阿司匹林腸溶片2015年藥典微生物限度檢查法的建立及方法學(xué)驗(yàn)證

（云南省藥物研究所 云南 昆明 650111)

杜春華 李東嫻 和東陽(yáng) 普冰清 牛延菲 游燕（通訊作者）

阿司匹林，主要成分為2-（乙酰氧基）苯甲酸，最早用于解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎，在臨床上，能夠?qū)τ诟忻鞍l(fā)熱、頭痛牙痛以及關(guān)節(jié)風(fēng)濕疾病等患者起到較好的鎮(zhèn)痛效果，類別為：解熱鎮(zhèn)痛、非甾體抗炎藥、抗血小板聚集藥[1]-[4]。根據(jù)2015版藥典要求，為了確認(rèn)所采用的方法適合用于某制劑的微生物限度檢查，必須對(duì)相應(yīng)檢驗(yàn)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。李秋菲等[5]按照中國(guó)藥典2005年版一部對(duì)阿司匹林緩釋片的微生物限度建立并驗(yàn)證了檢查方法，發(fā)現(xiàn)其具有很強(qiáng)的抑菌作用，現(xiàn)在筆者通過(guò)2015年新版藥典建立阿司匹林腸溶片微生物限度檢查方法及方法驗(yàn)證。

1.儀器與材料

1.1 儀器

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：GSP-9160MBE，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），生化培養(yǎng)箱（型號(hào)：LRH-150，上海一恒科學(xué)儀器有限公司），勻漿儀（型號(hào)：JT-C，漯河海德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），二級(jí)生物安全柜（型號(hào)：BSC-1100ⅡB2-X，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）

1.2 試藥

1.2.1 供試品 阿司匹林腸溶片。

1.2.2 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號(hào)170310；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)1706282；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)170608；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，批號(hào)3106032；

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)160303；麥康凱瓊液體培養(yǎng)基，批號(hào)161228；pH 7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，批號(hào)1705184。（沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基來(lái)源于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，其余培養(yǎng)基均來(lái)源于北京三藥科技開發(fā)公司。）

1.2.3 pH試紙 pH精密試紙（6.4-8.0）、pH廣泛試紙（1-14）均購(gòu)于上海三愛思試劑有限公司。

表1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

表2 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

1.3 試驗(yàn)菌株

銅綠假單胞菌［CMCC(B)10104］、金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］、黑曲霉［CMCC(F)98003］、白色念珠菌［CMCC(F)98001］，上述5種菌種都來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2.方法與結(jié)果

阿司匹林腸溶片按《中國(guó)藥典》2015版規(guī)定，需檢查需氧菌總數(shù)，霉菌和酵母菌總數(shù)，控制菌檢查大腸埃希菌。

2.1 菌液制備

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的的制備參照新版藥典通則1105。制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液。

2.2 供試液制備

取供試品10g，放入已滅菌的勻漿杯中，加入pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液50ml，勻漿至供試品均勻分散，用30%碳酸鈉溶液，廣泛和精密pH試紙調(diào)節(jié)供試品溶液pH至6.7，然后加緩沖液補(bǔ)足至100mL，即得1∶10的供試液。再逐級(jí)稀釋為1∶20供試液。

3.方法適用性試驗(yàn)

3.1 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

試驗(yàn)組：取1∶20供試液9.9ml于滅菌試管中，加入制備好的5種陽(yáng)性菌液0.1ml，使其終濃度為每1ml含菌落數(shù)小于100cfu的菌液，從試管中吸取1ml注入滅菌平皿中，立刻傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中30～35℃培養(yǎng)48h。每個(gè)菌種平行制備2個(gè)平皿，測(cè)定試驗(yàn)組的菌落數(shù)。

供試品對(duì)照組：取1∶20供試液9.9ml于滅菌試管中，加緩沖液0.1ml，后續(xù)操作同試驗(yàn)組。

菌液對(duì)照組：取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9ml于滅菌試管中，加入制備好的5種陽(yáng)性菌液0.1ml，其余按試驗(yàn)組操作。

