超聲—微波聯合提取絞股藍皂苷工藝優化及協同作用分析

程軼群 張 帆 周守標 何榮榮 紀杭燕 黃 怡 紀雅麗 陳春華

(安徽師范大學環境科學與工程學院，安徽 蕪湖 241003)

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超聲—微波聯合提取絞股藍皂苷工藝優化及協同作用分析

程軼群 張 帆 周守標 何榮榮 紀杭燕 黃 怡 紀雅麗 陳春華

(安徽師范大學環境科學與工程學院，安徽 蕪湖 241003)

采用響應面法優化絞股藍總皂苷的超聲—微波聯合提取工藝，并分析超聲、微波間協同作用效果。使用Box-Behnken中心組合設計對提取工藝進行優化，研究微波功率、微波時間、提取溫度、浸提時間4個因素對絞股藍總皂苷得率的影響。在最佳工藝基礎上，通過控制提取過程中不同階段超聲、微波的啟停，考察不同提取條件對皂苷得率的影響，并分析超聲、微波間有無協同作用及其效果。結果表明，最佳提取工藝為：開啟超聲(50 W)，微波功率613 W，微波時間145 s，提取溫度62.0 ℃，浸提時間12.8 min，該條件下絞股藍皂苷得率為(24.08±0.37) mg/g。通過對比不同條件下絞股藍皂苷的得率表明，超聲、微波間協同作用顯著，且協同作用階段在提取過程中起主要作用。

絞股藍；皂苷；超聲—微波聯合提取；協同作用

絞股藍(Gynostemmapentaphyllum)是葫蘆科絞股藍屬多年生草質藤本植物，富含皂苷[1-2]、黃酮[3]、多糖等活性成分[4]，其中具有抗腫瘤[5-6]、降血壓、降血脂、增強免疫力等[7-8]功能的絞股藍皂苷為其主要功能性成分。目前，對絞股藍皂苷提取方法的研究較多，主要有熱溶劑提取法[9]、超聲波輔助提取[10]、酶法提取法[11]、微波輔助提取[12-13]、超臨界CO2萃取等[14-15]。這些提取方法都存在各自的優缺點，且使用單一方法提取時皂苷的得率相對有限。若能將不同提取方法結合使用，通過合理優化使多種作用間產生協同效應，則可以在避免使用單一提取方法固有缺點的同時進一步提高提取效率。其中超聲—微波聯合提取具有高效、節能等優點，有巨大的應用潛質。然而目前采用超聲—微波協同提取的研究還十分有限[16-17]，且已有研究中均未考察兩者共同作用時的協同效應。本試驗研究和優化超聲、微波共同作用下絞股藍皂苷的提取工藝，分析兩者間協同作用效果，旨在為絞股藍中皂苷的高效利用提供指導依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

絞股藍：購自黃山市歙縣藥材市場；

人參皂苷Rb1標準品：純度≥98%，中國藥品生物制品鑒定所；

高氯酸、香草醛、乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

超聲—微波協同萃取儀：CW-2000型，微波頻率2 450 kHz，功率0～1 000 W任意可調，超聲頻率40 kHz，固定功率50 W，上海新拓公司；

可見分光光度計：722G型，上海儀電分析儀器有限公司；

真空干燥箱：DZF-6020A型，上海邦西儀器科技有限公司；

分析天平：FA1004型，上海恒平儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預處理 將絞股藍置于60 ℃真空干燥箱中減壓干燥，至恒重后粉碎，過60目篩，置于干燥器內待用。

1.2.2 絞股藍皂苷提取單因素試驗 單因素試驗均在開啟超聲(50 W)條件下進行3次平行。根據已有研究結果[18-19]，準確稱取2.00 g絞股藍粉末，固定乙醇濃度為70%，料液比為1∶20(g/mL)。所有樣品提取完成后抽濾獲得提取液，定容到250 mL并測定絞股藍總皂苷得率。

(1) 微波功率：在微波時間1 min，提取溫度70 ℃，浸提時間15 min的條件下，考察微波功率(200，400，600，800，1 000 W)對絞股藍皂苷得率的影響。

(2) 微波時間：在微波功率600 W，提取溫度70 ℃，浸提時間15 min的條件下，考察微波時間(1，2，3，4，5 min)對絞股藍皂苷得率的影響。

(3) 浸提溫度：在微波功率600 W，微波時間2 min，浸提時間15 min的條件下，考察浸提溫度(30，40，50，60，70 ℃)對絞股藍皂苷得率的影響。

