——p21[7]。這些研究提示，RPS7在癌癥的發生發展中可能發揮重要的作用，并且與P53信號通路密切相關。本研究將利用3種基因型人結腸癌HCT116細胞株(p53野生型，p53-/-，p21-/-)，分別過表達和敲低RPS7，探討RPS7對結腸癌細胞遷移的作用以及該作用與P53之間的關系，為結腸癌的轉移機制及治療提供新的方向。

1　材料和方法

1.1材料3種基因型人結腸癌HCT116細胞株，HCT116(WT)、HCT116(p53-/-)和HCT116(p21-/-)均由美國德州理工大學的張瑞穩教授饋贈[8]。胎牛血清、McCoy’s 5A培養基、0.25%胰酶(美國Gibco公司)；rps7過表達質粒(pCDNA3.1-s7)以及陰性對照(pCDNA3.1空載體)為本實驗室構建；rps7 siRNA雙鏈以及陰性對照(上海吉瑪公司)；rps7及actin的上下游引物、Trizol及Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)；反轉錄試劑盒、SYBR Green定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；Transwell板(美國Corning公司)。

1.2方法

1.2.1rps7 siRNA和過表達質粒的構建提取293T細胞總RNA，反轉錄成cDNA后特異性擴增rps7基因片段，擴增用的PCR正反引物如下：

5′-CGG GAT CCA TGT TCA GTT CGA GCG CCA AGA T-3′

5′-CCG CTC GAG TTA CAA TTG AAA CTC TGG GAA T-3′

將擴增產物克隆到pCDNA3.1載體，測序鑒定。rps7 siRNA的有效序列如下：

5′-TCGGAAAGCTATCATAATCTTTA-3′[7]

1.2.2細胞培養所有的細胞用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和鏈霉素的McCoy’s 5A培養基，并置于37 ℃、體積分數為0.05的CO2細胞培養箱中進行培養。

1.2.3細胞轉染取對數生長期的結腸癌細胞，以每孔4×105個種植于6孔板中培養24 h，將rps7過表達質粒或rps7 siRNA以及陰性對照分別應用Lipofectamine2000進行轉染，具體的轉染步驟參照試劑盒說明書。轉染后24 h收集細胞或進行后續實驗。

1.2.4實時定量PCR應用Trizol提取組織或細胞總RNA，并測定RNA濃度及純度。然后通過反轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，最后通過SYBR Green定量PCR試劑盒進行定量檢測，每個反應設3個復孔，引物上下游序列為：

rps7：

上游：5′-TCCGGCTAGTACGCGAATTG-3′

下游：5′-CAGCTGTCAGAGTACGGCTC-3′

actin：

上游：5′-ATGATGATATCGCCGCGCTC-3′

下游：5′-AATCCTTCTGACCCATGCCC-3′

1.2.5體外遷移實驗Transwell小室纖維膜孔徑為8 mm，24孔板中加入含10%胎牛血清的McCoy’s 5A 500 μL，小室中加入不含血清的 McCoy’s 5A 500 μL，同時每個小室中加入5×104個細胞(過表達RPS7)或1×105個細胞(敲減RPS7)，置于細胞培養箱中連續培養48 h；取出小室，小室下表面的細胞用4%多聚甲醛固定，0.5%結晶紫染色；顯微鏡下每個小室隨機觀察5個視野并拍照，計數穿膜細胞數。實驗重復3次。

2　結　果

2.1實時定量PCR檢測轉染后rps7的表達情況實驗組3種細胞株HCT116(WT)、HCT116(p53-/-)和HCT116(p21-/-)轉染rps7 siRNA(s7 si)48 h后，rps7 mRNA水平均較對照組(con si)顯著下降(圖1)；而且與對照組(con oe)比較，實驗組轉染了rps7過表達質粒(s7 oe)48 h后，rps7 mRNA水平均出現顯著上升(圖1)。

