固本防哮飲對哮喘緩解期小鼠肺組織內質網應激相關凋亡基因CRT和EDEM的影響

陸　遠　趙　霞

(南京中醫藥大學，江蘇省兒童呼吸疾病(中醫藥)重點實驗室，南京，210023)

?

固本防哮飲對哮喘緩解期小鼠肺組織內質網應激相關凋亡基因CRT和EDEM的影響

陸遠趙霞

(南京中醫藥大學，江蘇省兒童呼吸疾病(中醫藥)重點實驗室，南京，210023)

目的：探討中藥復方固本防哮飲對哮喘緩解期小鼠肺組織內質網應激相關的凋亡基因CRT和EDEM的影響。方法：結合前期研究采用卵蛋白(OVA)致敏和OVA-呼吸道合胞病毒(RSV)聯合誘導激發BALB/c雌性小鼠，建立哮喘緩解期動物模型，隨機分為正常組，模型組，固本防哮飲低、中、高劑量組，孟魯司特鈉組及地塞米松組。Real-time PCR法檢測肺組織中EDEM和CRT mRNA表達水平。結果：模型組小鼠肺組織中CRT表達顯著高于正常組(P<0.05)；固本防哮飲高、中劑量組，孟魯司特鈉組及地塞米松組小鼠肺組織中CRT mRNA表達均顯著低于模型組(P<0.05)，而EDEM在各組中表達無統計學意義(P>0.05)。結論：固本防哮飲防治哮喘減輕慢性氣道炎性反應的作用機制可能是通過抑制蛋白質未折疊反應相關的凋亡基因CRT表達所致。

固本防哮飲；哮喘緩解期；蛋白質未折疊反應；CRT；EDEM

哮喘是以廣泛多變的可逆性氣道阻塞、非特異性氣道高反應、慢性氣道炎性反應為特征的異質性疾病，具有喘息、氣促、胸悶和咳嗽的呼吸道癥狀，其強度可隨時間而變化[1]。慢性氣道炎性反應貫穿于哮喘的典型癥狀中，是研究哮喘有效治療手段的主要挑戰。研究發現即使在沒有典型臨床癥狀或肺功能正常的哮喘緩解期患者中，慢性氣道炎性反應依然普遍存在[2]。雖然近年來吸入性糖皮質激素等抗炎藥物已提升了哮喘癥狀的控制率，但糖皮質激素存在的多種不良反應限制了其成為哮喘治愈藥物的可能,因此亟需更安全且有效的替代治療藥物。中醫藥重視整體觀念，祛除外邪的同時強調扶正固本，是防治哮喘的理想療法。固本防哮飲為我國著名中醫兒科專家江育仁教授的經驗方，由玉屏風散合二陳湯加減而來，具有益氣固表，健脾化痰的作用，臨床運用多年治療哮喘安全有效并可減少復發率[3]。前期課題組發現固本防哮飲可顯著抑制哮喘易感基因ORMDL3在哮喘緩解期小鼠模型中的表達[4]。ORMDL3作為內質網應激(Endoplasmic Reticulum stress，ERS)下蛋白質未折疊反應(Unfolded Protein Response，UPR)的誘導因子，參與了由蛋白質未折疊反應介導的哮喘慢性氣道炎性反應和氣道重塑的過程[5]。因此，本研究試圖研究固本防哮飲對蛋白質未折疊反應下游細胞凋亡相關基因—CRT(Calreticulin)和EDEM(ER degradation enhancing mannosidase like-protein)的影響，探討固本防哮飲對抑制哮喘緩解期慢性氣道炎性反應的作用機制。

1　材料

1.1動物清潔級雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，質量18～22 g，購于昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，動物許可證號：SCXK(蘇)2013-0003。

1.2藥物孟魯司特鈉片：10 mg/片，由杭州默沙東藥業股份有限公司提供，生產批號：K004567。地塞米松片：0.75 mg/片，由辰飲藥業股份有限公司提供，生產批號：121203203。固本防哮飲：由炙黃芪、黨參、白術、茯苓、煅牡蠣、蟬蛻、陳皮、防風、辛夷、五味子和生甘草等11味藥組成，經南京中醫藥大學教研室鑒定其均為正品，按5∶3.33∶3.33∶3.33∶5∶2∶2∶1∶2∶2∶1的比例配伍，先取8倍量冷水浸藥30 min，煎30 min(沸后)，濾過；第2煎加6倍量水煎30 min，將2次煎液過濾合并濃縮，分別調至含生藥3 g/mL的溶液，密封于無菌量瓶，4 ℃儲存備用。卵蛋白(ovalbumin，OVA)購于美國Sigma公司。DMEM培養基，胎牛血清購于Gibco公司。人喉癌上皮細胞(HEP-2)和呼吸道合胞病毒A2型(Long株)由江蘇省兒童呼吸疾病(中醫藥)重點實驗室提供。

