不同溫度下亞麻籽膠對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響及機制

潘麗華，馮美琴，孫 健，*，徐幸蓮，周光宏

（1.南京農業大學食品科技學院，國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095；2.金陵科技學院動物科學與技術學院，江蘇 南京 210038）

不同溫度下亞麻籽膠對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響及機制

潘麗華1，馮美琴2，孫 健1，*，徐幸蓮1，周光宏1

（1.南京農業大學食品科技學院，國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095；2.金陵科技學院動物科學與技術學院，江蘇 南京 210038）

本實驗研究了不同加熱溫度下，添加亞麻籽膠對肌原纖維蛋白保水性、凝膠強度、流變特性、二級結構、微觀結構的影響及其作用機制。結果表明，隨著溫度升高，肌原纖維蛋白凝膠保水性顯著下降（P＜0.05），凝膠強度顯著上升（P＜0.05），加熱溫度高于50 ℃時添加亞麻籽膠顯著提高了肌原纖維蛋白凝膠保水性（P＜0.05），同時顯著降低了凝膠強度（P＜0.05）；拉曼光譜結果表明隨著溫度從30 ℃上升至80 ℃，凝膠α-螺旋含量顯著下降，β-折疊含量顯著上升；添加亞麻籽膠使得肌原纖維蛋白存在α-螺旋含量下降，β-折疊含量上升現象，影響凝膠的形成及性質。流變學特性結果顯示高于50 ℃時添加亞麻籽膠后肌原纖維蛋白儲能模量G'下降。從微觀結構發現，添加亞麻籽膠后肌原纖維蛋白在50 ℃出現更多凝膠孔洞，且在70、80 ℃時形成的凝膠三維網絡結構更為致密均一。

溫度；肌原纖維蛋白；亞麻籽膠；二級結構；凝膠性質；凝膠機制

為了改善肉制品品質，在生產加工過程中，常添加具有乳化、增稠、保水等性質的親水膠體，如卡拉膠、海藻膠等，可改善肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）凝膠特性。亞麻籽膠（flaxseed gum，FG）是一種具有弱凝膠性、乳化性、親水性等性質的天然親水膠體［1］。在食品工業中可代替果膠、阿拉伯膠、海藻膠等。研究表明，亞麻籽膠添加到肉制品中可以減少蒸煮過程中脂肪和肉類風味損失［2-3］。Chen Haihua等［4］對其與肉蛋白間相互作用研究結果表明添加亞麻籽膠能夠增加蛋白熱變性溫度，增加其保水性和硬度。Sun Jian等［5］研究表明亞麻籽膠可以顯著增加肌原纖維蛋白凝膠保水性，且它們間主要作用為靜電作用及氫鍵作用。目前研究僅限于單一理化條件下亞麻籽膠與肌原纖維蛋白間的影響，但是凝膠過程是一個蛋白變性和蛋白相互凝集形成三維網狀結構的動態的過程，還會受到外界環境的影響，如pH值、離子強度、加熱溫度等的影響［6］。

加熱是肌原纖維蛋白分子在pH值高于等電點5.3條件下發生變性、展開、折疊形成凝膠的重要方式。Sharp等［7］通過透射電鏡觀察不同加熱溫度（30～60 ℃）加熱30 min對肌球蛋白凝膠形成的影響，得出50 ℃加熱后肌球蛋白尾部難以辨認，60 ℃加熱后尾部全部消失，形成復雜的聚集結構。而加熱溫度為30 ℃和35 ℃時，僅有少數肌球蛋白通過頭頭聚集形成二聚體；40 ℃加熱后，肌球蛋白分子大部分尾巴成輻射狀向外散布的聚合物。Ishioroshi等［8］也指出pH值為6.0時，肌球蛋白的熱誘導最佳溫度為60～70 ℃。

