牦牛肉宰后成熟過程中熱休克蛋白27表達量與食用品質的相關性分析

李 婕，羅天林，師希雄，*，韓 玲，*，余群力，馬君義

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.青海百德投資發展有限公司，青海 西寧 810007）

牦牛肉宰后成熟過程中熱休克蛋白27表達量與食用品質的相關性分析

李 婕1，羅天林1，師希雄1，*，韓 玲1，*，余群力1，馬君義2

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.青海百德投資發展有限公司，青海 西寧 810007）

為研究牦牛肉宰后成熟過程中熱休克蛋白27（heat shock protein 27，Hsp27）的變化及其與食用品質的相關性，測定了5 頭青海大通母牦牛背最長肌肉成熟過程中色度L*、a*、b*值、pH值、剪切力、蒸煮損失以及Hsp27的表達量，進一步研究了Hsp27與肉品質的相關性。結果表明：Hsp27表達量總體呈降低的趨勢，宰后0～48 h Hsp27表達量顯著降低（P＜0.05），72～120 h Hsp27表達量顯著升高，至168 h又顯著降低（P＜0.05）；Hsp27表達量與a*值成顯著正相關（P＜0.05），與b*值成極顯著負相關（P＜0.01），與pH值成極顯著正相關（P＜0.01）。證明Hsp27與牦牛肉食用品質之間存在相關性。

牦牛肉；宰后成熟；熱休克蛋白27；食用品質；相關性分析

青海大通牦牛是世界上第一個培育的牦牛品種，其肌肉大理石紋分布廣，風味和肉色較好，但嫩度較差［1］，牛肉嫩度的改善一直是肉品科學工作者的研究熱點。熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是指機體受到外界環境刺激時誘導發生應激反應而合成的幾族蛋白質［2］。Hsp27是小分子熱休克蛋白（sHSPs）中的一種，是機體中細胞維持和修復的重要成分，具有可充當分子伴侶、調節肌動蛋白的聚合，并能夠調節中間體細絲間的相互作用，還可抑制應激誘導的細胞凋亡，維持肌原纖維結構的穩定［3-4］等生物學功能。動物宰后放血缺氧的狀態能夠刺激Hsp27的表達，但目前Hsp27與牦牛肉食用品質之間的相關性研究還未見報道。

Lomiwes等［5］用免疫沉淀法研究安格斯小母牛背最長肌中Hsp27等幾種蛋白與μ-鈣蛋白酶之間的關系時發現，Hsp27在肉中表達量的下降有利于肌動蛋白與肌球蛋白的水解，導致了肉嫩度增加；且Hsp27在較嫩的肉樣中含量較低。Bernard等［6］研究表明，Hsp27在夏洛萊牛胸部肌肉中表達量的下調能夠改善肉的嫩度、多汁性、風味。然而Morzel等［7］報道，Hsp27可維持肌原纖維的穩定性，其表達量與牛肉的韌性成負相關。張淼［8］研究發現運輸應激可導致皮特蘭與二花臉雜交二代豬肉的剪切力值和a*值隨時間總體呈現下降的趨勢，L*值和b*值顯著升高，在此過程中Hsp27的表達量與對照組相比呈下降趨勢，即Hsp27與豬肉韌性、a*值成正相關，而與L*值和b*值成負相關。總之，關于Hsp27對肉品質，尤其是對嫩度影響的報道不一致。

本實驗以5 頭2～4 歲青海大通母牦牛背最長肌肉為研究對象，對其宰后成熟過程中0、24、48、72、120、168、192 h的色度、pH值、剪切力、蒸煮損失以及Hsp27表達量進行測定，分析了大通牦牛肉的食用品質，同時，研究Hsp27表達量的變化及其與食用品質的關系，以期為Hsp27對牦牛肉食用品質影響的機理研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

參考國外對動物福利的要求，屠宰操作嚴格按照國內標準化方法，屠宰時無應激反應，保證宰前牦牛的健康狀況良好，宰后熱應激波動幅度較小。選取年齡2～4 歲、自然放養、發育正常、健康無病、體質量相近的5 頭青海大通母牦牛背最長肌肉作為實驗材料。

RIPA組織/細胞裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF） 北京索萊寶科技有限公司；牛Hsp27酶聯免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 美國Abnova公司；DC蛋白測定試劑盒 美國Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設備

Testo 205便攜式pH計 德圖儀表有限公司；CR-10型色差儀 日本柯尼卡美能達公司；C-LM4型數顯式肌肉嫩度儀 東北農業大學工程學院；TGL-16M高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀有限公司；FA2004B電子天平上海佑科儀器有限公司；HHS（數顯式）型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；iMark全自動酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗設計