1.3試劑Trizol：美國Invitrogen公司；DEPC：南京凱基生物科技發展有限公司；逆轉錄試劑盒：大連Takara公司；Real time PCR定量試劑盒：大連Takara公司。

2　方法

2.1呼吸道合胞病毒(RSV)制備及病毒毒力測試

1)病毒制備：以人喉癌上皮細胞(Hep-2)為宿主擴增呼吸道合胞病毒A2型(Long株)，細胞培養及RSV擴增Hep-2采用含10%小牛血清(FBS)的DMEM培養液，于37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養。采用對數生長期細胞，Hep-2以每孔1.5～2×105/ L接種2孔板，匯合至單層后棄培養液，PBS漂洗2遍，接種病毒液200 μL，吸附1.5 h。加入適量含2%小牛血清的維持液繼續培養3～5d。待融合病變達80%以上，反復凍融3次，離心收集上清(即病毒液)，分裝后于-70 ℃保存備用。

2)病毒毒力測試：以細胞病變法測定RSV對Hep-2的半數感染量(TCID50)，Hep-2接種于96孔板，待長成單層時，除正常細胞對照組外，接種各稀釋度的病毒液(用維持液10倍梯度稀釋8個濃度)。吸附1.5 h后，棄病毒液并換含2%胎牛血清的維持液繼續培養，逐日觀察病變程度并記錄，以最高稀釋度不再出現新病變時為終點。Reed-Muench公式計算病毒TCID50，本次實驗中使用的RSV的毒力為104.167TCID50/mL。

2.2造模、分組及給藥參照前期研究造模方法[4]，加以改進制備哮喘緩解期動物模型。小鼠經適應性飼養1周后，第1、8天將除正常組外的小鼠給予腹腔注射0.2 mL致敏液(其中包含OVA 100 μg，硫酸鋁鉀1 mg，溶解于生理鹽水中)致敏，第15天時將小鼠放入霧化器的有機玻璃盒中，以2.5%OVA溶解于生理鹽水中霧化吸入30 min激發，連續霧化14d，1次/d。第32～54天以同樣的方法每隔2d霧化激發1次，每次均為30 min共22次，期間在第29、42、55天時分別以RSV 50 μL/只滴鼻誘導激發。正常組均以同體積生理鹽水代替OVA溶液致敏、RSV滴鼻誘導激發。末次激發后(第56天)，將除正常組外的小鼠分為模型組(蒸餾水20 mL/kg)、孟魯司特鈉組(2.6 mg/kg)、地塞米松組(1 mg/kg)、固本防哮飲高劑量組(36 g/kg)、固本防哮飲中劑量組(24 g/kg)、固本防哮飲低劑量組(18 g/kg)，灌胃1次/d，共30 d，正常組以等體積蒸餾水灌胃。末次給藥后24 h，麻醉脫頸椎處死小鼠，取肺組織放于液氮中，備用。

2.3Real-time PCR法檢測肺組織CRT和EDEM mRNA表達參照RNA抽提試劑盒說明書要求抽提總RNA。應用紫外分光光度儀測定A260/A280比值及濃度，A260/A280比值在1.8～2.0之間為符合純度要求。依據熒光定量PCR引物設計原則設計引物[4]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列分別為CRT：正向引物：5′-GACTGGGATGAACGAGCCAA-3′和反向引物：5′-GGTTTCCACTCGCCCTTGTA-3′，產物長度179bp；EDEM：正向引物：5′-CCGGCGCTTCAAAATAATGCC-3′和反向引物：5′-CCGAAGACCAACCAGAGCAC-3′，引物長度112bp。參照逆轉錄試劑盒操作，對已提取的mRNA進行逆轉錄，所得cDNA產物置于-20 ℃冰箱中保存備用。按照試劑盒說明書進行操作擴增。采用2ˉ△△CT對實時定量PCR結果進行數據處理。