本實驗研究不同加熱溫度下，添加亞麻籽膠對肌原纖維蛋白保水性、凝膠強度、流變特性、二級結構和微觀結構的影響及其作用機制，以期為亞麻籽膠在肉制品中的應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背最長肌：購自雙匯冷鮮肉專柜，宰后48 h內進行實驗。

亞麻籽膠 新疆綠旗企業（集團）生物科技有限公司；氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（生化試劑）、乙二醇雙（2-氨基乙醚）四乙酸（ethylenebis（oxyethylenenitrilo）tetraacetic acid，EGTA）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、Triton X-100（均為分析純） 南京化學試劑設備有限公司。

1.2 儀器與設備

8010ES型實驗室用攪拌機 美國Waring公司；Ultra-Turrax T25 basic數顯型高速分散機 德國IKA公司；78-1型磁力加熱攪拌器 常州金壇市杰瑞爾電器有限公司；AR64型高速冷凍離心機 美國Beckman-Coulter公司；M2e多功能酶標儀 美國MD公司；AUY120型天平 日本島津公司；ZKSY-600智能恒溫水箱 南京科爾儀器設備有限公司；TA-XT2i質構儀 英國Stable Micro Systems公司；JY Labram HR 800顯微激光拉曼光譜儀 法國Jobin-Yvon公司；MCR301流變儀 奧地利Anton Paar公司；S-3000N掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

參照Han Minyi等［9］的方法并進行改進，在4 ℃條件下進行。剔除肌肉的結締組織和脂肪后稱取100 g，用攪拌機低檔攪碎，攪7 s，間隔10 s重復兩次，間隔時用冰浴以防止蛋白質變性及鉆頭發熱；加入4 倍體積的提取液（100 mmol/L KCl，20 mmol/L K2HPO4/KH2PO4，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，pH 7.0），1 000×g離心10 min后棄上清液收集沉淀，重復兩次，兩次離心之間用勻漿機分散約30 s。沉淀重新分散在4 倍體積的提取液，添加質量分數1% Triton X-100，玻棒攪動10 min后1 500×g、4 ℃離心10 min后棄上清液收集沉淀。沉淀加入4 倍體積0.1 mol/L KCl，1 500×g、4 ℃離心10 min后棄上清液收集沉淀，重復兩次。最后沉淀加入4 倍體積0.1 mol/L NaCl，于1 500×g、4 ℃離心10 min后棄上清液收集沉淀，得到純化的肌原纖維蛋白，用雙縮脲法測其蛋白質量濃度，密封置于4 ℃保存備用。

1.3.2 肌原纖維蛋白-亞麻籽膠（MP-FG）混合物的制備

肌原纖維蛋白與亞麻籽膠用勻漿機混合均勻，加入磷酸緩沖液致使肌原纖維蛋白含量為4%，亞麻籽膠含量為0.4%，即MP-FG混合物，對照組（MP）不含亞麻籽膠。

1.3.3 流變特性的測定

參照Westphalen等［10］的方法進行修改，使用流變儀測MP和MP-FG混合體系流變特性。采用50 mm平行板，分別取制備好的MP和MP-FG混合物樣品于測試平臺。測試參數為：頻率為1 Hz，應變為0.3%，上下板狹縫為0.5 mm，從20 ℃升溫至80 ℃，升溫速率2 ℃/min，隨后4 ℃/min降溫至20 ℃，使用液體石蠟封住平行板外蛋白與空氣接觸處部分，防止加熱過程中蛋白溶液蒸發。各處理測定3 個重復。

1.3.4 MP及MP-FG混合物誘導凝膠的制備

將制好的MP及MP-FG混合物樣品分裝于小離心管和10 mL小燒杯中，放置于水浴鍋中以1 ℃/min的速率加熱，從20 ℃分別升溫到30、40、50、60、70、80 ℃，保溫20 min。保溫結束后立刻取出放在0～4 ℃的冷藏室中平衡12h后，進行保水性、凝膠強度、二級結構和微觀結構測試。