(4) 浸提時間：在微波功率600 W，微波時間2 min，提取溫度60 ℃的條件下，考察浸提時間(5，10，15，20，25 min)對絞股藍皂苷得率的影響。

1.2.3 響應面設計 在單因素試驗結果的基礎上，使用Design Expert 8.0.6軟件以Box-Behnken中心組合設計對絞股藍皂苷提取過程進行響應面優化，考察微波功率、微波時間、提取溫度、提取時間4個因素對絞股藍皂苷得率的影響。

1.2.4 絞股藍皂苷含量測定 采用香草醛—冰醋酸顯色法[3]。以人參皂苷Rb1繪制標準曲線，得到標準曲線為：y(OD550 nm)=2.927 5x-0.011 9(R2=0.999 2)該標準曲線在皂苷含量為0.04～0.20 mg內線性良好，可以作為定量的基準。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 微波功率對皂苷得率的影響 由圖1可知，隨著微波功率的增加，絞股藍皂苷得率呈現先增加后減小的趨勢。微波功率從200 W提高到600 W的過程中，絞股藍粉末中各成分吸收更多的能量，分子的無規則熱運動顯著加強擴散速率大幅上升，因此皂苷得率顯著增大。但進一步提高微波功率后，皂苷得率則呈現小幅下降，這或許是高強度的微波作用引起強烈的分子極化效應，對絞股藍皂苷結構穩定性產生影響，從而影響了皂苷得率。

圖1 微波功率對絞股藍皂苷得率的影響

2.1.2 微波時間對皂苷得率的影響 由圖2可知，微波時間從1 min增加至2 min后絞股藍皂苷得率有較大增長，進一步延長微波處理時間得率則有一定下降。這說明適度的微波處理可以促進分子擴散的速率，有效提升絞股藍皂苷的得率，但微波處理時間過長則可能由于過量的微波產生強烈的熱效應破壞了絞股藍皂苷結構，造成皂苷得率的降低。

2.1.3 浸提溫度對皂苷得率的影響 由圖3可知，隨著提取溫度由30 ℃提高到60 ℃，絞股藍皂苷的得率逐漸增大，但提取溫度為70 ℃時皂苷得率略有下降。這是由于隨著提取溫度的上升，分子熱運動的增強使溶質的溶解動力顯著增強，但過高的溫度造成大量雜質溶出并對絞股藍皂苷的溶出造成影響，進而影響了皂苷得率[20]。

圖2 微波時間對絞股藍皂苷得率的影響

圖3 浸提溫度對絞股藍皂苷得率的影響

2.1.4 提取時間對皂苷得率的影響 由圖4可知，在超聲浸提條件下5 min的浸提時間過短，導致絞股藍皂苷的提取遠未充分。而浸提10 min即可獲得較高的得率，繼續延長浸提時間對皂苷得率影響較小。說明在超聲、微波的共同作用下，能顯著縮短浸提所需時間，提高提取效率。

圖4 浸提時間對絞股藍皂苷得率的影響

2.2 響應面優化與分析

基于單因素試驗的結果，設計試驗因素及水平(見表1)，并對提取工藝進行響應面優化，結果見表2。

逐項顯著性分析表明：試驗所選擇的因素中微波功率、微波時間以及提取時間對得率有極顯著的影響(P<0.000 1)，而提取溫度則影響不大(P=0.104 0)；交互項中有3個極顯著，分別是微波功率與微波時間、微波功率與提取溫度、微波時間與提取溫度；二次平方項均為極顯著(P<0.000 1)。

對試驗結果進行回歸分析，得到4個試驗因素對響應值皂苷得率的標準四元二次回歸方程(以編碼值為自變量)：

Y=23.47+0.69A+1.33B+0.11C+1.78D-1.05AB-0.49AC+0.16AD+0.77BC+0.012BD+0.028CD-1.70A2-1.60B2-1.10C2-1.61D2。

(1)

表2 試驗設計與結果

2.2.2 單因子效應分析 采用降維法分析單因子效應，將回歸方程(1)中任意3個變量固定在零編碼水平即得到另一個因素與響應值的關系，得各因素的單因子效應方程見式(2)。再將每個方程中的變量分別固定在-2、-1、0、1、2水平上，得到4個因素對絞股藍皂苷總得率的影響。

(2)

根據單因子效應方程繪制曲線見圖5。

由圖5可知，絞股藍皂苷的得率隨4個因素編碼值的增大都呈現出先增大后減小的趨勢。其中浸提時間和微波時間兩個因素在編碼值為0和1時的響應值均較高，而微波功率和浸提溫度兩個因素均在編碼為0時有較大的得率。

2.2.3 邊際效應分析 對各單因子效應分析方程求導即得該因子的邊際效應方程，反應總皂苷得率隨各因子水平而變化的速率。各因素的邊際效應方程：

表3 回歸模型方差分析表?