2.4統計學方法計量資料采用Mean±SEM表示，數據處理和作圖采用Prism 5.0統計軟件，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Dunnett′s post hoc法，以P<0.05為差異有統計學意義。

3　結果

固本防哮飲對小鼠肺組織中CRT和EDEM mRNA表達的影響。由圖1可知，模型組小鼠肺組織中CRT表達顯著高于正常組(P<0.05)；固本防哮飲高、中劑量組，孟魯司特鈉組和地塞米松組小鼠肺組織中CRT mRNA表達均顯著低于模型組(P<0.05)，而EDEM在各組中mRNA表達無統計學意義(P>0.05)。

圖1　(a-b)各組小鼠CRT和EDEM mRNA相對表達量(Mean±SEM)

注：A-正常組；B-模型組；C-固本防哮飲高劑量組；D-固本防哮飲中劑量組；E-固本防哮飲低劑量組；F-孟魯司特鈉組；G-地塞米松組。

4　討論

哮喘患病率呈逐年上升趨勢，據WHO調查報道顯示全球范圍內已有超過3億的哮喘患者。目前西醫控制和預防哮喘發作的一線用藥為霧化吸入糖皮質激素聯合長效β2受體激動劑。糖皮質激素可通過抑制上皮來源的多種細胞因子和化學趨化因子減輕慢性氣道炎性反應，但約有10%患者屬于以中性粒細胞占主導的難治性哮喘[6]，該類患者對吸入性糖皮質激素并不敏感，同時長期吸入糖皮質激素的遠期療效并不優于安慰劑，而且會降低兒童骨骼中礦物質含量[23]。

內質網是負責細胞中多種蛋白質折疊、合成、轉運的主要細胞器，其理化性質和分子轉運功能的穩定是正確合成蛋白質的重要條件。當各種因素刺激下使蛋白質正常折疊量超過內質網負荷時，內質網會處于應激狀態并啟動一種名為蛋白質未折疊反應的適應性反應，從而產生并累積錯誤折疊的蛋白質[7]。內質網內分泌和降解相關通道功能和結構的完整性使分子轉運處于正常狀態，內質網自身適應能力的失調或在各種干擾條件下，均能損害內質網正常生理功能，導致內質網應激的出現。近年來，多項研究證實內質網應激參與了多種慢性疾病的病理機制[8]，以呼吸系統疾病為例，環境中煙霧、汽車尾氣和多種吸入性抗原被認為是內質網應激和失平衡的重要誘因，研究證實支氣管哮喘中慢性氣道炎性反應與長期存在的內質網應激下蛋白質未折疊反應密切相關[9]。同時，氣道上皮細胞以及炎性細胞中內質網應激和蛋白質未折疊反應的啟動是糖皮質激素抵抗型哮喘等重癥哮喘的重要病理機制[10]。