1.3.5 二級結構的測定

分別將MP和MP-FG混合物樣品平攤于載玻片。拉曼光譜所用功率約為100 mW，使用50 倍長焦距鏡頭對樣品進行激光聚焦，光譜的獲得條件［11］為：200 μm開孔，600 g/mm光柵，3 次掃描，積分時間60 s，分辨率為2 cm-1，數據獲取速率為120（cm·min）-1，拉曼光譜獲取范圍在400～3 050 cm-1。測試完成后用Labspec軟件對拉曼光譜數據進行處理。不同蛋白質二級結構（α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲）含量用Alix等［12］的方法進行計算得到。每個處理進行3 次重復。

1.3.6 凝膠保水性（water-holding capacity，WHC）的測定

根據常辰曦等［13］方法測定保水性。將制備的凝膠稱質量后，在10 000×g、4 ℃條件下離心10 min，離心后用吸水紙將離心出的水分吸出，離心前后稱質量測保水性，每個樣做3 個平行樣。根據如下公式計算凝膠保水性。

式中：m1為離心前質量/g；m2為離心后去除水分的質量/g；m0為離心管質量/g。

1.3.7 凝膠強度的測定

形成的熱誘導凝膠用TA XT Plus 質構儀進行凝膠強度測定，測定在10 mL小燒杯中直接進行，參數設定為：探頭型號：P/5；測前速率：1 mm/s，測定速率：0.5 mm/s；距離：4 mm；數據獲得速率：200 pps。每個樣品做3 個平行樣。

1.3.8 微觀結構的觀察

參照Han Minyi等［9］方法將凝膠切成約2 mm薄片放入2.5%的戊二醛緩沖液固定制樣，將處理后的樣品放入超臨界點干燥儀中干燥、噴金后用掃描電鏡觀察并拍照，加速電壓為7 kV，分別放大500、1 500、3 000、5 000 倍。

1.4 統計分析

每個樣品測定至少3 次重復。用SAS 9.2進行方差分析，使用鄧肯式多重比較進行多重比較。顯著性用t檢驗進行比較。P＜0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同加熱溫度條件下亞麻籽膠對肌原纖維蛋白保水性的影響

加熱溫度對MP凝膠保水性影響如圖1所示，在較低溫度（30～40 ℃）條件下凝膠保水性接近100%，無顯著性變化（P＞0.05），隨著溫度進一步升高，保水性顯著下降（P＜0.05），80 ℃時達到最低，為63.75%，其趨勢與前人研究相似［14］。不同加熱溫度下，添加亞麻籽膠對MP凝膠保水性不盡相同：在30～50 ℃，添加亞麻籽膠對其保水性無明顯影響，當溫度升到60、70、80 ℃時，添加亞麻籽膠顯著提高了MP保水性（P＜0.05），80 ℃時，其保水性達87.65%。可能是因為亞麻籽膠含有大量酸性多糖，大量的帶負電荷的羧基基團和帶正電荷的蛋白質中氨基酸側鏈間產生相互作用力，其是形成和穩定蛋白亞麻籽膠凝膠的主要推動力，在30、40 ℃條件下，蛋白尚未發生變性聚集［7］，亞麻籽膠對其蛋白結構作用極小，所以，添加亞麻籽膠對其保水性沒有顯著性影響。加熱溫度升高到50 ℃時，肌球蛋白變性凝集［7］，亞麻籽膠與蛋白分子發生相互作用，影響蛋白凝集結構，所以MP-FG混合物保水性高于同溫度MP樣品，可能由于作用尚少，差異不顯著。當溫度升到60 ℃，肌球蛋白變性完全，尾部消失，形成復雜的凝膠網絡結構［7］，亞麻籽膠與肌原纖維蛋白形成的三維結構，改變了凝膠結構，孔徑細而均勻，大大提高了肌原纖維蛋白熱誘導凝膠的保水性，因此60、70、80 ℃添加亞麻籽膠顯著增加了肌原纖維蛋白凝膠的保水性。