圖5 單因子效應曲線

(3)

根據方程(3)繪制邊際效應曲線，見圖6。

圖6 單因子邊際效應曲線

由圖6結合式(3)的斜率(決定系數)可知，4個因素中微波功率、微波時間、浸提溫度3個因素對得率增長的影響程度較為相似，而提取溫度則較小。4個因素對得率增長率影響的臨界編碼值分別為：微波功率A=0.203，微波時間B=0.416，提取溫度C=0.05，浸提時間D=0.553。當各因素編碼值小于臨界編碼值時，皂苷的得率不斷增大，但增大率逐漸放緩，直至達到最大值；當各因素編碼值大于臨界編碼值后則得率出現負增長，且降幅逐漸增大。

2.2.4 交互作用分析 為更直觀地反應各因素間的交互作用對絞股藍皂苷得率的影響，繪制得率與各因素的三維空間響應面。響應面圖形中的等高線形狀越圓則表明交互效應越弱，而橢圓越明顯則表明交互作用顯著[21]，通過對交互項響應面坡度平緩與陡峭的分析可以得出該條件改變對響應值影響的強弱[22]。

由圖7～9可知，微波時間、微波功率及浸提溫度3個因素間兩兩交互作用都很顯著。從圖7中響應面的陡峭程度可以看出，在一定的提取溫度和浸提時間下，微波功率與微波時間兩個因素對絞股藍皂苷得率的影響較為接近，但微波時間對曲面陡峭程度影響略大，因此微波時間對得率的影響略強于微波功率。從圖8中可以看出，當微波時間與提取時間一定的條件下，微波功率對得率的影響略大于浸提溫度。由圖9可以看出，在微波功率和浸提時間一定的條件下，微波時間對得率的影響稍強于浸提溫度。

圖7 微波功率與微波時間對皂苷得率的交互作用

圖8 微波功率與提取溫度對皂苷得率的交互作用

圖9 微波時間與提取溫度對皂苷得率的交互作用

2.2.5 最佳提取工藝的確定及驗證 Design Expert軟件模擬得到的最佳條件為：微波功率612.91 W，微波時間2.44 min，提取溫度62.0 ℃，提取時間12.80 min，此條件下得率為24.296 1 mg/g。

驗證實驗在微波功率613 W，微波時間145 s，提取溫度62.0 ℃，提取時間12.8 min的條件下重復3次，測得絞股藍皂苷得率為(24.08±0.37) mg/g。驗證實驗結果與預測值接近，表明該響應面模擬優化結果具有較好的準確性。

2.3 超聲—微波協同作用分析

在響應面優化絞股藍皂苷提取工藝的基礎上，以最佳提取工藝為對照，通過控制不同提取階段超聲、微波的啟停，考察不同操作條件對絞股藍皂苷得率的影響，進而分析超聲、微波間是否存在協同作用。試驗設計的參數、目的及結果見表4。采用spss 18.0軟件Duncan’s程序分析數據間顯著性差異，當P<0.05表示數據間具有顯著性差異。

由表4可知，在以最優提取工藝為基礎的不同提取條件下，通過改變超聲、微波的啟停對絞股藍皂苷得率影響顯著(P<0.05)。對比試驗1、2的結果可以看出，僅通過145 s的超聲、微波共同作用，絞股藍皂苷得率即可達到最優條件下71.6%，說明超聲、微波的共同作用階段在整個絞股藍皂苷的提取過程中起主要作用；比較試驗1、2、3的結果可以看出，在超聲、微波共同作用后，再經過12.8 min的無超聲浸提，可以達到最優條件下88.5%的提取效果，說明在超聲、微波共同作用的基礎上，浸提階段的超聲作用對得率有一定影響，但較為有限；對比試驗3、4的結果可以看出，浸提階段均無超聲，而前期在超聲微波共同作用下絞股藍皂苷得率遠高于僅使用微波提取結果，可見提取過程中超聲、微波具有顯著的協同作用。

表4 超聲—微波協同作用分析?