將選取的牦牛背最長肌肉切割成150 g左右的肉塊，共7 份，用聚氯乙烯保鮮袋包裝后在0～4 ℃條件下成熟0、24、48、72、120、168、192 h，在不同的時間點分別取樣，一部分樣品用于測定肉品質，另一部分保存于-80 ℃冰箱中用于Hsp27表達量的測定。

1.4 實驗方法

1.4.1 pH值測定

采用Testo 205便攜式pH計，用蒸餾水沖洗肉樣上的血漬，并用干凈濾紙吸干表面殘留水分，隨機選擇3 個不同部位的肉樣進行pH值測定，取其平均值。

1.4.2 色度測定

采用CR-10色差儀進行測定。用蒸餾水沖洗肉樣上的血漬并用干凈濾紙吸干表面殘留水分進行亮度（L*）值、紅度（a*）值、黃度（b*）值測定，每個肉樣選取3 處測定求其平均值。

1.4.3 蒸煮損失測定

選取體積不小于6 cm×3 cm×3 cm的肉樣，修整去除肉塊表面的脂肪和結締組織，稱質量（m1）放入80 ℃恒溫水浴鍋中加熱，用熱電耦溫度計檢測到肉樣中心溫度至75 ℃時取出冷卻至中心溫度達室溫，用濾紙吸去肉樣表面多余水分稱質量（m2）。蒸煮損失計算公式如下。

1.4.4 剪切力測定

參照田甲春等［9］的方法，將測定蒸煮損失后的肉樣沿肌纖維方向用直徑1.27 cm采樣器平行取3個肉柱，然后用C-LM4型數顯式肌肉嫩度儀V型活動剪切刀架測定其剪切力，3 次測定取其平均值。

1.4.5 Hsp27表達量的測定

1.4.5.1 蛋白樣品的制備

參考Salokhe等［10］的方法并改進，將保存于-80 ℃冰箱中的肉樣組織取出，于4 ℃恒溫恒濕箱解凍至半凍狀態，除去表皮脂肪和筋膜，切成小塊。準確稱取150 mg樣品置于研缽中，加入1.5 mL RIPA組織裂解液，15 μL PMSF充分研磨，將研磨后的組織液轉移到玻璃勻漿器中勻漿1 min，以充分裂解組織細胞，將勻漿液移至EP管中離心（12 000×g，4 ℃，20 min），離心完畢后將上清液移至另一EP管中，參考Lowry等［11］的方法，取適量上清液采用DC蛋白測定試劑盒測定蛋白質量濃度，剩余上清液于-80 ℃保存備用。

1.4.5.2 Hsp27的定量測定

標準曲線的繪制：在Excel工作表中，以Hsp27標準品質量濃度為橫坐標，光密度（OD450nm）值為縱坐標繪制出標準曲線，得到回歸方程為y=0.145 9x+0.071 3（R2=0.997 6）。

參考Yu Jimian等［12］的方法采用ELISA分析法檢測Hsp27表達量。將提前保存于4 ℃冰箱中的試劑盒取出，室溫下放置30 min后，對Hsp27進行ELISA檢測。用酶標儀測定OD450nm值，代入回歸方程計算樣品質量濃度。

Hsp27的表達量用下面公式進行標準化。

1.5 數據分析

用Microsoft Office Excel 2013軟件繪制折線圖，并用IBM SPSS Statistics 19.0統計分析軟件進行方差分析和相關性分析，用Duncan's法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 牦牛肉成熟過程中pH值的變化

pH值反映機體生成的酸性物質（主要是乳酸）含量。如圖1所示，隨著成熟時間的延長，宰后初期0～24 h牦牛肉的pH值顯著降低，可能會影響肉的其他品質，因此，宰后初期肉的pH值可用來判斷應激并預測肉品質［13］，72 h后有緩慢回升趨勢。原因可能是剛屠宰后糖原被分解產生大量乳酸使得pH值下降較快，當pH值降低到一定程度后，H+濃度大幅度升高使得與糖酵解有關的酶被鈍化，隨著時間延長，糖原含量逐漸降低，酵解速率和程度逐漸減小，pH值逐漸回升［9］。

2.2 牦牛肉成熟過程中色度的變化

由圖2可知，宰后成熟過程中牦牛肉L*、a*及b*值均有一定的變化。L*值呈先升高后降低趨勢，72 h時達到最大值。宰后成熟過程中，肌肉內部水分向外滲出，堆積在肉塊表面，從而增強了光的反射，導致L*值增加。a*值在整個成熟期間呈先降低后增加趨勢，72 h時達到最小值。這與田甲春［9］對牦牛肉宰后成熟機理與肉用品質研究的結果相似。a*值的變化與肌紅蛋白的含量和化學狀態密切相關，宰后成熟過程肉長時間和空氣接觸，肌紅蛋白逐漸被氧化成高鐵肌紅蛋白，a*值降低。b*值持續上升可能是肌肉與氧氣充分接觸后，肌肉中的脂肪被氧化所致［14］。