中和劑組：取30%碳酸鈉稀釋劑1ml，平行制備2個(gè)平皿，倒入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基混勻。

中和劑對(duì)照組：取30%碳酸鈉稀釋劑溶液9.9ml，加入試驗(yàn)菌懸液0.1ml，搖勻，其余按試驗(yàn)組操作。

陰性對(duì)照組：取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液1ml至平皿中，平行制備2個(gè)平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。

計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)/菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)；中和劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)，結(jié)果見表1。

3.2 霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

取1∶10供試液9.9ml于滅菌試管中，加入制備好的白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1ml，其余操作同需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，培養(yǎng)基為沙氏葡萄糖瓊脂，培養(yǎng)溫度20～25℃，培養(yǎng)時(shí)間為72h，結(jié)果見表2。

3.3 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

試驗(yàn)組：取調(diào)過(guò)pH值的1∶10的供試液10mL至100mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，再加入小于100cfu 的大腸埃希菌 1mL，其余操作和結(jié)果判斷按2015版藥典通則1106進(jìn)行。陰性對(duì)照組：取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 1mL 按大腸埃希菌檢查法操作。試驗(yàn)組應(yīng)檢出大腸埃希菌，陰性對(duì)照組不得檢出。試驗(yàn)結(jié)果表明，大腸埃希菌檢查可采用常規(guī)法。

4.討論

新版藥典要求將試驗(yàn)菌加入供試液中，進(jìn)行挑戰(zhàn)試驗(yàn)，從而更加客觀地考察了微生物在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中所受的影響[6]。本研究采用30%碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)供試液的pH值呈中性后，取試驗(yàn)要求濃度的供試液9.9ml于滅菌試管中，加入制備好的試驗(yàn)菌菌液0.1ml，使其終濃度為每1ml含菌落數(shù)小于100cfu的菌液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，通過(guò)三次驗(yàn)證的試驗(yàn)結(jié)果表明，藥典規(guī)定驗(yàn)證用5種試驗(yàn)菌株的比值均在0.5～2范圍內(nèi)，阿司匹林腸溶片微生物限度檢查可依據(jù)上述試驗(yàn)方法進(jìn)行。

《中國(guó)藥典》2015年版提出[7]，若試驗(yàn)中使用了中和劑，那么應(yīng)設(shè)立中和劑對(duì)照組，以此來(lái)確認(rèn)所使用的中和劑不影響污染微生物的生長(zhǎng)。本研究中采用了30%碳酸鈉溶液作為中和劑，用于調(diào)節(jié)其pH值，可以消除供試品的抑菌性。筆者在做試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，做了中和劑組和中和劑對(duì)照組，且二者的菌落數(shù)比值在0.5～2之間，說(shuō)明30%碳酸鈉稀釋劑不影響污染微生物的生長(zhǎng)。

[1] CHAN T-A,MORIN P J,VOGELSTEIN B,et al. Mechanisms underlying nonsteroidal antiinflammatory drug-mediated apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci US A,1998, 95(2):681-686.

[2]李才正，苗佳.阿司匹林的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].華西醫(yī)學(xué)，2012，27（7）:988-991.

[3]許桂萍，馬熱也木·克日木.阿司匹林的藥理特性及其臨床應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)村衛(wèi)生2015(14):28-29.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].二部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015:545.

[5]李秋菲，周志云，羅世書.阿司匹林緩釋片微生物限度檢查方法驗(yàn)證[J].安徽醫(yī)藥，2008，12(12):1240-1241.

[6]徐曉潔，冷佳蔚，王志宏，丁勃.具有抗菌活性的中藥固體制劑微生物限度檢查計(jì)數(shù)方法研究[J].中國(guó)藥事，2015，29（9）:946-950.

[7]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].四部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015:142.