Fmoc-F多肽水凝膠對丁香精油的控釋作用研究

張 琳周天嘯 王 奔 郝雅晏 陸 俊，2

(1. 中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2. 稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004)

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Fmoc-F多肽水凝膠對丁香精油的控釋作用研究

張 琳1,2周天嘯1王 奔1郝雅晏1陸 俊1，2

(1. 中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2. 稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004)

探討Fmoc-F(Phe)多肽形成的凝膠對丁香精油的包埋和控制釋放作用。結果表明，Fmoc-F形成的凝膠對丁香精油的包埋率可達98.69%；在pH>6.5時，Fmoc-F凝膠的分解率低于9.0%，該條件下凝膠可有效降低丁香精油的揮發損失；當pH=6.0時，3 h Fmoc-F—丁香精油分解率接近36.0%，當pH=5.0時，Fmoc-F凝膠迅速分解，3 h分解率達到100%，該條件下丁香精油被快速釋放到大腸桿菌的菌液中可有效抑制大腸桿菌的生長。說明Fmoc-F凝膠可以有效防止丁香精油常溫下的揮發，并控制精油在酸性條件下有效釋放并發揮抑菌效果。

Fmoc-F；多肽水凝膠；凝膠；丁香精油；控制釋放

丁香精油是由桃金娘科植物丁香提取而來，其主要成分為丁香酚、乙酰丁香酚、水楊酸甲酯、丁香烯等[1]。丁香精油具有抑菌、麻醉、解熱、抗氧化等多種功能[2]。由于其良好的抑菌效果和抗氧化作用，丁香精油被作為食品防腐劑和保鮮劑應用在食品加工中。但因其難溶于水，易揮發，易氧化的缺點，導致丁香精油對食品或果蔬的保鮮期限不長，因而限制了丁香精油的廣泛應用[3]。利用包埋材料對丁香精油進行包埋，可降低其揮發性，增加其抑菌時間和抑菌效果[4]。目前被廣泛研究的包埋材料為環糊精[5]、明膠和阿拉伯膠[6]。但此類包埋材料一般包埋率不高，并且不具有對丁香精油進行控制釋放的作用。

多肽水凝膠是以多肽和水為主要原料形成的凝膠，其生物相容性好，無毒副作用，具有特殊pH響應等特點，近年來被廣泛作為新型藥物載體來研究[7-9]。但目前尚未有將多肽凝膠應用于丁香精油的包埋方面的報道。

Fmoc-F水凝膠是利用Fmoc-F為凝膠因子，在疏水作用、范德華力等作用力的作用下自組裝形成的具有網狀的超分子結構，并束縛水分子形成的固體狀的水凝膠[10]。本研究擬利用Fmoc-F凝膠包埋丁香精油，測定其包埋效率和抑菌效果，研究在大腸桿菌整個生長過程中，Fmoc-F凝膠對丁香精油的控制釋放作用，旨在為精油類物質包埋材料的新方向提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丁香精油：河南焦作市化工三廠；

N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸(Fmoc-F)：純度>99%，吉爾生化有限公司；

大腸桿菌(Escherichiacoli)：南京便診生物科技有限公司；

葡萄糖酸內酯(Gluconolactone，GDL)：純度>99%，美國Sigma-Aldrich公司；

β-環糊精、無水乙醇、酵母提取物、蛋白胨、營養瓊脂、氯化鈉、氫氧化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

紫外可見光光度計：UV1800型，日本島津公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州安泰空氣技術有限公司；

循環水真空泵：SHB-ⅢA型，北京中興偉業儀器有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH-S24S型，金壇市大地自動化儀器廠；

pH計：PHS-3C型，上海儀電科學儀器有限責任公司；

超聲波清洗機：JRC-2000型，濟寧市潤通超聲電子有限公司；

高壓滅菌鍋：G154DWS型，致微儀器有限公司；

微型旋渦混合儀：WH-3型，上海滬西分析儀器廠有限公司；

電熱恒溫培養箱：DH4000BII型，天津市泰斯特儀器有限公司；

恒溫振蕩器：IS-RDD3型，鄭州南北儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 丁香精油標準曲線的測定 用無水乙醇將丁香精油稀釋為0.002%，0.004%，0.006%，0.008%，0.010% 的標準液。以無水乙醇為測定背景液，測定丁香精油標準液在263 nm處的吸光值，以OD263 nm表示(optical density，OD)。試驗平行3次，以丁香精油的體積分數為橫坐標，OD263 nm為縱坐標，繪制丁香精油濃度的標準曲線。