2.2過表達RPS7促進結腸癌細胞的遷移體外遷移實驗表明，轉染了rps7過表達質粒(pCDNA3.1-s7)后，顯微鏡下觀察穿過小室基底膜的細胞數明顯多于轉染陰性對照組，差別均具有統計學意義(P<0.01，圖2)。但過表達RPS7后，不同細胞遷移能力的增強程度有差異：在HCT116(WT)、HCT116(p53-/-)及HCT116(p21-/-)細胞中，遷移細胞數分別增加了(134.26±14.32)%，(248.70±24.67)%及(52.57±2.63)%。其中HCT116 (p53-/-)細胞與HCT116(WT)細胞比較，遷移能力增幅較大；而HCT116 (p21-/-)細胞與HCT116(WT)細胞比較，遷移能力增幅較小；HCT116 (p21-/-)細胞與HCT116 (p53-/-)細胞比較，遷移能力增幅較小；差別均具有統計學意義(P<0.01)。即過表達RPS7能使3種HCT116細胞的遷移能力均受到顯著促進，增幅大小依次為HCT116 (p53-/-)> HCT116(WT)>HCT116 (p21-/-)。

2.3敲低RPS7抑制結腸癌細胞的遷移體外遷移實驗表明，轉染了rps7 siRNA后，顯微鏡下觀察穿過小室基底膜的細胞數明顯少于轉染陰性對照組，差別均具有統計學意義(P<0.01，圖3)。但敲低RPS7后，不同細胞遷移能力的減弱程度有差異：在HCT116(WT)細胞中，遷移細胞數減少了(64.30±2.14)%；在HCT116(p53-/-)細胞中，遷移細胞數減少了(91.90±1.35)%；在HCT116(p21-/-)細胞中，遷移細胞數減少了(84.97±1.92)%。其中，HCT116 (p53-/-)細胞與HCT116(WT) 細胞比較，遷移能力減幅較大；HCT116 (p21-/-) 細胞與HCT116(WT) 細胞比較，遷移能力的減幅較大；而HCT116 (p21-/-) 細胞與HCT116 (p53-/-)細胞比較，遷移能力減幅略小；差別均具有統計學意義(P<0.01)。表明敲低RPS7能使3種HCT116細胞的遷移能力均受到顯著抑制，減幅大小依次為HCT116 (p53-/-)>HCT116 (p21-/-)>HCT116 (WT)。

3　討　論

在世界范圍內每年大約新發100萬結腸癌患者。早期結腸癌患者通過手術治療預后較好，但是晚期患者的5年生存率僅為20%左右，死亡的主要原因是癌細胞轉移[1]。本實驗選用了3種基因型的人結腸癌細胞株HCT116(p53野生型，p53-/-，p21-/-)，發現RPS7對結腸癌細胞HCT116遷移運動的促進作用顯著，且該作用的大小與細胞內的P53水平有關，并且過表達RPS7與敲低RPS7相比，不同的細胞有不同的反應。提示RPS7可能通過P53通路或者其他機制在結腸癌細胞HCT116的遷移中發揮重要作用。

早有文獻報道，在某些細胞系中，一些核糖體蛋白，特別是核糖體大亞基蛋白RPL5、RPL11、RPL23，能夠直接與MDM2結合來調控P53的活性[9-11]。2007年，有學者發現，RPS7能夠通過類似的機制調控P53-MDM2間的相互作用，繼而激活P21，是第1個被發現具有該功能的核糖體小亞基蛋白[5]。已有研究表明，在乳腺癌、人骨肉瘤等癌細胞中，過表達RPS7能激活P53和P21[5]；但在卵巢癌、斑馬魚胚胎等細胞中，敲低RPS7反而能激活P53和P21[6-7]。提示RPS7的作用與P53通路密切關聯，但是不同的細胞有不同的作用模式。在本試驗中，筆者特意選用了3種基因型的人結腸癌細胞株HCT116(p53野生型，p53-/-，p21-/-)，希望探尋結腸癌細胞中RPS7的作用與P53通路間的關系。結果發現，在p53-/-細胞中，RPS7對HCT116細胞遷移的影響更大，即敲除P53后，RPS7的作用效果更明顯，表明RPS7能通過P53通路對HCT116細胞的遷移發揮作用。在不同的癌組織和癌細胞中，P53的水平不同，癌癥治療時也需考慮這一因素[12]。但是要闡明RPS7與P53在結腸癌中的作用模式，尚需一系列組織細胞分子生物學實驗。

