絲狀真菌液體深層發酵菌絲體形態控制研究進展

蔣雪薇 李 浩 楊 琛 許延濤 羅曉明

(長沙理工大學化學與生物工程學院, 湖南 長沙 410114)

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絲狀真菌液體深層發酵菌絲體形態控制研究進展

蔣雪薇 李 浩 楊 琛 許延濤 羅曉明

(長沙理工大學化學與生物工程學院, 湖南 長沙 410114)

絲狀真菌廣泛用于工業發酵生產中，其菌絲體形態與發酵液粘度、目的產物產量有著密切關系，是發酵過程控制的關鍵因素之一。文章綜述了絲狀真菌液體深層發酵中菌絲體的形態特征及其分析與表征方法、菌絲球形成機理及菌絲體形態控制對發酵影響的研究進展，指出量化描述絲狀真菌的生長是精確控制發酵過程的基礎。

絲狀真菌；液體深層發酵；菌絲體形態控制

絲狀真菌在醫藥、食品、農業以及環保等發酵工業上應用十分廣泛，是工業大宗發酵產品的主要貢獻者之一，其可以生產許多具有重要經濟價值的代謝產物，如抗生素、有機酸、酶制劑等，具有巨大的工業和社會價值[1-2]。絲狀真菌在液體深層發酵中，菌絲體形態特征及菌絲體生理特性是重要參數，這些參數的變化會對發酵產物的積累產生較大的影響，其中菌絲體形態的變化主要是通過影響發酵液粘度為主的流變學參數來影響發酵產物的積累[3]。發酵液流變學特性的變化會導致發酵過程中傳質效果變化，致使營養物質、氧等底物的吸收及產物的生成發生變化，從而導致代謝途徑發生改變，甚至產生有害的副產物，最終影響到目標產物的產率[4-5]。另外，菌絲體的形態還會對下游提取工藝產生影響，從而影響到產物提取收率[6-7]。可以說，絲狀真菌液體深層發酵中，菌絲體形態控制是目標產物收獲量控制的關鍵之一[8-9]。

1 絲狀真菌液體深層發酵菌絲體的形態特征及菌絲球形成機理

1.1 形態特征

搖瓶發酵中，由于絲狀真菌的生長條件受到人為調控，其菌絲體形態會隨培養基組成、培養條件等的不同而出現不同形態，可能出現無分支的菌絲、有分支且結構復雜的菌絲、菌絲團塊、菌絲球等形態，表現出不同大小、密度及表面結構[10-11]；此外，隨時間變化，不同生長時期的菌絲體內部結構也會發生改變。因此，絲狀真菌在液體深層發酵中菌絲體通常呈現出絮狀、團狀和球狀3種形態(圖1)[12]。不同的菌絲體形態其產物也會產生變化，可以說，絲狀真菌目標產物的獲得常常要有有利于產物形成的最佳菌絲體形態[13]，如分散的菌絲體有利于淀粉酶、糖化酶的產生，而菌絲球則有利于絲狀真菌進行深層發酵產抗生素、有機酸及酶制劑等[9,14]。

菌絲體形態對發酵液的粘度影響較大。在大多數發酵生產中，絲狀真菌菌絲若形成絮狀的菌絲體，會造成發酵液粘度增大，不利于營養物質和氧氣的溶解、傳遞及分布，從而降低好氧發酵產物的產量，嚴重時甚至會導致產物產率極低[15]。若菌絲體形態為過于緊密的團塊狀，在團塊內部，營養物質及氧氣傳遞受阻，會導致內部出現營養匱乏及缺氧狀態，影響菌絲體生長及產物合成，有時還會造成團塊內部菌絲體發生自溶現象[16]。液體深層發酵的孢子萌發出菌絲及菌絲延長的過程中，在孢子聚集及攪拌等機械力作用下，發酵液中的菌絲還可以形成大小適中的菌絲球，此時發酵液的傳質效果好，菌絲體生長旺盛，目標代謝產物合成效率高。可以說，菌絲體形態是工業發酵中獲得目標產物產量最大化的重要影響因素[17-18]。

圖1 絲狀真菌液體深層發酵中菌絲體的不同形態

Figure 1 The different mycelial morphologyof filamentous fungi in submerged fermentation

