新疆紅肉蘋果多酚的超聲波輔助提取工藝優化

齊 娜 李 涵 張志宇 鄧 紅 虎 艷 郭玉蓉 孟永宏

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710062)

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新疆紅肉蘋果多酚的超聲波輔助提取工藝優化

齊 娜 李 涵 張志宇 鄧 紅 虎 艷 郭玉蓉 孟永宏

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710062)

利用響應面法優化超聲波輔助提取新疆紅肉蘋果多酚的工藝條件。以新疆紅肉蘋果為試驗原料，在單因素試驗基礎上選擇提取時間、超聲功率、提取溫度及料液比4個因素進行響應面設計，采用Box-Behnken中心組合試驗設計和響應面分析法，確定紅肉蘋果多酚的最佳提取工藝。結果表明，紅肉蘋果多酚的最佳提取參數為：料液比1∶4 (g/mL)，超聲功率360 W，提取溫度62 ℃，提取時間20 min。在該最佳條件下，新疆紅肉蘋果多酚得率達到2.135 mg/g。該結果可為蘋果多酚的實際生產提供借鑒。

紅肉蘋果；多酚；超聲輔助提取

中國是蘋果屬植物的起源中心，全世界約35個蘋果種里中國有27種。中國蘋果不僅種植面積和產量世界第一，其野生蘋果資源也非常豐富，新疆野蘋果就是其中天然存著的第三紀孑遺物種，被認為是栽培蘋果的祖先[1-3]。新疆紅肉蘋果(Malus niedzwetzkyana Dieck)的枝、花、果皮及果肉均為紅色，是一種在新疆有著悠久栽培歷史的優良果樹品種，更是新疆野蘋果中的一種珍貴種質[4-5]，具有豐富的遺傳多樣性和很高的觀賞與醫用價值。

新疆紅肉蘋果具有較強的環境適應能力和抗旱、抗寒、抗病蟲等特性，其外表及果肉全紅吸引了很多人的注意，近年來人們發現新疆紅肉蘋果具備的生物功能和潛在利用價值非常高。新疆紅肉蘋果含有大量的花色苷[6-7]，還含有多糖、多酚等多種活性物質[8]6-7。雖然新疆紅肉蘋果由于口感酸澀不能鮮食而不為廣大消費者所知，但是其中的蘋果多酚因其抗氧化能力強，而備受人們關注[8]6-7[9]。蘋果多酚，作為一種植物次生代謝產物，具有抗氧化、抗輻射、抗衰老、預防心腦血管疾病以及增強免疫力等生物活性與功效[10-12]。目前，植物多酚的提取方法較多，主要有溶劑法、超聲波輔助提取、超臨界CO2流體萃取等[13-14]。而其中的超聲輔助提取方法具有效率高、能量低以及節省溶劑等特點，成為有效提取多酚、多糖等活性物質的新興技術[15]。

張小燕等[16]研究發現新疆野蘋果多酚物質遺傳多樣性極為豐富，從30株蘋果中鑒定出原花青素、沒食子酸、綠原酸、對羥基苯甲酸、兒茶素、根皮素等13種多酚物質。Wang Xiao-qian等[17]發現新疆紅肉蘋果的酚類物質具有很好的抗氧化能力，具有非常重要的食用與藥用開發價值，但是國內外對于新疆紅肉蘋果多酚的提取工藝及功效等方面研究還是空白。本研究旨在探索可作為一種優質功能食品資源的新疆紅肉蘋果多酚的高效低耗提取工藝，為進一步研究其抗癌、調節免疫等生物活性提供依據。

為了充分利用新疆紅肉蘋果資源，本試驗擬采取超聲輔助法提取新疆紅肉蘋果多酚，在單因素試驗的基礎上，通過響應面法優化提取相關參數，確定新疆紅肉蘋果多酚最佳工藝條件，以期為新疆紅肉蘋果的資源利用及其多酚的進一步研究提供理論依據，也為蘋果多酚在食品及醫藥行業的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆紅肉蘋果：于2015年9月底購于新疆塔城(此時間為當地紅肉蘋果成熟采收季節)；

