髂骨來源的“雙相”BMG結合軟骨細胞修復兔關節軟骨缺損的實驗研究

白亦光，陳巧玲，肖東琴，劉康，馮剛

(川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院，1.骨科；2.腫瘤科；3.組織工程與干細胞研究所，四川 南充　637000)

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髂骨來源的“雙相”BMG結合軟骨細胞修復兔關節軟骨缺損的實驗研究

白亦光1，陳巧玲2，肖東琴3，劉康3，馮剛3

(川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院，1.骨科；2.腫瘤科；3.組織工程與干細胞研究所，四川 南充637000)

目的：探討應用髂骨來源的“雙相”骨基質明膠(bone matrix gelatin,BMG)結合軟骨細胞移植修復兔關節軟骨缺損的有效性和可行性。方法：使用酶消化法體外分離培養并擴增兔肋軟骨細胞；使用自體來源髂骨構建“雙相”BMG支架材料；將軟骨細胞種植與BMG支架材料上構建成為細胞-BMG復合物；將制作好的27只軟骨缺損動物模型隨機分為3組。將細胞-BMG復合物移植于軟骨缺損模型進行修復治療作為實驗組。將BMG支架移植入軟骨缺損模型作為材料組；空白對照組不做處理。分別在術后4周、8周和12周通過大體形態學(依據國際軟骨修復協會評分量表)、病理組織學染色及免疫組織化學染色方法對各組修復效果進行評價。結果：番紅O染色，甲苯胺藍染色和Collagen II 免疫組化染色分別提示術后12周時實驗組的修復組織非常類似于正常關節軟骨，組織表面與正常軟骨組織平面幾乎持平，材料組軟骨缺損處得到了部分修復，而缺損組的修復效果較差。按照ICRS量表，大體形態學和病理組織學評分結果提示：術后12周實驗組的修復效果與其他兩組相比有明顯統計學差異(P<0.05)。結論：自體髂骨來源的“雙相”BMG結合軟骨細胞在體內可形成具有一定結構功能的軟骨組織，能夠應用于再生修復軟骨的缺損。

軟骨細胞；BMG支架材料；軟骨修復；組織工程

關節軟骨是一個具有彈性光滑表面，提供結構支撐和執行關節承載與活動功能的無血管組織，在關節運動中具有降低磨損和緩沖震蕩的作用[1]。 膝關節骨性關節炎是一類具有高發病率疾病，是引起中老年人膝關節疼痛的最主要病因，隨著年齡的增長，其自我修復能力逐漸減弱。目前臨床上對骨性關節炎的治療主要分為非手術保守治療(藥物和物理治療)和外科手術治療(膝關節置換術等)[2-3]。保守治療措施主要有使用非甾體抗炎藥、營養軟骨藥和關節腔注射玻璃酸鈉注射液，其目的主要是緩解臨床癥狀，卻不能逆轉已經發生退行性變的關節軟骨和細胞的生物學功能，且只在關節軟骨發生退行性變的早期有效；同樣現有的外科手術治療手段主要有置換人工金屬材質關節，以達到緩解癥狀和維持關節運動功能和穩定性的效果，數年以后仍需要進行關節返修等手術等[4]。因此，繼續深入研究關節退行性變疾病的有效治療手段具有十分重要的意義。

組織工程軟骨構建主要涉及種子細胞及具有軟骨細胞生存的三維結構微環境能力的材料支架構成。選擇一種合適的生物支架材料顯得尤為重要。本實驗擬采用自體髂骨來源的“雙相”骨基質明膠(bone matrix gelatin,BMG)三維支架作為組織工程材料并結合軟骨細胞對兔膝關節軟骨缺損模型進行修復，以期取得良好的修復效果。

1　材料與方法

1.1實驗動物及實驗方法

1.2.1軟骨細胞的培養與增殖將5月齡新西蘭兔肋軟骨無菌分離，剪成1 mm3大小碎片，使用等體積0.1%Ⅱ型膠原酶消化后，放于37 ℃恒溫水浴8 h(4 h后替換一次膠原酶)。取10% FBS的DMEM培養基加入離心管稀釋，離心，棄上清，最后將沉淀移入T75細胞瓶中，加20% FBS的DMEM培養基10 mL于瓶內，靜置于5% CO2，37 ℃培養箱培養。將軟骨細胞原代培養并增殖到所需的數量級[5]。