1.3.2β-環糊精—丁香精油包埋物的制備 將6 gβ-環糊精在60 ℃，36 mL的水中緩慢攪拌溶解，將用無水乙醇稀釋20倍的丁香精油以芯/壁材比為1∶8的比例加入到β-環糊精過飽和溶液中，邊加邊攪拌。待有白色沉淀析出后繼續攪拌2 h，停止加熱。冷卻至室溫后放入4 ℃冰箱中靜置24 h，常溫抽濾，無水乙醇沖洗后，40 ℃干燥至恒重，得白色β-環糊精—丁香精油包埋產物。

1.3.3 Fmoc-F凝膠及其丁香精油包埋物的制備

(1) Fmoc-F凝膠的制備：在3 mL超純水中加入42 mg Fmoc-F粉末，混勻后，緩慢加入1 mL 0.1 mmol/L NaOH 溶液，混勻并在40 ℃的水浴鍋中加熱5 min后，加入5 mg GDL，并利用渦旋振蕩器在1 000 r/min下震蕩10 s，室溫下靜置，1 h后形成凝膠。

(2) Fmoc-F凝膠—丁香精油包埋物的制備：在3 mL超純水中加入42 mg Fmoc-F粉末，再加入0.1 mL丁香精油，混勻后，按照1.3.3(1)中后續方法加入1 mL 0.1 mmol/L NaOH 溶液，40 ℃水浴中加熱5 min，加入5 mg GDL，1 000 r/min下震蕩10 s，靜置1 h后形成凝膠。

1.3.4 包埋率的計算 包埋率計算公式[11]：

(1)

表面油含量測定：無水乙醇快速沖洗法間接測定；

產品中總油含量：破壞β-環糊精微膠囊壁材或Fmoc-F凝膠后，用無水乙醇提取丁香精油后進行測定。平行3次，計算平均值。

1.3.5 Fmoc-F多肽水凝膠在不同pH值下的分解率測定

配制不同pH值的磷酸緩沖溶液(10 mmol/L)，pH分別為5.0，5.5，6.0，6.5。取不同pH值的緩沖溶液5 mL，加入4 mL Fmoc-F凝膠溶液制成的凝膠。37 ℃下，在10，40，70，100，140，180 min時取100 μL樣品，稀釋10倍后測定264 nm下Fmoc-F的特征吸光值，表示緩沖液中的Fmoc-F凝膠的分解情況。平行3次，取平均值。

1.3.6 丁香精油及其包埋物的抑菌試驗方法 在LB平板培養基[12]上用濾紙片擴散法[13]檢驗丁香精油對大腸桿菌的抑菌效果。

利用液體LB培養基檢驗Fmoc-F凝膠對丁香精油的控制釋放作用和抑菌效果。具體試驗方法如下：分別向A、B、C、D四個錐形瓶中加入含有1%大腸桿菌懸濁液的LB培養液15 mL。向空白組(A瓶)中加入10.25 mL 無菌水；向控制組(B瓶)中加入250L無菌水，10 mL Fmoc-F凝膠；向對照組(C瓶)中加入250L丁香精油，10 mL Fmoc-F凝膠；向試驗組(D瓶)中加入包埋了250L丁香精油的10 mL 的Fmoc-F—丁香精油凝膠。混勻后，將錐形瓶在210 r/min，37 ℃下培養，在培養的不同時間點取100L樣品在600 nm下測定吸光度，以OD600 nm表示。大腸桿菌的濃度用OD600 nm的值來表示。平行3次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

由圖1可知，丁香精油的濃度與其在263 nm下的吸光度有良好的線性相關性。當丁香精油的濃度在0.002%～0.010%時，丁香精油的濃度與其在263 nm下的吸光度的標準線性方程為：Y=0.014 6+76.107X，線性相關系數R2為 0.996。

2.2 β-環糊精及Fmoc-F凝膠對丁香精油包埋率的比較

按照1.3.2及1.3.3的試驗方法，分別利用β-環糊精和Fmoc-F凝膠對丁香精油進行包埋，根據圖1丁香精油的標準曲線和1.3.4包埋率的計算方法分別計算兩種材料對丁香精油的包埋率，結果見表1。

由表1可知，Fmoc-F凝膠對于丁香精油的包埋率(98.69%)顯著大于β-環糊精對丁香精油的包埋率(18.71%)。文獻[14]中報道利用新的超聲波法制備β-環糊精—丁香精油包埋物的最優方案下，包埋率也只能達到21.5%。根據芯壁材比，可以看出，包埋同樣體積的丁香精油，需要的β-環糊精的質量(8.0 g)遠遠大于所需的Fmoc-F的質量(0.42 g)。因此，相對于β-環糊精，Fmoc-F是一種高效的可應用于丁香精油包埋的新型包埋材料。