乙醇、福林酚試劑、沒食子酸標準品、無水碳酸鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

超聲波機：SB25-12DTDN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

循環水式多用真空泵：SHB-III型，鄭州長城科工貿有限公司；

全波長酶標儀：Multiskan Go型，美國熱電公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多酚的提取 將紅肉蘋果去籽全果打漿，在取樣分析其水分含量的基礎上，稱取25.0 g紅肉蘋果勻漿，按相應的比例加入乙醇(濃度75%)，在確定的超聲功率和溫度下進行一定時間的提取，然后進行抽濾。將濾液加水定容(300 mL)后混勻，取2.5 mL稀釋10倍，按照分析方法測定多酚含量，計算多酚的得率。

1.3.2 多酚含量的測定與得率計算 采用福林酚比色法測定新疆紅肉蘋果的多酚含量。

(1) 多酚標準曲線的繪制：以沒食子酸為標準物質，根據參考文獻[13]修改如下：配制0.00，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL的沒食子酸標準溶液，分別取上述不同濃度的沒食子酸標準溶液0.5 mL，加1.0 mL的福林酚試劑，5 min后再加入Na2CO3(75 g/L)溶液2 mL，在水浴中(50 ℃)保持5 min后冷卻1 h，在760 nm處測定吸光值，以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線(見圖1)，得y=6.609 9x+0.007 2(R2=0.994 3)，該方程可用于提取物中多酚的定量測定。

(2) 多酚含量的分析：吸取一定質量濃度的樣品溶液0.5 mL，與1.3.2(1)相同的方法加入試劑后測定吸光值，以0.5 mL 蒸餾水代替樣品作空白，根據上述標準曲線計算含量。

(3) 多酚得率按式(1)計算：

圖1 沒食子酸標準曲線

(1)

式中：

R——多酚得率，mg/g；

C——樣品液總酚濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

N——稀釋倍數；

W——新疆紅肉蘋果原料重量，g。

1.3.3 多酚提取單因素試驗 參考文獻[13]和[18]，分別選取提取時間、超聲功率、提取溫度和料液比4個因素做單因素試驗，做3次重復，考察各個因素對新疆紅肉蘋果多酚得率的影響。

(1) 提取時間：以75%的乙醇為溶劑，超聲功率為300 W，提取溫度為60 ℃，料液比為1∶4(g/mL)，將提取時間分別設定為10，20，30，40，50 min，然后將提取液抽濾、定容，測定多酚的含量。

(2) 超聲功率：以75%的乙醇為溶劑，提取時間為20 min，提取溫度為60 ℃，料液比為1∶4(g/mL)，將超聲功率分別設定為240，280，320，360，400 W，然后將提取液抽濾、定容，測定多酚的含量。

(3) 提取溫度：以75%的乙醇為溶劑，提取時間為20 min，超聲功率為360 W，料液比為1∶4(g/mL)，將提取溫度分別設定為30，40，50，60，70 ℃，然后將提取液抽濾、定容，測定多酚的含量。

(4) 料液比：以75%的乙醇為溶劑，提取時間為20 min，超聲功率為360 W，提取溫度為60 ℃，將料液比分別設定為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10(g/mL)，然后將提取液抽濾、定容，測定多酚的含量。

1.3.4 多酚提取條件的響應面優化試驗 在單因素試驗結果的基礎上，選定超聲功率、提取時間和溫度、料液比四因素為自變量，以多酚的得率為響應值(即試驗指標)，根據Box-Behnken 原理進行4因素3水平的試驗設計。

2 結果與分析

2.1 多酚提取的單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對多酚得率的影響 由圖2可知，隨著提取時間的增加，多酚得率則先升高后下降，在20 min時多酚得率最高。20 min后多酚得率逐漸下降可能是由于超聲處理時間過長會導致多酚的氧化降解[19-20]，也可能有其他物質溶出，影響多酚的得率。因此，提取時間選擇20 min最佳。