1.2 菌絲球的形成機理

絲狀真菌菌絲體在液體深層發酵中形成不同形態，既與發酵環境作用有關，也跟菌絲體自身某些生理活動有聯系[19-20]。雖然菌絲球形成的條件有很多，但其成球的類型一般有兩種，即孢子聚集型和菌絲體聚集型[21-22]。Lin等[23]采用PARSIVAL軟件擬合黑曲霉胞子聚集后萌發成球的兩個階段，發現黑曲霉菌絲成球不僅與孢子聚集有關，而且還和菌絲生長蔓延關系密切，而菌絲球又可以分為表面光滑型和粗糙型，這與其所處的環境是相關的。Li等[24]研究表明，在攪拌剪切力的作用下菌絲球繼續生長時，需經受住更強的環境外力，此時菌絲球會變得光滑、致密、酶活降低，這可能是其通過改變自身的形態結構以適應環境條件。綜合而言，菌絲球形成的主要影響因素有孢子聚集、菌絲蔓延速率及程度、機械攪拌作用等。

2 絲狀真菌菌絲體形態分析與表征方法

2.1 菌絲體形態的分析方法

絲狀真菌菌絲體形態特征最常見的分析方法有直接觀測法、圖像分析法等。直接觀測法是最為原始也最為基本的形態分析研究手段，分為肉眼觀察與顯微鏡觀測兩種，顯微鏡觀測是研究微生物微觀形貌特征最常用的方式。這些傳統的分析觀測手段更多的是憑直觀、憑經驗，得到的觀測數據不僅少，其準確性也有待提升，不利于形成較為精確的量化數據。

圖像分析法是20世紀80年代引入的一種新的分析方法，其基本步驟有：顯微圖像拍攝、顯微圖像分區、目標定位、檢測與分析等[18]。圖像分析方法最初屬于半自動化方法，倘若菌絲擁有不短的分枝長度，則結果會更為準確，但它卻不適合對菌絲團體進行觀測分析，并且基本需要人工較為繁瑣的操作[25]。而全自動化方法可以測算出菌絲體的大多數形態參數，但還是需要對菌絲體輪廓進行人為的標定[26]。由于檢測方法的單一性，難以對所有菌絲體形態進行很好地測算，菌絲聚集團體的分析就更為少見。Reichi等[27]通過圖像分析表征了鏈霉菌屬S.tendae菌絲體在液體深層發酵培養過程中菌絲球的大小、含量以及形態特征；Treskatis等[28]運用在線數字圖像分析和模型識別系統方法，描述了液體深層發酵過程中絲狀微生物的形態特性。

2.2 菌絲體形態的表征方法

發酵過程中，絲狀真菌菌絲的生長蔓延是以其尖端生長的形式進行的。蔓延后的絲狀真菌形態各不相同，既有單細胞結構，又有多細胞結構，其生長方式異常復雜，故菌絲體形態難以準確表征。近些年，有學者[14,29]通過選取不同的參數，對不同類型的菌絲體形態進行量化描述，取得了一些進展。

隨著顯微圖像分析技術的進步，通過合理選取適當的參數，借助圖像分析軟件對菌體的特征進行測量分析，得到大量的量化數據，推動了液體深層發酵中菌絲體形態學研究的進步。借助圖像分析系統，目前可用于描述菌絲體形態學特征的參數有菌絲長度、菌絲體面積、周長、緊密度、分枝頻率等，其中菌絲球可以選用直徑、長軸、短軸、周長、面積以及面積比等作為量化描述的參數。已報道的定量描述絲狀真菌形態的參數及量化程度見表1[30-33]。

3 絲狀真菌液體深層發酵菌絲體形態對發酵的影響

絲狀真菌可用于許多產物的發酵法生產中。發酵過程中由于條件的變化，會使菌絲體形態發生變化，從而導致發酵液中營養物質傳遞以及溶氧值發生較大變化，發酵生產能力也因此發生較大的差異，故菌絲體形態變化是大規模工業發酵生產最值得關注的因素之一。

3.1 菌絲體形態對發酵液流變學特性的影響

絲狀真菌的發酵液中存在大量菌絲體，菌絲體在搖瓶振蕩或發酵罐中攪拌槳葉的攪拌作用下相互纏繞，會使發酵液變得粘稠，影響傳質，不利于大規模的工業生產[34]。目前，許多絲狀真菌的發酵過程中均采用菌絲球發酵生產目標產物，以降低發酵液的粘度，L-乳酸生產就是其中之一[35]。根據顆粒懸浮液理論，菌絲球內部都包含有一定體積的流體，稱之為排出體積，其大小對菌絲球的柔性和結構參數有較大影響，可以認為菌絲球是具有一定柔性的球型顆粒[36-37]。菌絲球這種柔性顆粒的大小直接影響了發酵液的傳質，在發酵過程中，適宜大小的菌絲球有利于傳質，有研究[38]證明，L-乳酸發酵中菌絲在玉米芯固定化發酵能形成0.5～5.0 mm的菌絲球，此時L-乳酸積累最大。這是因為菌絲球所占發酵液內體積比較小，而且呈顆粒狀不會向四周散漫開，這樣發酵液的粘度相較于絮狀或團塊狀等形態情況下不會大幅度提升。一方面，菌絲體自身形態會影響發酵液的流變學特性，而另一方面，菌絲體各種形態的形成也是由不同發酵環境作用的結果。除孢子聚集、菌絲蔓延速率及程度、機械攪拌作用等主要因素影響絲狀真菌菌絲體形態，從而影響發酵液流變學特性外，微生物在發酵過程中產生的其它各種副產物，也會對發酵液性質變化起到作用[39]。