圖1 丁香精油濃度的標準曲線

包埋材料包埋率/%芯壁材比(mL/g)Fmoc?F自組裝多肽水凝膠98．691∶0．42β?環糊精18．711∶8

2.3 Fmoc-F凝膠—丁香精油包埋物的形成機制

Fmoc-F可溶解在NaOH溶液中，此時Fmoc-F分子式呈無規則的狀態(圖2A)，當GDL加入后，隨著時間的增長，GDL水解，釋放H+，使溶液的pH值下降，苯丙氨酸得到質子，在靜電作用力和疏水作用力的作用下，Fmoc-F逐漸由無規則的狀態形成有序的β-折疊結構(圖2b)。隨著時間的增長，有序的β-折疊纖維相互纏繞形成多孔的三維網狀結構(圖2c)從而形成凝膠[15]。當Fmoc-F溶液中有丁香精油存在時(圖2a)，由于丁香精油具有疏水性，在Fmoc-F進行有序排列時，由于疏水作用力，丁香精油會排列在Fmoc-F纖維的疏水端附近(圖2b)，當Fmoc-F纖維進一步發生纏繞時，會帶著丁香精油形成立體三維的網狀結構，進而將丁香精油緊緊地包埋在凝膠中(圖2c)。因此利用Fmoc-F可高效包埋丁香精油(包埋率達98.69%)。

2.4 Fmoc-F凝膠在不同pH值的溶液中的分解情況

Fmoc-F凝膠在不同的pH環境下具有不同的響應特性，為了研究Fmoc-F凝膠的這一特性，將Fmoc-F凝膠分別置于不同pH的緩沖液中，并每隔一定的時間測定其分解率，結果見圖3。

檢測成膠后的Fmoc-F凝膠，其pH為7.0。將Fmoc-F凝膠置于pH 6.5的磷酸緩沖溶液中，在前10 min內僅有8.1%的凝膠分解，20～180 min時，分解率基本維持在9%左右。在pH為6.0的磷酸緩沖溶液中，前10 min，凝膠分解率為12.54%；10～140 min時，凝膠分解率有緩慢增長，從12.54%上升到35.67%；140 min后，凝膠分解率沒有明顯上升。進一步降低溶液的pH，在pH為5.5的磷酸緩沖溶液中，前10 min，凝膠分解率為18.62%；10～140 min時，凝膠分解率有顯著增長，上升到52.68%；140 min后，凝膠分解率沒有明顯上升。當溶液pH為5.0時，前10 min，凝膠快速分解，分解率為58.62%；10～140 min時，凝膠分解率不斷增長；140 min時，凝膠基本分解完全，分解率達到100%。

圖2 Fmoc-F凝膠形成示意圖

圖3 Fmoc-F凝膠在不同pH溶液中分解率的變化

上述結果表明，Fmoc-F在堿性條件下呈無定形結構，在中性條件下成膠體，在酸性條件下可以分解。這是由于在中性條件下，Fmoc-F由于疏水作用力和靜電作用力形成三級網絡結構，當pH降低后，Fmoc-F分子帶正電荷，過多的正電荷使分子間斥力增大，導致Fmoc-F纖維與纖維間纏結解體，從而導致Fmoc-F凝膠解體，Fmoc-F分子被釋放到溶液中[10]。

2.5 Fmoc-F凝膠在大腸桿菌菌液中對丁香精油的控制釋放作用

因為Fmoc-F凝膠可在中性條件下成膠，在酸性條件下分解[10]，而大腸桿菌在生長過程中其菌液的pH可以從開始的中性不斷降低到酸性[16]，因此將包埋了大蒜精油的Fmoc-F凝膠加入大腸桿菌菌液中，通過檢測大腸桿菌菌液的pH和OD600 nm值研究Fmoc-F對丁香精油的控制釋放作用及其抑菌效果。

2.5.1 丁香精油抑菌濃度的確定 丁香精油具有廣譜抗菌活性，對大腸桿菌也有顯著的抑菌活性[17]。為了選擇合適的丁香精油濃度，通過濾紙片擴散法，檢測不同濃度的丁香精油對大腸桿菌的抑菌圈的大小，結果見表2。

由表2可知，在0.5%～5.0%濃度范圍中，丁香精油對大腸桿菌均有良好的抑菌效果。當丁香精油濃度為5.0%時，平板上沒有菌體長出；隨著丁香精油濃度的降低，抑菌圈的直徑從(1.80±0.25) cm降到(0.60±0.24) cm。為了在控制釋放研究中，使丁香精油既有明顯的抑菌效果，在不同時間又有比較明顯的差異，在控制釋放的研究中選擇丁香精油的濃度為2.5%。