圖2 提取時間對多酚得率的影響

王賢萍等[21]的研究表明多酚的最佳提取時間為60 min，而本試驗的提取時間僅為20 min，不僅提高了效率而且還避免了時間過長，造成多酚物質的氧化降解。

2.1.2 超聲功率對多酚得率的影響 由圖3可知，超聲功率提高則多酚得率增大，當超聲功率為360 W時，多酚得率達到最高，之后繼續加大超聲功率多酚得率降低。分析原因，可能是超聲波的空化作用使得新疆紅肉蘋果的細胞壁更容易破碎，加快了蘋果中多酚物質的溶出，增大多酚的得率[22]。但是超聲功率過高，會使多酚物質發生分解，使多酚得率下降。因此，超聲功率選擇360 W最佳。

圖3 超聲功率對多酚得率的影響

超聲輔助提取相對于其他方法具有高效、節能等特點，多酚得率會隨著超聲功率的增大而逐漸增大，但超聲功率過高可能會引起其結構與活性的變化，本試驗確定超聲功率為360 W，比許先猛等[23]研究得出的最佳超聲功率600 W要低，因而對多酚的破壞較小。但超聲對多酚的具體影響還需要進一步研究確定。

2.1.3 提取溫度對多酚得率的影響 由圖4可知：隨著溫度的升高，新疆紅肉蘋果多酚得率逐漸增大，當溫度達到60 ℃時，多酚得率最高，再繼續升高溫度得率卻逐漸降低。分析認為，溫度升高，會使物質內的分子運動加快，酚物質的滲透與擴散的速度加快多，使多酚更容易溶出。但是溫度過高(大于60 ℃)時，會破壞多酚的結構，提取率急劇降低，這與任文霞等[24]的試驗結果一致。因此，提取溫度選擇60 ℃最佳。

2.1.4 料液比對多酚得率的影響 由圖5可知，隨著溶劑用量的增大，新疆紅肉蘋果多酚得率呈現先上升后下降的趨勢，當料液比為1∶4(g/mL)時，多酚得率最高。從提取效果與能源節省等方面綜合考慮，溶劑的用量不宜過大。因此，料液比選擇1∶4(g/mL)最佳。

圖4 提取溫度對多酚得率的影響

圖5 料液比對多酚得率的影響

2.2 多酚提取工藝條件的響應面優化試驗結果

按照1.3.4 的方法進行多酚提取條件的響應面優化試驗，其試驗因素與水平設計見表1，試驗結果見表2。

表1 響應面設計紅肉蘋果多酚提取試驗的因子與水平

Table 1 The factors and levels in response surface design for polyphenol extraction of red-flesh apple

水平X1提取時間/minX2超聲功率/WX3提取溫度/℃X4料液比(g/mL)-110320501︰2020360601︰4130400701︰6

2.2.1 響應面回歸模型的建立與分析 采用Design-Expert 8.0.5 軟件分析4個因素(提取時間、超聲功率、提取溫度、料液比)對多酚得率的影響，建立的二次回歸模型：

(2)

2.2.2 響應面模型分析因子間交互作用 圖6(a)～(c)曲面相對比較陡，表明了超聲功率與提取時間、提取溫度與提取時間、提取時間與料液比之間的交互作用比較大，它們對多酚得率有一定影響，但不顯著；圖6(d)～(f)曲面相對比較平坦，說明提取溫度與超聲功率、料液比與超聲功率、料液比與提取溫度交互作用小，它們對多酚得率影響小。

從圖6總的來看，提取時間與其他因素的交互作用對新疆紅肉蘋果多酚的影響最為顯著。超聲功率、提取溫度和料液比的交互作用對新疆紅肉蘋果多酚的影響顯著性不明顯，表現為曲線平滑。

圖6 試驗各因素對多酚得率影響的響應面圖

Table 2 Response surface experimental design and results for polyphenol extraction of red-flesh apple

序號X1X2X3X4Y多酚得率/(mg·g-1)1010-11．55820-10-11．556301101．5994-10101．685511001．5056-1-1001．4927-11001．468810101．705900-111．2781001-101．3671100-1-11．458120-1-101．47213-10011．428140-1011．737151-1001．6961601011．6951700111．602180-1101．71619-100-11．6942010-101．39921001-11．7352210011．58723100-11．66424-10-101．4812500002．1502600002．1192700002．1762800001．9982900002．187