? 同一列數據帶不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

綜合以上試驗結果和分析可以看出，在整個提取過程中超聲、微波協同作用顯著，且協同作用階段比超聲浸提階段對絞股藍皂苷得率的影響強烈得多。這主要是由于超聲波可以產生強烈的空化效應，使物料分子運動的頻率和速率迅速增大，并通過一系列次級效應將原料的細胞壁破裂，提高目標產物從細胞內釋放速率[23]。若此時再輔以微波作用，使被照射物體產生分子極化效應與離子導電效應，同時利用物料在微波場中吸收能量的高度選擇性，迅速于物料內部產生熱效應，則可以在超聲空化作用基礎上結合微波產生的溫度梯度進一步強化目標產物的固液傳質速率，從而產生協同作用，顯著提高提取的效率[24-25]。結合試驗結果進行分析，甚至可能在超聲—微波的協同作用階段已經完成對絕大部分細胞的破碎及絞股藍皂苷的溶出。只是由于145 s的作用時間較短，這些已經從細胞內溶出的絞股藍皂苷尚未充分擴散到整個提取溶劑中，故需要一定時間的浸提才能達到較高的得率，因此超聲作用已經不再顯著。

3 結論

采用響應面法優化得到絞股藍皂苷的最佳提取條件為：開啟超聲(50 W)，微波功率613 W，微波時間145 s，提取溫度62.0 ℃，提取時間12.8 min，該條件下絞股藍皂苷得率為(24.08±0.37) mg/g。

在最佳提取條件的基礎上分析超聲、微波的協同作用效果表明，提取過程中超聲、微波間有顯著的協同作用。且協同作用階段對絞股藍皂苷得率的提高影響強烈，在整個提取過程中起主要作用。在超聲微波協同提取的基礎上結合一定時間的浸提可以進一步促進絞股藍皂苷的充分擴散，提高皂苷得率。

試驗中由于設備的超聲參數固定(50 W，40 kHz)無法設置，因此超聲與微波哪個因素對皂苷提取率的影響更顯著、超聲與微波各在何功率及作用時間分別多長時能達到最佳的協同作用無法考察，有待進一步研究。

[1] ZHAO Yang, XIE Zhuo-hong, NIU Yu-ge, et al. Chemical compositions, HPLC/MS fingerprinting profiles and radical scavenging properties of commercialGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino samples[J]. Food Chemistry, 2012, 134(1): 180-188.[2] LIU Fang, REN Dequan, GUO De-an, et al. Methoddevelop-ment for gypenosides fingerprint by high performance liquid chromatography with diode-array detection and the addition of internal standard[J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 2008, 56(3): 389-393.

[3] XIE Zhuo-hong, LIU Wei, HUANG Hai-qiu, et al. Chemical composition of five commercialGynostemmapentaphyllumsamples and their radical scavenging, antiproliferative, and anti-inflammatory properties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(21): 11 243-11 249.

[4] GANZLER K, SALGO A, VALKO K. Microwave extraction: a novel sample preparation method for chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 1986, 371: 299-306.

[5] CHEN Dao-jin, LIU Hui-min, XING Shao-fang, et al. Cytotoxic activity of gypenosides and gynogenin against non-small cell lung carcinoma A549 cells[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2014, 24(1): 186-191.

[6] YANG Fei, SHI Hai-ming, ZHANG Xiao-wei, et al. Two new saponins from tetraploid jiaogulan (Gynostemmapentaphyllum), and their anti-inflammatory and α-glucosidase inhibitory activities[J]. Food Chemistry, 2013, 141(4): 3 606-3 613.[7] MUELLER C, GARDENMANN A, KEIHOFF G, et al. Prevention of free fatty acid-induced lipid accumulation, oxidative stress, and cell death in primary hepatocyte cultures by aGynostemmapentaphyllumextract[J]. Phytomedicine, 2012, 19(5): 395-401.[8] 樸香蘭, 吳倩. 絞股藍研究進展[J]. 時珍國醫國藥, 2010, 21(7): 1 758-1 760.

[9] 仇小艷, 李向民, 苗玲, 等. 絞股藍總皂甙提取方法的比較研究[J]. 現代生物醫學進展, 2008, 8(10): 1 936-1 938.

[10] 楊昱, 白靖文, 俞志剛. 超聲輔助提取技術在天然產物提取中的應用[J]. 食品與機械, 2011, 27(1): 170-174.