1.2.2“雙相”BMG材料的制備將新西蘭兔耳緣靜脈3%戊巴比妥鈉l mL/kg麻醉后俯臥位固定于手術臺，骼骨處預先脫毛，常規碘伏消毒鋪巾，切開皮膚約3 cm，顯露骼骨；用骨刀及外科剪剪取骼骨以保持松質骨與皮質骨的“雙相”結構。將骼骨標本4 ℃下浸泡于0.9% NH4CL中24 h；水洗后使用氯仿及甲醇按體積比1∶1比例混合浸泡骼骨標本1.5 h(脫脂)；4 ℃下浸泡于0.6 mol/L HCL下7 h進行脫鈣，至骼骨標本變軟且具有彈性；蒸餾水清洗5次；再次使用體積比1∶1氯仿甲醇混合液脫脂過夜；依次使用2 mol/L氯化鈣浸泡1 h、0.5 mol/L乙二氨四乙酸浸泡1 h、4 mol/L氯化鋰浸泡1 h； 55 ℃蒸餾水水浴24 h；37 ℃下DMEM培養液浸泡1 h；得到BMG材料。將得到的BMG修剪成高3 mm×3 mm×5 mm的圓柱狀，注意保持BMG材料的“雙相”性，即一側為松質骨，一側為皮質骨，風干后電鏡下觀察孔隙率，環氧乙烷滅菌后-80 ℃保存[6]。

1.2.3BMG-軟骨細胞復合物的制備將BMG材料復溫，放入96孔板，將軟骨細胞濃度調整為1×107/mL，去1 mL滴加在BMG材料上，靜置于5% CO2，37 ℃培養箱培養，使用時直接移植即可。

1.2.4 動物體內試驗取10月齡新西蘭白兔27只(川北醫學院實驗動物中心提供)，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg。10月齡兔隨機分為3組，分別命名為缺損組、材料組和BMG-軟骨細胞組。耳緣靜脈注射麻醉后，常規備皮、消毒、鋪巾；取雙膝外側切口，切口長度1 cm；逐層打開皮膚、滑膜層、關節囊；推開髕骨及髕骨旁脂肪墊；屈曲膝關節；于髕骨溝處用電鉆開 3 mm×3 mm大小的軟骨缺損，深度保持在5 mm左右。其中缺損組直接復位髕骨，逐層縫合切口。材料組僅移植BMG材料，注意確保松質骨面向上，皮質骨面向下，逐層縫合切口。BMG-軟骨細胞組將培養箱中的BMG-軟骨細胞復合物完整植入，逐層縫合切口。術后3 d使用青霉素肌肉注射預防感染。

1.2檢測指標

1.2.1大體觀察術后4、8、12 周時段處死動物，游離股骨遠端肉眼觀察關節修復組織色澤、修復組織面積、厚度及其與周圍組織有無粘連等情況。根據以往國際軟骨修復協會(ICRS)量表進行評分[7]。

1.2.2番紅O染色10%多聚甲醛固定標本，脫鈣兩周，矢狀位切開遠端股骨標本，石蠟包埋，切片(厚5 μm)，二甲苯酒精脫蠟至水；蘇木素染10 min；0.2%亮綠染色10 min；0.1%番紅O染色10 min；1%醋酸酒精分化液3 s，樹脂封片后鏡下觀察[8]。

1.2.3甲苯胺藍染將切片60 ℃烘烤過夜；蒸餾水水洗3次，每次5 min；二甲苯酒精脫蠟至水；1%甲苯胺藍染色4 h(保持室溫25 ℃，必要時可使用酒精燈烘烤)，蒸餾水水洗3次后封片，鏡下觀察[8]。

1.2.4Ⅱ型膠原免疫組化染色將切片60 ℃烘烤過夜；二甲苯酒精脫蠟至水；2%牛透明質酸酶封閉30 min；3%過氧化氫封閉10 min(避光)；Ⅱ型膠原一抗(鼠抗兔)封閉4 ℃過夜; Ⅱ型膠原二抗(羊抗鼠)封閉1 h(保持室溫25 ℃)；DAB顯色；樹脂封片后倒置顯微鏡下觀察并采集圖像[8]。

1.3統計學分析

實驗數據應用SPSS 13.0統計學軟件處理。數據以均數±標準差表示, 組間比較采用方差分析，P<0.05為有統計學意義。

2　結果

2.1軟骨細胞體外分離培養及形態學觀察

組織培養7 d后可見少量細胞爬出，貼壁后的細胞外觀呈多角形、圓形或橢圓形，胞質豐富。14 d后在培養瓶中呈現典型鋪路石樣表現，如圖1所示。

2.2“雙相”BMG材料肉眼及電鏡下觀察

BMG材料修剪為3 mm×3 mm×5 mm大小圓柱狀，肉眼觀察如圖2A所示；電鏡下觀察BMG材料松質骨一側表面顯示布滿孔穴、內部多孔隙,為種子細胞的生長提供了良好的外部環境，松質骨面孔隙大小100～800 μm,如圖2所示。