2.2 不同加熱溫度條件下亞麻籽膠對肌原纖維蛋白凝膠強度的影響不同的溫度對MP凝膠強度的影響見圖2，溫度從

30 ℃升至40 ℃ 時，其凝膠強度沒有顯著性變化，當溫度繼續上升至50、60 ℃時，其凝膠強度顯著上升，當溫度由60 ℃持續上升至80 ℃時，其凝膠強度繼續緩慢增加，80 ℃時達到最大值，變化趨勢與文獻報道相似［15］。這可能是因為在30～40 ℃，其蛋白尚未發生明顯變性，體系屬于溶膠狀態，因此其凝膠強度極低且沒有顯著性差異。在40～60 ℃，體系中蛋白發生大量變性，因此其凝膠強度顯著增加，隨著溫度上升至60 ℃，體系蛋白的變性及聚集均已完成。在60、70、80 ℃條件下添加亞麻籽膠會使蛋白凝膠強度顯著下降，但在30、40、50 ℃條件下并無顯著性差異（圖2）。可能是由于在30、40 ℃條件下，其為溶膠狀態，添加亞麻籽膠只是使其溶膠更加黏稠，50 ℃時，主要發生的是蛋白變性，亞麻籽膠與蛋白間的交聯作用尚少，因此添加亞麻籽膠其凝膠強度無顯著性變化，隨著溫度持續上升，蛋白變性后發生聚集，亞麻籽膠參與其中，對其體系結構產生影響，導致凝膠強度顯著下降（P＜0.05）。且從保水性結果看到，在60、70、80 ℃添加亞麻籽膠凝膠保水性顯著增加，體系中水分含量增加，這可能也是同溫度下添加亞麻籽膠其凝膠強度下降的原因之一。

2.3 不同加熱溫度條件下亞麻籽膠對肌原纖維蛋白二級結構的影響

研究表明蛋白的構象變化與其凝膠特性密切相關［16-18］。α-螺旋的展開以及β-折疊的形成在蛋白凝膠形成過程中起關鍵作用。溫度對MP及MP-FG混合體系二級結構的影響見圖3，MP和MP-FG樣品隨著加熱溫度的改變其變化趨勢相似：隨著溫度上升，α-螺旋結構減少且伴隨著β-折疊和無規卷曲結構的增加。變化的原因可能是隨著溫度的上升α-螺旋結構展開，通過氫鍵、分子暴露的疏水殘基等分子作用力相互作用形成了β-折疊和β-轉角和無規卷曲結構。這與前人研究溫度對肌原纖維蛋白熱誘導蛋白結構的變化結論相似［16，19］，在升溫過程中α-螺旋結構解開，β-折疊的形成可能是普遍現象。

相同加熱溫度條件下，添加亞麻籽膠肌原纖維蛋白α-螺旋結構含量有所下降，β-折疊結構含量增加，且溫度高于50 ℃時變化顯著（P＜0.05）。氨基酸間的靜電荷作用維持蛋白二級結構，多肽鏈的羰基氧和氨基氫形成的氫鍵維持蛋白的α-螺旋［20］。添加亞麻籽膠后，多糖與肌原纖維蛋白間的靜電作用可能使蛋白α-螺旋展開，并形成β-折疊、無規卷曲，隨著溫度升高至肌球蛋白、肌動蛋白發生變性，內部疏水基團暴露［21］，與亞麻籽膠的靜電作用、疏水作用、氫鍵作用增強，導致肌原纖維蛋白構象發生變化［22］，所以加熱溫度高于50 ℃時，添加亞麻籽膠顯著降低肌原纖維蛋白α-螺旋結構含量，增加β-折疊結構含量。