2.2.3 最佳條件的確定以及回歸模型的試驗驗證 利用Design-Expert 8.0.5 軟件對回歸模型進行預測和分析，得到的最佳工藝參數為：提取時間20.6 min，超聲功率356.8 W，提取溫度62.1 ℃，料液比1∶3.98(g/mL)，此時理論上多酚的最大得率為2.140 mg/g。

為了結合實際生產的需要，將超聲波輔助提取新疆紅肉蘋果多酚的各個因素進行調整，即提取時間和溫度分別為20 min、62 ℃，超聲功率360 W、料液比1∶4 (g/mL)；在此調整后的條件下進行驗證(5次平行實驗)，結果多酚得率平均為2.135 mg/g，與理論預測值之間僅有0.2%的誤差，證實本模型準確、有效。

蘋果多酚易溶于有機溶劑，本試驗采用乙醇作為提取溶劑，具有環保、無毒、安全等特點，并且還可回收利用，節省資源，這與賀金娜等[25]的研究方法一致。

表3 二次響應模型方差分析?

4 結論

(1) 試驗以乙醇為溶劑通過Box-Behnken響應面優化并得到了提取新疆紅肉蘋果多酚的最佳工藝參數，在該條件下多酚的得率達到2.135 mg/g；試驗獲得的回歸模型也可以準確分析和預測超聲輔助提取新疆紅肉蘋果多酚的得率；說明該工藝實際可行。

(2) 試驗發現超聲輔助可以提高提取效率，但對多酚物質也有影響，還需要進一步探討超聲對其組成和生物活性影響的相關性，以切實為多酚的工業化生產和應用提供指導。

[1] ZHOU Z Q, LI Y N. The RAPD evidence for the phylogenetic relationship of the closely related species of cultivated apple[J]. Genetic Resources and Crop Evolution, 2000, 47(4): 353-357.

[2] ROBINSON J P, HARRIS S A, JUNIPER B E. Taxonomy of the genusMalusMill. (Rosaceae) with emphasis on the cultivated apple,MalusdomesticaBorkh[J]. Plant Systematics and Evolution, 2001, 226(1): 35-58.

[3] HARRIS S A, ROBINSON J P, JUNIPER B E. Genetic clues to the origin of the apple[J]. Trends in Genetics, 2002, 18(8): 426-430.[4] 謝兵, 周杰, 朱樹華. 新疆紅肉蘋果發育期間花青素代謝的研究[J]. 山東農業科學, 2015, 47(8): 25-29.

[5] 張新忠, 王憶, 韓振海. 我國蘋果屬(MalusMill.)野生資源研究利用的現狀分析[J]. 中國農業科技導報, 2010, 12(3): 8-15.

[6] 王燕, 陳學森, 劉大亮, 等. ‘紫紅1號’紅肉蘋果果肉抗氧化性及花色苷分析[J]. 園藝學報, 2012, 39(10): 1 991- 1 998.

[7] 王延玲. 新疆紅肉蘋果紅色發育機理的初步研究[D]. 泰安: 山東農業大學, 2011: 29-31.

[8] 汪曉謙. 紅肉蘋果酚類代謝及其對逆境的響應研究[D]. 楊凌: 西北農林科技大學, 2015.

[9] 玉山江·艾尼, 劉龍昌, 李文勝. 新疆古老栽培果樹紅肉蘋果的分類、生物學特性與應用價值[J]. 林業實用技術, 2011(6): 63-64.

[10] LIU Qin, QIU Yang, BETA T. Comparison of antioxidant activities of different colored wheat grains and analysis of phenolic compounds[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2010, 58(16): 9 235-9 241.

[11] LI Fu-hua, ZHANG Xiao-li, ZHENG Shao-jie, et al. The composition, antioxidant and antiproliferative capacities of phenolic compounds extracted from tartary buckwheat bran [Fagopyrum tartaricum (L.) Gaerth][J]. Journal of Functional Foods, 2016, 22: 145-155.

[12] 趙二勞, 史淑美, 王迎進, 等. 黃芩多酚超聲提取工藝優化及其抗氧化性研究[J]. 河南工業大學學報: 自然科學版, 2012, 33(5): 30-33.