表2 不同濃度的丁香精油對大腸桿菌的抑菌效果

2.5.2 Fmoc-F對丁香精油的控制釋放作用 由表3可知，當溶液中只有大腸桿菌和Fmoc-F凝膠存在時，大腸桿菌的生長周期并沒有受到影響，其OD值的變化規律與大腸桿菌正常的生長周期一致(A和B組)：即大腸桿菌的生長平緩期(0～2 h)，對數生長期(2～9 h)和穩定期(9～12 h)。在C組溶液中，因為添加了丁香精油，在大腸桿菌的生長平緩期(0～2 h)，大腸桿菌的生長已經受到了丁香精油的抑制，其OD值明顯(0.126)小于同時間的A組菌液(0.289)；在隨后的時間里(2～12 h)，菌液的OD值有緩慢上升，從0.126增長到0.743。這可能是由于一方面，丁香精油具有揮發性，其揮發造成丁香精油在溶液中有效濃度的降低；另一方面，丁香精油在空氣中也容易被氧化[18]，被氧化后的丁香精油的抑菌效果明顯降低。當大腸桿菌的菌液中添加了包埋了丁香精油的Fmoc-F時(D組)，在大腸桿菌生長的平緩期(0～2 h)，大腸桿菌的生長并沒有得到抑制(OD600 nm為 0.283，與A組同時間的OD值接近)，但在之后的時間內(2～12 h)，大腸桿菌的生長受到了明顯抑制，且從3 h開始D組菌液的OD值始終小于A、B、C組同時期的OD值，并保持在0.30以下。這是由于，在培養初期(2 h前)菌液的pH值在6.0以上(D組)，Fmoc-F凝膠的分解率還沒有超過36%(圖3)，大部分丁香精油還被包埋在凝膠中，沒有發揮抑菌作用。但隨著培養時間的增長，菌液pH不斷下降，當菌液pH下降到5.5以下后(4 h后)，Fmoc-F凝膠快速分解，釋放出丁香精油從而起到很好的抑菌效果。由于在培養前期，Fmoc-F凝膠對丁香精油的包埋作用抑制了精油的揮發，因此在后期抑菌過程中，D組中丁香精油的有效濃度大于C組的，從而起到了更好的抑菌效果。

表3 Fmoc-F凝膠—丁香精油包埋產物的抑菌效果

3 結論

利用具有pH響應特性的Fmoc-F凝膠包埋丁香精油，研究了Fmoc-F凝膠對丁香精油的控制釋放作用。結果表明：

(1) Fmoc-F凝膠對丁香精油的包埋率可達98.67%，遠遠大于β-環糊精對丁香精油的包埋率。

(2) Fmoc-F凝膠對丁香精油有延緩其揮發并控制其釋放的作用。在中性pH值下，Fmoc-F凝膠可以很好地保護丁香精油，抑制其揮發；當溶液pH值下降到6.5后，Fmoc-F凝膠開始分解，當溶液pH值下降到5.0左右時，Fmoc-F凝膠會快速分解，釋放出包埋的丁香精油。

利用Fmoc-F凝膠對丁香精油控制釋放的特性，可以將Fmoc-F凝膠對丁香精油的包埋產物應用到食品防腐領域中，該凝膠可以有效延緩丁香精油的揮發，并當在食品中致病菌增多，環境pH下降時有效釋放丁香精油，從而發揮長效、高效的抑菌作用。

[1] 劉曉麗, 鐘少樞, 于泓鵬, 等. 微波法和水蒸氣蒸餾法提取丁香精油的研究[J]. 食品與機械, 2012, 28(4): 110-112.

[2] FRIEDMAN M, HENIKA P R, LEVIN C E, et al. Antibacterial activities of plant essential oils and their components againstEscherichiacoliO157:H7 and Salmonella enterica in apple juice[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2004, 52(19): 6 042-6 048.

[3] ESPINA L, GARCA-GONZALO D, LAGLAOUI A, et al. Synergistic combinations of high hydrostatic pressure and essential oils or their constituents and their use in preservation of fruit juices[J]. International Journal of Food Microbiology, 2013, 161(1): 23-30.

[4] 郝喜海, 孫淼, 鄧靖, 等. 丁香精油-β-環糊精包合物的緩釋抗菌性能[J]. 食品科學, 2012, 33(11): 86-88.