盡管核糖體蛋白最主要的功能是參與蛋白質合成，然而，近年來研究者發現，它們還有許多其他功能。譬如，核糖體小亞基蛋白RPS3可作為NF-κB復合物的一個KH結構域，調節特定基因的表達[13]。本實驗結果提示，改變RPS7的表達水平能顯著影響3種HCT116細胞(p53野生型，p53-/-，p21-/-)的遷移，表明RPS7還能通過P53以外的其他通路發揮重要作用，暗示在結腸癌細胞HCT116中RPS7有新的作用機制待發現。

綜上所述，筆者初步發現RPS7的異常表達顯著影響結腸癌細胞HCT116的遷移運動，而且這種作用受P53通路的影響，推測RPS7在結腸癌細胞HCT116的轉移中起著非常重要的作用。

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[3]Wu Z H, Wang X L, Tang H M,etal. Long non-coding RNA HO-TAIR is a powerful predictor of metastasis and poor prognosis and is associated with epithelial-mesenchymal transition in colon cancer[J].OncolRep, 2014,32(1):395-402.

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[13]Wan F, Anderson D E, Barnitz R A,etal. Ribosomal protein S3: a KH domain subunit in NF-kappaB complexes that mediates selective gene regulation[J].Cell, 2007,131: 927-939.

(編輯：何佳鳳)

The Discussion of the Effect of Ribosomal Protein S7 on the Migration of Human Colon Cancer Cells HCT116

DUAN Juan, XU Yan, LIAO Zhijun, ZHENG Zhihong, HE Yan

Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China

ObjectiveTo study the effect and mechanism of rps7 on the migration of human colon cancer cells HCT116invitro.MethodsThe three kinds of human colon cancer cells HCT116(p53 WT，p53-/-，p21-/-)were transfected by pCDNA3.1-s7 plasmid to overexpression rps7 gene or rps7 siRNA to silence rps7 gene.The mRNA level of rps7, before and after transfection, was examined by real-time quantitative RT-PCR (QPCR) respectively.Then the migration capability was evaluated by tumor migration assay.ResultsIn three different HCT116 cells, the transfection of pCDNA3.1-s7 plasmid could specifically up-regulate the rps7 mRNA, and the upregulation of rps7 promoted the migration capability with the increased range in the order of HCT116 (p53-/-)> HCT116(WT)> HCT116 (p21-/-).The transfection of rps7 siRNA could down-regulate the rps7 mRNA, and this downregulation suppressed the migration capability, and the decrease range is HCT116 (p53-/-)> HCT116 (p21-/-)>HCT116(WT).Conclusionrps7 obviously promoted the migration of HCT116 cellsinvitro，and the influence was related with P53 level in cells.These results suggest that RPS7 may play an important role in the malignant progression in colon cancer cells HCT116, through P53 pathway or other unknown mechanism.

ribosomal proteins/* biosynthesis; RNA, small interfering; genes, p53; cell movement; colonic neoplasms; HCT116 cells

2016-03-18

福建省自然科學基金青年基金(2013J05048)；福建醫科大學博士啟動基金(2011BS001)

福建醫科大學 基礎醫學院生物化學與分子生物學系，福州350108

段娟(1982-)，女，講師，理學博士

何艷. Email: hyhyj2002@163.com

R329.24； R329.25； R341； R394.114； R735.35

A

1672-4194(2016)05-0281-04