2.3關節軟骨缺損修復效果組織學評價

番紅O染色提示：在術后12 周，3組正常軟骨層均顯示大量紅染，表明正常軟骨組織表面含有大量蛋白多糖，其中缺損組的修復情況較差，缺損部位平面明顯低于正常軟骨組織，基底部雜亂無章，可見少量骨組織及纖維軟骨組織增生，未見明顯的軟骨層及軟骨陷凹形成；材料組修復部位平面明顯低于正常軟骨組織，BMG材料表面紅染，可見材料支架未被明顯降解吸收，但表面未見明顯軟骨層形成；實驗組可見修復的組織表面與正常軟骨組織平面幾乎持平，表面含有大量蛋白多糖，紅染明顯。形成明顯軟骨層，軟骨層下可見明顯軟骨陷凹，修復效果明顯(如圖3所示)。

甲苯胺藍染色提示：在術后12 周，3組正常軟骨層均顯示大量藍染，缺損組缺損部位組織甲苯胺藍染色不明顯，內部呈現骨性或纖維性組織修復；材料組修復部位可見基質甲苯胺藍染色較淡，呈現條索狀支架，細胞外基質淡染，修復效果不佳；實驗組術后修復部位明顯填充，細胞外基質藍染明顯，形成完整的軟骨表面，與正常軟骨層幾乎看不到明顯差別，修復效果明顯(如圖3所示)。

Collagen II 免疫組化染色提示：在術后12 周，三組正常軟骨層均顯示大量黃染，缺損組術后缺損部位CollagenII 免疫組化染色不明顯，基底部未見明顯Collagen II分泌；材料組術后修復組織中黃染較淡，細胞外基質淡染，說明CollagenII 少量分泌，修復組織內部多為纖維性組織修復。實驗組術后修復組織內細胞外基質為陽性, 新生組織分泌大量 Collagen II，與正常軟骨層表面相似，修復效果明顯(如圖3所示)。

2.4ICRS量表評分

按照ICRS量表，術后將股骨遠端游離后肉眼觀察修復效果進行評分，各時間點各組間比較如圖4所示，術后12周缺損組得分5.2±0.5；材料組得分5.9±1.2；實驗組得分9.5±1.5，與其他兩組相比有明顯統計學意義。將病理組織學觀察修復效果進行評分，各時間點各組間比較如圖5所示，術后12周缺損組得分17.2±1.5；材料組得分9.8±0.5；實驗組得分9.7±1.2，與其他兩組相比有明顯統計學意義。

由此可見，實驗組在術后12周，修復效果明顯強缺損組和材料組。

*P<0.05，與對照組和材料組相比。

*P<0.05，與對照組和材料組相比。

3　討論

各種針對軟骨損傷修復的治療方法正在積極的探索研究當中。目前治療方法有很多，主要包括：自體軟骨細胞移植，骨膜及軟骨移植或者微骨折外科手術等。自體軟骨細胞移植據報道臨床軟骨修復效果較滿意，但軟骨細胞來源非常有限，并且體外培養增殖能力差，細胞容易衰老或纖維樣分化，在進行移植過程中，細胞懸液無法在缺損處良好固定，常常發生滲漏導致種子細胞的浪費以及周圍軟組織的骨化；骨膜及軟骨移植治療軟骨損傷存在匹配困難、移植物易退變等缺陷，微骨折外科手術可在短期內緩解關節的疼痛癥狀，但其破壞了關節軟骨的微環境，從而導致軟骨纖維化修復，遠期效果差，甚至導致嚴重的并發癥[9]。

本實驗從組織工程角度為關節軟骨缺損修復提供了另一個方法，其原理主要是將種子細胞與生物材料之間綜合應用，在體外構建有生物活力的組織工程軟骨體，然后植入修復組織缺損處，達到組織或器官功能的恢復。這種組織工程軟骨體與自體軟骨移植的區別在于種子細胞可以在體內良好的增殖并分泌新的有效的Ⅱ型膠原和蛋白多糖等軟骨細胞外基質，而自體軟骨移植后，其內分化成熟的軟骨細胞無法分泌新的有效的軟骨細胞外基質，而軟骨組織又是一種缺乏血供的組織，無法進行自我修復，故而移植后易發生退變。 對軟骨修復結果的病理評價方法，采用大體觀察以及組織病理學觀察兩種方式，并分別采用ICRS公認的量表法進行評分，組織病理學觀察采用番紅O染色、甲苯胺藍染色及Collagen II 免疫組化染色來檢測，其中番紅O和甲苯胺藍對軟骨組織內的糖胺聚糖十分敏感，相互之間形成佐證。Collagen II是軟骨組織重要的細胞外基質，對其表達量的檢測也十分重要。