表1 圖像分析中的菌絲體形態參數及其量化程度

3.2 菌絲體形態對發酵產物積累的影響

不同的絲狀真菌菌絲體形態在液體深層發酵中對產物的累積會產生很大的影響。Yu等[40]在氨濃度為0.1 g/L以上的培養基中利用米根霉成絮狀形態進行培養，pH保持在4.4左右，首批生產乳酸含量達到109 g/L，糖酸轉化率達87%。蔣雪薇等[41]在米根霉發酵產L-乳酸中添加表面活性劑吐溫-80使菌絲成球，優化發酵條件后發現，在吐溫-80用量0.5 g/L、搖瓶轉速200 r/min、接種量7%、(NH4)2SO4質量濃度4 g/L時，菌絲球數量達115 mL-1，球體平均直徑為1.2 mm，乳酸產量達78.9 g/L。趙龍等[38]進一步探究了以玉米芯為載體固定米根霉發酵L-乳酸的工藝條件，結果表明，玉米芯與葡萄糖質量為1∶4時米根霉形成直徑為0.5～1.0 mm菌絲球，此時葡萄糖對L-乳酸的轉化率高達82.5%，其產酸達到34.68 g/L。Jun Yang等[42]通過海洋真菌Curvulariasp.IFB-Z10的菌絲體形態的控制來對其產殺菌生物堿性能進行改進，在加入200目的滑石粉(5 g/L)后發現，菌絲球直徑大幅度減少，而目標產物的產量增長到33.05 mg/L，為對照組的1.9倍。這說明，相同菌絲體形態下不同的形態參數如菌絲球大小、菌球密度等對產物積累影響極大。

4 總結與展望

綜上所述，絲狀真菌會根據環境而呈現不同的菌絲體形態，而這一形態主要通過影響發酵液的流變特性來影響產物的合成和提取。菌絲體呈球狀時發酵液粘度低，有利于傳質，是大多數工業發酵提高產量的優選形態。然而，目前已有的關于絲狀真菌菌絲形態的研究報道，大多數只針對培養基pH與成分、接種孢子、攪拌速率等外在環境因素對菌絲球形態的影響開展研究，對于菌絲成球深層次上的機理研究較少。隨著計算機及顯微圖像分析技術的進步，借助這些手段，結合微生物內在的生理因素研究，能更科學地對絲狀真菌的生長過程進行量化描述，實現液體深層培養環境中菌絲生長及其形態的數學表達，為絲狀真菌工業化生產過程控制提供更多的控制參數及更為精確的控制方法。

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Progress in research of mycelial morphology control of filamentous fungiin submerged fermentation

JIANG Xue-weiLIHaoYANGChenXUYan-taoLUOXiao-ming

(CollegeofChemistry&Bioengineering,ChangshaUniversityofScience&Technology,Changsha,Hunan410004,China)

Filamentous fungi are widely used in industrial fermentation. Its mycelial morphology is closely combined with objective product yield and fermented liquid viscosity, and it is one of the key factors in the fermentation process control. In this paper, the research progress was reviewed on the mycelia of filamentous fungi in the submerged fermentation,including its morphological characteristics, the analysis and characterization methods, the mechanism of mycelial pellet formation, and the influence of mycelial morphology control in fermentation. Therefore, the author indicated that quantitative description the growth of filamentous fungi was the foundation of precision control on fermentation process.

filamentous fungi; submerged fermentation; mycelial morphology control

湖南省科技計劃項目(編號：2013FJ4036)；清遠市科技計劃項目(編號：2013A024，2014A023)

蔣雪薇，女，長沙理工大學副教授，博士，碩士生導師。

羅曉明(1968—)，男，長沙理工大學副教授，碩士。

E-mail：csluoxm@sina.com

2016—05—12