[11] 張新宇, 張笛, 王琳, 等. 絞股藍皂苷提取純化工藝研究進展[J]. 食品工業科技, 2014, 35(18): 378-382.

[12] 張育松. 微波輔助提取絞股藍皂甙的初步研究[J]. 亞熱帶農業研究, 2008, 4(3): 225-228.

[13] 郭輝力, 鄧澤元. 微波干法輔助提取絞股藍總皂苷的研究[J]. 食品與機械, 2009, 25(1): 68-71.

[14] 易克傳, 徐凱, 楊萍, 等. 動態連續逆流提取絞股藍皂苷的研究[J]. 天然產物研究與開發, 2012, 24(2): 244-247.

[15] 樊紅秀, 劉婷婷, 劉鴻鋮, 等. 超臨界萃取人參皂苷及HPLC分析[J]. 食品科學, 2013, 34(20): 121-126.

[16] 林碩. 超聲—微波協同逆流提取的工藝及設備研究[D]. 合肥: 安徽農業大學, 2009: 34-40.

[17] 尤秀麗, 鄭建忠, 陳熔, 等. 響應面法優化絞股藍皂苷微波輔助-超聲提取工藝[J]. 食品研究與開發, 2016, 37(12): 52-56.

[18] 程軼群, 許飛躍, 周守標. 歙縣絞股藍總皂苷大孔樹脂純化研究[J]. 安徽農業科學, 2015, 43(33): 177-179.

[19] 黃玉蘭, 殷奎德, 岳才軍. 響應面法優化微波提取絞股藍愈傷組織中人參皂苷Rb1的工藝研究[J]. 激光生物學報, 2013, 22(6): 521-527.

[20] 張慧麗, 宋有濤, 辛如, 等. 超聲提取絞股藍總皂苷及抗氧化作用的研究[J]. 遼寧大學學報, 2006, 33(4): 346-348.

[21] 柯樂芹，張東旭，肖建中. 杏鮑菇深加工殘渣多糖酶法微波輔助提取工藝優化[J]. 農業工程學報, 2014, 30(21): 332-338.

[22] 智秀娟, 李棟, 曹新杰, 等. 苦蕎總皂苷的提取工藝優化[J]. 中國糧油學報, 2015, 30(7): 97-103.

[23] CRAVOTTO G, BOFFA L, MANTEGNA S, et al. Improved extraction of vegetable oils under high-intensity ultrasound and/or microwaves[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2008, 15(5): 898-902.

[24] 李楊, 趙樹法, 李婷, 等. 微波輔助萃取技術在食品工業中的研究進展[J]. 中國釀造, 2006(9): 5-8.

[25] WANG Yu-tang, YOU Jing-yan, YU Yong, et al. Analysis of ginsenosides inPanaxginsengin high pressure microwave-assisted extraction[J]. Food Chemistry, 2008, 110(1): 161-167.

Optimization on ultrasonic-microwave combined extraction of gypenosides and synergetic effect analysis

CHENG Yi-qunZHANGFanZHOUShou-biaoHERong-rongJIHang-yanHUANGYiJIYa-liCHENChun-hua

(CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,AnhuiNormalUniversity,Wuhu,Anhui241003,China)

Optimization on ultrasonic-microwave combined extraction of gypenosides, and the analysis on the synergistic effect between ultrasonic and microwave, were studied. The optimal extraction condition of gypenosides was obtained by response surface methodology. Four factors effect on the yield of gypenosides such as microwave power, microwave processing time, extraction temperature and extraction time were investigated. The synergistic effect of ultrasonic and microwave was analyzed by the yield of gypenosides under different extraction conditions. The optimal extraction condition of gypenosides by ultrasonic-microwave was ultrasonic open (50 W), microwave power at 613 W, microwave processing for 145 s, extraction temperature at 62.0 ℃, extraction time was 12.8 min. Under the optimal extraction condition the yield of gypenosides was 24.08±0.37 mg/g. The experiment results showed that the interaction between ultrasonic and microwave was significant and played a major role in the extraction process.Keywords：Gynostemmapentaphyllum; saponins; ultrasonic-microwave combined extraction; synergetic effect

安徽師范大學科研培育基金資助(編號：2014xmpy14)

程軼群(1987—)，男，安徽師范大學講師，碩士。

E-mail：cheng.sheng515@gmail.com

2016-06-27