本實驗中，術后12周實驗組的軟骨缺損修復效果較其他兩組十分滿意，表明BMG作為支架材料是非常合適的，由于“雙相”支架材料BMG的另一面為骨皮質，在與缺損處基底部的骨質相融合生長的過程中，可以彌補其他材料在修復表面的機械強度不夠這一缺點，但具體強度指標未得到進一步的證實，這將是下一步實驗需要完善的方向。

種子細胞是組織工程中的重要一個環節，實驗所使用的種子細胞是成熟的類軟骨細胞，有學者在使用骨髓間充質干細胞及脂肪干細胞對軟骨缺損進行移植也取得了良好的修復效果[10]，在今后的實驗中，我們可以將使用上述干細胞與分化成熟的軟骨細胞進行修復效果的比較，試圖尋求一種更為有效的種子細胞選擇。

軟骨組織工程研究仍處于動物體內及體外實驗階段，距離臨床安全有效的應用尚有一段距離。但是隨著對組織工程軟骨在種子細胞來源，支架的特性及細胞與支架的構建等一系列問題研究的不斷深入,組織工程軟骨的臨床應用前景必將受到了更加廣泛的關注。本實驗使用BMG材料構建組織工程軟骨對缺損的關節軟骨進行了結構和功能上的修復，為今后組織工程軟骨的臨床應用提供了實驗基礎。

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[5]趙明，陳竹，張旭乾，等.關節軟骨細胞體外培養及生物學特性的實驗研究[J].川北醫學院學報,2013,28(2):95-98.

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(學術編輯：馮剛)

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Experimental study on the repairment for articular cartilage defects of rabbit with “bipolar” bone matrix gelatin combined with chondrocytes

BAI Yi-guang1,CHEN Qiao-ling2,XIAO Dong-qin3,LIU Kang3,FENG Gang3

(NanchongCentralHospital,TheSecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,1.OrthopaedicDepartment;2.OncologyDepartment;3.ResearchInstituteofTissueEngineeringandStemCell,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To study the effectiveness and feasibility of the “bipolar” BMG which come from ilium combined with chondrocytes transplanted to repair articular cartilage defects.Methods：Culture the primary rabbit cartilage cells with the enzyme digestion method in vitro. Construct “bipolar” BMG scaffold material with the autogenous iliac.Construct cells-BMG composites with the cartilage cells and BMG scaffold material.The 27 cartilage defect animal models were randomly divided into three groups.The cells-BMG composite was transplanted to repair cartilage defect model as experimental group.The BMG scaffold material transplanted to repair cartilage defect model as materials control group.The defect model was without any treatment as blank control group.The repair effect was evaluated by gross morphology (according to the ICRS rating scale),pathological histology staining and immunohistochemical staining method at 4 weeks,8 weeks and 12 weeks respectively.Results：Safranin O,toluidine blue and collagen II immunohistochemical staining demonstrate that regenerate tissue of experimental group was similar with normal cartilage，and the surface of regenerate tissue and normal cartilage tissue were almost flat at 12 weeks after surgery. However,the defects in materials control group had been repaired partly and the repair effect of blank control group was very poor.According to the ICRS rating scale，the repair effect scores of gross morphology and pathologic histology showed that the scores of experimental group were significant higher than the other two groups at 12 weeks after surgery (P<0.05).Conclusion：“Bipolar” BMG combined with cartilage cells can form cartilage tissue in vivo which possess a certain structure function.The tissue engineering cartilage can be used in regenerative repair of cartilage defects.

Cartilage cells；BMG scaffold material；Cartilage repair；Tissue engineering

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.05.08

國家自然科學基金(81171472、81071270、30872614)；四川省教育廳資助項目(15ZA0216、15ZB0201)；南充市科技局科技支撐項目(14A0017、14A0022)；川北醫學院科研發展計劃(CBY14-A-ZD02)；四川省衛計委科研項目(16PJ202)

2015-10-26

白亦光(1986-)，男，碩士，住院醫師。E-mail:baiyiguang@163.com

馮剛，E-mail:lssmd18@gmail.com

時間：2016-10-2511∶31

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20161014.1716.016.html

1005-3697(2016)05-0652-04

R684.3

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