[5] 孫淼. 基于丁香精油/β-環糊精包合物的聚乙烯醇抗菌膜的制備及性能研究[D]. 株洲: 湖南工業大學, 2012: 21.

[6] 張慧蕓, 郭新宇. 丁香精油-殼聚糖復合可食性膜對生肉糜保鮮效果的影響[J]. 食品科學, 2014, 35(18):196-200.

[7] KOUTSOPOULOS S, UNSWORTH L D, NAGAI Y, et al. Controlled release of functional proteins through designer self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffold[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(12): 4 623-4 628.

[8] ALTUNBAS A, LEE S J, RAJASEKARAN S A, et al. Encapsulation of curcumin in self-assembling peptide hydrogels as injectable drug delivery vehicles[J]. Biomaterials, 2011, 32(25): 5 906-5 914. [9] LIANG Gao-lin, YANG Zhi-mou, ZHANG Rong-jun, et al. Supramolecular hydrogel of aD-amino acid dipeptide for controlled drug release in vivo[J]. Langmuir, 2009, 25(15): 8 419-8 422.

[10] SINGH V, SNIGDHA K, SINGH C, et al. Understanding the self-assembly of Fmoc-phenylalanine to hydrogel formation[J]. Soft Matter, 2015, 11(26): 5 353-5 364.

[11] 范方宇, 蔣生, 旺曹穎. 復凝聚法制備茶油微膠囊[J]. 食品與機械, 2016, 32(7): 181-185.[12] 王升智, 高波, 周智慧, 等. 重組大腸桿菌DH5α生長曲線的測定[J]. 黑龍江畜牧獸醫, 2010(21): 96-98.

[13] 王步江, 劉金福, 樊秀花, 等. 肉桂精油抑菌活性研究[J]. 食品與機械, 2011, 27(6): 166-167.

[14] 韓春然, 張靜, 李煜. 超聲波法制備丁香精油-β-環糊精微膠囊[J]. 食品科學, 2013, 34(22): 97-100.

[15] SUTTON S, CAMPBELL N L, COOPER A I, et al. Controlled release from modified amino acid hydrogels governed by molecular size or network dynamics[J]. Langmuir the Acs Journal of Surfaces & Colloids, 2009, 25(17): 10 285-10 291.

[16] 劉寧, 姚元鋒, 齊瑛, 等. 強化工業大腸桿菌生長特性的研究[J]. 科學技術與工程, 2013, 13(5): 1 223-1 228.

[17] MICHIELS J, MISSOTTEN J, FREMAUT D, et al. In vitro, dose-response of carvacrol, thymol, eugenol and trans -cinnamaldehyde and interaction of combinations for the antimicrobial activity against the pig gut flora[J]. Livestock Science, 2007, 109(1/3): 157-160.[18] CUI Hai-ying, LI Wei, LI Chang-zhu, et al. Intelligent release of cinnamon oil from engineered proteoliposome via stimulation of Bacillus cereus, protease[J]. Food Control, 2016, 67: 68-74.

Fmoc-F hydrogel for clove oil controlled-release

ZHANG Lin1,2ZHOUTian-xiao1WANGBen1HAOYa-yan1LUJun1,2

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha,Hunan410004,China; 2.NationalEngineeringLaboratoryofRiceandBy-productDeepProcessing,Changsha,Hunan410004,China)

Fmoc-F was utilized for embedding of clove oil. The results demonstrated that Fmoc-F hydrogel could prevent the volatilization and achieve the controlled-release of clove oil. The loading efficiency of Fmoc-F gel was 98.69%, much higher than the one achieved withβ-cyclodextrin. When pH was above 6.5, the decomposition rate of Fmoc-F hydrogel was less than 9.0%, and this could prevent the volatilization of clove oil. When pH was adjusted from 6.5 to 6.0, the structure of hydrogel began to disaggregate, and the decomposition rate was around 36%. When pH was below 5.0, the hydrogel disaggregated completely. Then the clove oil could be released completely to inhibit the growth ofE.Coli. Thus, Fmoc-F based hydrogel could prevent the volatilization and achieve the controlled-release of clove oil in an acidic condition.

Fmoc-F; gel; clove oil; controlled-release

湖南省自然科學基金項目(編號：2015JJ3177)；湖南省教育廳一般項目(編號：14C1184)；湖南省大學生研究性學習和創新性實驗計劃項目(編號：湘教通2015)；中南林業科技大學大學生研究性學習和創新性實驗計劃項目(編號：2016)

張琳，女，中南林業科技大學講師，博士。

陸俊(1978—)，男，中南林業科技大學副教授，博士。

E-mail: 690056167@qq. com

2016-05-09