2.3 牦牛肉成熟過程中蒸煮損失的變化

由圖3可知，牦牛肉宰后成熟過程中蒸煮損失呈現先顯著增加后降低的趨勢，72 h達最大值。蒸煮損失可以反映肌肉的持水力，pH值是影響持水力的關鍵因素之一。肉的pH值決定蛋白質所帶電荷數的多少，0～72 h，pH值顯著下降接近蛋白質的等電點，蛋白質表面所帶電荷減少，對水的吸附能力也就減弱，同時蛋白質分子間靜電斥力越小，其網狀結構皺縮，分子間隙變小，持水力愈差，蒸煮損失隨之增大［15］。

2.4 牦牛肉成熟過程中剪切力的變化

肉的嫩度是消費者選擇產品的重要品質指標之一，而剪切力值則是反映肉嫩度的指標。由圖4可知，剪切力值呈先顯著增大后減小的趨勢。肉在成熟初期，肌肉中的重要蛋白質如肌球蛋白、肌動蛋白等達到等電點；同時，肌凝蛋白凝固、肌纖維硬化，肌肉進入僵直階段，在極限pH值時肉嫩度最差。隨著成熟過程的進行，ATP含量急劇下降和乳酸濃度的增大，使肌質網機能被破壞，Ca2+從網內釋放出，引起肌漿中Ca2+濃度增高，高濃度Ca2+長時間作用于Z線，使Z線蛋白質變性而脆弱，會因沖擊和牽引而發生斷裂；同時，鈣激活中性蛋白酶（Ca-activated sarcoplasmic factor，CASF）被激活，作用于Z線而促進了Z線的斷裂。肌原纖維斷裂使肉變得柔嫩多汁［15］。

2.5 Hsp27表達量的變化

由圖5可知，隨著牦牛肉成熟過程的進行，Hsp27表達量在48 h內顯著下降（P＜0.05），至120 h時有短暫的顯著回升趨勢，之后又顯著降低（P＜0.05），168 h后下降趨勢緩慢。Lomiwes等［16］研究發現，牛背最長肌肉屠宰后置于-1.5 ℃成熟，Hsp27質量濃度呈總體下降趨勢，在第7～14天顯著增大，隨后的第14～28天表達量顯著降低。這與本實驗中的變化趨勢基本一致。原因可能是，一方面，宰后0～48 h，外界氧氣和營養供應的終止導致細胞產生不可避免的凋亡現象［17］。Hsp27即刻對細胞凋亡產生應激反應，以維持細胞內平衡和細胞穩態。Hsp27作為分子伴侶，通過結合受損的以及錯誤折疊的蛋白質來保護細胞內蛋白防止不可逆損傷或聚集［18］，最終導致組織中Hsp27質量濃度下降。另一方面，蛋白質組學研究認為，宰前應激和宰后因素導致Hsp27在應激牛肉宰后過程中呈正調節［19］，宰后供能不足和糖原的大量消耗，引起牛肉pH值下降［9］，導致Hsp27因接近其等電點而沉淀，變得不可溶［20］。隨后，牛肉pH值逐漸回升，Hsp27的溶解抑制得以解除，在72～120 h過程中出現了短暫的顯著回升趨勢（P＜0.05）。

2.6 HSP27表達量與肉品質的相關性分析

由表1可知，在成熟過程中，Hsp27表達量與牦牛肉L*值、剪切力值和蒸煮損失成負相關，與a*值成顯著正相關（P＜0.05），與b*值成極顯著負相關（P＜0.01），與pH值成極顯著正相關（P＜0.01）。Hsp27具有維持肌原纖維蛋白穩定，保護肌動蛋白細絲、肌間線蛋白的功能，Hsp27表達的下調增加了肌動蛋白的降解，肌肉中肌原纖維完整性的衰減和其內部Z線和I帶連接處的破壞，進而導致肌原纖維超微結構發生變化，肉嫩度增大［5］。同時，細胞凋亡與細胞縮水和失水密切相關，HSPs因其對細胞凋亡和細胞膜的調控功能，對保水性產生一定影響［21］。