[13] 李珍, 哈益明, 李安, 等. 響應面優化蘋果皮渣多酚超聲提取工藝研究[J]. 中國農業科學, 2013, 46(21): 4 569-4 577.

[14] 吳添文. 響應面分析優化臨界CO2萃取紅棗多酚及其在卷煙中的應用[J]. 食品工業, 2015, 36(8): 131-136.

[15] 杜若源, 謝晶, 王婷, 等. 超聲波輔助提取銀杏葉中總黃酮的工藝優化[J]. 食品與機械, 2014, 31(1):167-170.

[16] 張小燕, 陳學森, 彭勇, 等. 新疆野蘋果多酚物質的遺傳多樣性[J]. 園藝學報, 2008, 35(9): 1 351-1 356.

[17] WANG Xiao-qian, WEI Zhi-wei, MA Feng-wang. The effects of fruit bagging on levels of phenolic compounds and expression by anthocyanin biosynthetic and regulatory genes in red-fleshed apples[J]. Process Biochemistry, 2015, 50(11): 1 774-1 782.

[18] WANG Xiao-qian, LI Cui-ying, LIANG Dong, et al. Phenolic compounds and antioxidant activity in red-fleshed apples[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 18: 1 086-1 094.

[19] 李倩, 李俶, 徐金龍, 等. 響應面法優化南酸棗皮中多酚提取工藝[J].食品工業科技, 2012, 33(20): 251-254.

[20] 劉婷, 歐陽夢云, 王燕, 等. 刺葡萄酒渣中白藜蘆醇的超聲輔助提取工藝優化[J]. 食品與機械, 2014, 30(6): 160-164.

[21] 王賢萍, 張倩茹, 尹蓉, 等. 超聲波輔助提取蘋果多酚優化條件的研究[J]. 農產品加工, 2014(7): 12-15.

[22] 李曉軍, 潘宏利, 陳花, 等. 響應曲面法優化超聲輔助提取金銀花總黃酮[J]. 陜西師范大學學報, 2009, 37(2): 81-90.

[23] 許先猛, 盧軍, 宋武明. 蘋果渣多酚超聲提取工藝研究[J]. 食品與發酵科技, 2014, 50(3): 36-38 .

[24] 任文霞, 李建科, 仇農學, 等. 超聲波輔助提取蘋果渣多酚工藝[J]. 食品與生物技術學報, 2008, 27(4): 20-23.

[25] 賀金娜. 蘋果多酚的制備、成分鑒定及其抗氧化性研究[D]. 無錫: 江南大學, 2014: 52.

Optimization on ultrasound-assisted extraction of polyphenols from red-flesh apple by response surface methodology

QI NaLIHanZHANGZhi-yuDENGHongHUYanGUOYu-rongMENGYong-hong

(CollegeofFoodEngineeringandNutritionalScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an,Shaanxi710062,China)

[Objective] Response surface methodology was used to optimize the extraction process condition of polyphenols from red-flesh apple with ultrasonic assistance. [Method] Using the red-flesh apple of XINJIANG as material, on the basis of single-factor experiment, four factors, inclouding extraction time, ultrasonic power, extraction temperature and ratio of material-to-liquid were chosed to design the experiment with response surface method. With Box-Behnken design and response surface analysis, the optimum extracting conditions of polyphenols from red-flesh apple were determined. [Result] The optimal process parameters of polyphenol extraction were determined and they were as follows: extraction time and temperature were 20 min and 62 ℃, ultrasound power and ratio of material-to-liquid was 360 W and 1∶4(g/mL) respectively. [Conclusion] The polyphenols yield was achieved to 2.135 mg/g for red-flesh apple of XINJIANG under theoptimized conditions. This result can provide a reference for the actual production of polyphenols.

red-flesh apple; polyphenol; ultrasound-assisted extraction

農業部蘋果產業體系建設項目(編號：CARS-28)；中央高校科研業務專項經費項目(編號：GK201405005)

齊娜，女，陜西師范大學在讀碩士研究生。

鄧紅(1967—)，女，陜西師范大學副教授，博士。

E-mail: hongden@snnu.edu.cn

2016-05-08