2.4 不同加熱溫度條件下亞麻籽膠對肌原纖維蛋白流變學特性的影響

儲能模量G'又稱彈性模量，反映樣品的彈性。由圖4可知，在加熱過程中G'有兩個峰值。隨著溫度的上升，第一個峰值出現在50.9 ℃，隨后下降，超過60 ℃后又穩步上升直至70～80 ℃到達峰頂。目前被普遍接受的解釋是G'的兩次改變是MP的兩次熱變性階段，G'的第一個峰值最高溫度為50.9 ℃，G'增大來自于肌球蛋白頭部的接合［23］，在此階段，松散的凝膠結構初步形成。隨著溫度的進一步升高，致使G'下降［24］，是由于肌球蛋白尾部逐漸展開，導致半凝膠流動性大幅度增加，從而導致已形成的網絡結構被破壞；隨后G'又隨溫度上升而上升，在溫度超過60 ℃后，隨著肌球蛋白分子展開，形成無規卷曲結構，使得現有的蛋白質網絡中蛋白聚集體與新增的變性蛋白聚集體的相互交聯作用增加，凝膠骨架加強，從而形成不可逆凝膠。損耗模量G''又稱黏性模量，反映材料黏性大小，升溫過程中損耗模量的變化趨勢和G'相似。

實驗結果顯示，在20～47.9 ℃ 升溫過程中，MP-FG混合體系的G'略高于MP，G''顯著高于MP，這可能是由于添加亞麻籽膠，亞麻籽膠與蛋白間的靜電作用使得體系彈性增加，這也解釋了在較低溫度加熱條件下MP-FG混合體系的凝膠強度大于MP。隨著溫度從47.9 ℃升至57 ℃，添加亞麻籽膠對G''無顯著性影響，但是顯著降低了肌原纖維蛋白G'，說明添加亞麻籽膠與肌原纖維蛋白間存在相互作用，可能是由于添加亞麻籽膠的變化引起體系二級結構、疏水作用、極性的變化，使得肌原纖維蛋白在熱誘導變性過程中G'較低，在宏觀指標表現出其凝膠強度較MP低。陳海華等［4，25］在研究亞麻籽膠與鹽溶性蛋白（salt-soluble meat protein，SSMP）間相互作用實驗中發現，添加2%的亞麻籽膠使SMP的變性溫度T1和變性溫度T2溫度分別升高了9 ℃和14 ℃，但本實驗中并未發現此現象，可能是因為本實驗亞麻籽膠添加量較低，因此對其蛋白變性溫度影響不顯著。

2.5 不同加熱溫度條件下，亞麻籽膠對肌原纖維蛋白凝膠微觀結構的影響

由圖5可知，在40 ℃時，蛋白尚未發生大量變性，幾乎沒有形成凝膠孔徑，隨著溫度升高至50 ℃，MP與MP-FG樣品表面均出現凝膠孔洞，添加亞麻籽膠，凝膠孔洞形成更多，這可能是由于亞麻籽膠與蛋白分子受熱變性后暴露的反應基團間發生相互作用，使得亞麻籽膠與肌原纖維蛋白間發生交聯，這種交聯有助于凝膠孔洞的形成。隨著溫度繼續上升，肌原纖維蛋白變性聚集完成，MP-FG混合體系凝膠三維網絡結構孔徑較MP凝膠孔徑更細小、結構更致密。在MP-FG樣品電鏡圖中可以看到一些薄膜結構（箭頭標出），該膜結構可能是亞麻籽膠與肌原纖維蛋白相互作用形成的矩陣結構。一些親水膠體（黃原膠、刺槐豆膠、水溶性殼聚糖）也曾被報道在電鏡圖發現類似的親水膠體與肉蛋白相互作用的結構［26-27］。具有凝膠性質的親水膠體比如卡拉膠會分散在凝膠孔洞中，形成一種連續的結構；陰離子親水膠體會通過與蛋白的交互作用貫穿于蛋白基質中［28］。添加亞麻籽膠形成更加致密的網絡結構可能也是因為亞麻籽膠與蛋白基質的物理填充作用，以及它們間的交互作用。