Minos等［22］用雙向電泳和質譜來確定與剪切力值相關的幾種蛋白質的表達時指出，印度牛屬內諾爾牛Hsp27的表達量與肉的嫩度成正相關。然而，Balan等［23］研究表明，小公牛背最長肌中Hsp27表達量與肉嫩度成負相關，是因為Hsp27降解而失去保護肌原纖維蛋白、肌間線蛋白等免受不可逆降解的能力，結果是蛋白水解酶可以進一步降解肌原纖維蛋白，肉嫩度增大；并指出Hsp27降解程度可用來反映肌原纖維蛋白降解程度。本實驗中Hsp27與剪切力成負相關，與Minos［22］研究結果一致，但數據分析表明，相關性差異并不顯著（P＞0.05），可能是由動物種類差異造成，也可能是飼養環境等差異所引起。Kim等［24］用二維電泳和光譜測定法研究韓國本地牛時發現，Hsp27質量濃度與品質較差的牛背最長肌肉L*、a*、b*值等均成負相關。本實驗結果顯示Hsp27與L*值成負相關，與a*值成顯著正相關（P＜0.05），與b*值成極顯著負相關（P＜0.01），這與張淼［8］研究結果基本一致，原因是宰前運輸不僅加劇了ATP的消耗，肌肉中能量水平的降低激活了AMP蛋白激酶，使肉產生肌肉蒼白、質地松軟、表面肉汁滲出（pale， soft， exudative，PSE）特征。Hsp27與pH值成極顯著正相關（P＜0.01），與其他研究基本一致［16，23，25］，主要是因為宰后外界環境變化引起的多種因素包括動物營養、氣候和季節、運輸和心理應激，均可能對肌肉中糖原含量產生一定影響。熱應激、氧化應激、細菌感染和供能受限都會導致骨骼肌中pH值變得不正常，同時能刺激熱休克蛋白的表達［25］。

3 結 論

青海大通牦牛背最長肌肉宰后成熟過程中，放血缺氧條件刺激了Hsp27的表達，ELISA方法檢測到Hsp27表達量在最初的0～48 h顯著下降（P＜0.05），72～120 h顯著回升之后，至168 h呈顯著降低趨勢（P＜0.05），168 h后下降趨勢緩慢。相關性分析表明：Hsp27的表達量與a*值成顯著正相關（P＜0.05），與b*值成極顯著負相關（P＜0.01），與pH值成極顯著正相關（P＜0.01）。

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Correlation Analysis between Heat Shock Protein 27 Expression and Eating Quality during Postmortem Aging of Yak Meat

LI Jie1， LUO Tianlin1， SHI Xixiong1，*， HAN Ling1，*， YU Qunli1， MA Junyi2
（1. College of Food Science and Engineering， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China；2. Qinghai Baide Investment Co. Ltd.， Xining 810007， China）

The objective of this study was to evaluate the relationship between the expression of heat shock protein 27 （Hsp27）and eating quality of yak meat during postmortem aging. Loins （M. longissimus dorsi） from female Datong yak in Qinghai were analyzed for changes in chromaticity， pH， shear force， cooking loss and Hsp27 concentration during postmortem aging， and the relationship between Hsp27 and eating quality was determined. The results showed that Hsp27 concentration generally tended to decrease during postmortem aging with a significant reduction observed during the first 48 h postmortem（P < 0.05）， followed by an increase from 72 to 120 h at first and then a significant decrease until 168 h at last （P < 0.05）. Statistical analysis indicated that Hsp27 level had a significantly negative correlation with b* value （P < 0.01）， while it was significantly positively correlated with a* value （P < 0.05） and pH （P < 0.01）， respectively. In a word， these results suggested that Hsp27 and yak meat eating quality are highly correlated.

yak meat； postmortem aging； heat shock protein 27 （Hsp27）； eating quality； correlation analysis

10.7506/spkx1002-6630-201609004

TS251.1

A

1002-6630（2016）09-0018-05

李婕， 羅天林， 師希雄， 等. 牦牛肉宰后成熟過程中熱休克蛋白27表達量與食用品質的相關性分析［J］. 食品科學， 2016，37（9）： 18-22. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609004. http：//www.spkx.net.cn

LI Jie， LUO Tianlin， SHI Xixiong， et al. Correlation analysis between heat shock protein 27 expression and eating quality during postmortem aging of yak meat［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 18-22. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201609004. http：//www.spkx.net.cn

2015-06-28

國家自然科學基金地區科學基金項目（31460433）；甘肅省高等學校科研項目（2014B-047）；國家現代農業（肉牛牦牛）產業技術體系建設專項（CARS-38）；甘肅省自然科學基金項目（1308RJ2A268）

李婕（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品工程。E-mail：ljgsau@163.com

*通信作者：師希雄（1977—），男，講師，博士，研究方向為畜產品加工。E-mail：sxix77@163.com韓玲（1963—），女，教授，博士，研究方向為畜產品加工及貯藏。E-mail：hanl@gsau.edu.cn