凝膠三維網絡結構影響肉制品保水性和質構特性，致密的三維網絡結構會產生毛細現象，有利于水分的滯留，對水分束縛力強，因此其保水性強［5］。從電鏡圖看到添加亞麻籽膠后肌原纖維蛋白所形成的凝膠結構更加致密，與其高保水性相符合。

3 結 論

不同加熱溫度條件下，添加亞麻籽膠對肌原纖維蛋白凝膠特性影響不盡相同。在較低加熱溫度（＜40 ℃）條件下，添加亞麻籽膠對肌原纖維蛋白并無顯著性影響。在較高加熱溫度（＞50 ℃）條件下，添加亞麻籽膠顯著增強肌原纖維蛋白凝膠的保水性，減弱其凝膠強度（P＜0.05）；并使肌原纖維蛋白α-螺旋含量下降，β-折疊含量上升現象。由此可以得出結論：亞麻籽膠對肌原纖維蛋白凝膠特性影響的作用機制是在高于50 ℃條件下亞麻籽膠影響肌原纖維蛋白變性聚集從而影響其凝膠特性。

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Effect and Mechanism of Flaxseed Gum on Thermal Gelling Properties of Porcine Myofibrillar Protein at Different Heating Temperatures

PAN Lihua1， FENG Meiqin2， SUN Jian1，*， XU Xinglian1， ZHOU Guanghong1
（1. National Center of Meat Quality and Safety Control， College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095， China； 2. College of Animal Science and Technology， Jinling Institute of Technology， Nanjing 210038， China）

The objective of the study was to explore the effect and mechanism of action of heating temperature and addition of flaxseed gum （FG） on water-holding capacity （WHC）， gel strength， rheological properties， secondary structure and 3-dimensional network structure of heat-induced gels of pork myofibrillar protein （MP）. The results revealed that increasing temperature could significantly decrease gel WHC （P < 0.05）， and increase gel strength （P < 0.05）. The addition of FG significantly enhanced WHC and decreased gel strength at temperature higher than 50 ℃ （P < 0.05）. Raman spectroscopic analysis revealed that increasing the temperature from 30 to 80 ℃ induced partial transformation of α-helices into β-sheets. At the same heating temperature， the addition of FG led to the transformation of α-helices into β-sheets， thus affecting the formation of gels. The rheological tests showed that storage modulus （G'） values during MP gelation were declined with addition of FG （P < 0.05） when temperature was higher than 50 ℃. Gel holes of MP appeared at 50 ℃， and MP-FG formed a fine dense network at both 70 and 80 ℃ as shown by scanning electron microscopy images.

temperature； myofibrillar protein； flaxseed gum； secondary structure； gel properties； gelling mechanism

10.7506/spkx1002-6630-201609001

TS251.5

A

1002-6630（2016）09-0001-06

潘麗華， 馮美琴， 孫健， 等. 不同溫度下亞麻籽膠對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響及機制［J］. 食品科學， 2016， 37（9）： 1-6.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609001. http：//www.spkx.net.cn

PAN Lihua， FENG Meiqin， SUN Jian， et al. Effect and mechanism of flaxseed gum on thermal gelling properties of porcine myofibrillar protein at different heating temperatures［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 1-6. （in Chinese with English abstract）

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609001. http：//www.spkx.net.cn

2016-02-22

國家自然科學基金青年科學基金項目（31401516）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金項目（Y0201400114）

潘麗華（1992—），女，碩士，研究方向為畜產品加工與質量控制。E-mail：panlihua1576@163.com

*通信作者：孫健（1973—），男，副教授，博士，研究方向為畜產品加工與質量控制。E-mail：sunjian01@njau.edu.cn