真核生物包括從酵母到人類的種族跨度在內，典型的蛋白質未折疊反應由位于內質網膜上的3種跨膜受體蛋白所調控[11]：需肌醇酶1(Inositol Requiring Enzyme 1，IRE1α)，轉錄激活因子6(Activating Transcription Factor 6，ATF6)，蛋白激酶R樣內質網激酶(Double-stranded RNA-activated Protein Kinase-like ER Kinase，PERK)。靜息狀態下，分子伴侶蛋白又稱為結合免疫球蛋白(Binding Immunoglobulin Protein，BIP)/葡萄糖調節蛋白78(Glucose-regulated Protein 78，GRP78)，與以上3種跨膜受體蛋白相結合，使其處于失活狀態[12]。內質網中錯誤折疊蛋白質或蛋白質殘片的增加，會使BIP從3種跨膜受體蛋白上分離，引發內質網應激。IRE1α和PERK受體的激活使其結構發生二聚化和自身磷酸化，而ATF6需要被轉運至高爾基體中才可被激活[7]。目前在不同的細胞內條件環境下，蛋白質未折疊反應中不同通路所扮演的角色并未明確。呼吸系統中誘發蛋白質未折疊反應以及內質網應激的主要外源性物質有香煙、空降顆粒物、細菌感染、病毒、屋塵螨、卵清蛋白等[9]。1)近期研究顯示支氣管哮喘中蛋白質未折疊反應以及內質網應激與主要產生活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)、一氧化氮的炎性反應信號通路網絡緊密聯系[13-14]。三條傳統蛋白質未折疊反應通路與NF-κB經典炎性反應通路密切相關，ATF6與NF-κB-IKK信號通路相連[15]，PERK-eIF2α通過抑制IκB的翻譯促進炎性反應因子表達并同時讓過多游離的NF-κB進入細胞核，激活的IRE1α可重新聚集IKK并促進NF-κB調控的炎性反應。中性粒細胞占主導的哮喘存在不同程度的糖皮質激素抵抗，糖皮質激素對該類哮喘氣道上皮細胞和炎性反應細胞中NF-κB炎性反應通路無效，而利用ERS或UPR阻斷劑可能具有對糖皮質激素抵抗的反轉作用[16]。2)過敏原暴露下，IRE1β可通過XBP1提高粘蛋白MUC5AC表達[17]，另可誘導與杯狀細胞分化和蛋白糖基化基因，促進杯狀細胞表型分化，提示IRE1β的激活可能參與了哮喘氣道高分泌的過程。3)哮喘易感基因ORMDL3可調控蛋白質未折疊反應，主要通過內質網鈣泵(Sarcoendoplasmic Reticulum Ca2+ATPase Pump，SERCA)調節鈣離子平衡,減少磷酸化eIF2A的表達，導致內質網負荷增加[5]。ORMDL3還可通過激活ATF6調控SERCA，而SERCA表達的減少與哮喘氣道重塑密切相關[18]。4)內質網應激在免疫中也具有重要作用，研究證實XBP1是血漿B細胞的起始轉錄因子[19]，蛋白質未折疊反應對樹突細胞分化和生存起到重要作用[20]。以上研究表明，內質網應激下蛋白質未折疊反應與哮喘氣道炎性反應、高分泌、重塑以及自身免疫等多方面均密切相關。

內質網應激下蛋白質未折疊反應也是內質網降解和細胞凋亡的重要途徑。1)IRE1α是進化意義上最古老以及最保守的蛋白質未折疊反應分支通路，擁有2個活躍的激酶和核糖核酸內切酶，而其核糖核酸內切酶促使mRNA編碼轉錄因子X箱式結合蛋白1(X-box-binding Protein 1，XBP1)翻譯為活化的形式XBP1s。XBP1s可調節內質網蛋白合成、磷脂合成和凋亡位點EDEM涉及的內質網降解過程(ER-associated Degradation，ERAD)。2)活化后的ATF6屬于從高爾基體釋放的胞質內轉錄因子，可提高對ERAD和XBP1基因編碼轉錄[21]。3)PERK可使真核起始轉錄因子2α(Eukaryotic Translational Initiation Factor 2α，eIF2α)磷酸化為eIF2β，減少高爾基體蛋白質合成從而降低內質網負荷[21]。此外，PERK還可通過ATF4等重要轉錄因子，調節細胞凋亡[22]。雖然，蛋白質未折疊反應是細胞的一種適應性反應，但內質網本身并非每次均能從應激狀態恢復至正常，持續和嚴重的內質網應激狀態可通過以上三條傳統蛋白質未折疊反應通路誘導細胞凋亡的發生。CRT可通過PERK受體蛋白調控免疫原性細胞死亡[23-25]，樹突細胞可通過識別遷移至細胞膜表面CRT而對已死亡的細胞進行處理[26]。

本研究發現固本防哮飲對蛋白質未折疊反應中凋亡相關基因CRT存在抑制作用，可能是其減輕哮喘慢性氣道炎性反應的作用機制。然而，CRT和EDEM對于內質網應激下蛋白質未折疊反應參與的哮喘病理生理過程，以及對固本防哮飲防治哮喘作用機制中扮演的具體地位仍然需要更多深入研究進行驗證。

[1]Global Initiative for Asthma.Global strategy for asthma management and prevention.[EB/OL].Revised，2014.(Assessed May 2014，at www.ginasthma.org.).

[2]Broekema M，Volbeda F，Timens W，et al.Airway eosinophilia in remission and progression of asthma：accumulation with a fast decline of FEV(1)[J].Respir Med，2010，104(9)：1254-1262.

[3]袁雪晶，孫軼秋.固本防哮飲聯合穴位敷貼治療兒童哮喘緩解期100例臨床研究[J].中華中醫藥雜志，2010，25(12)：2306-2309.

[4]Huang Z，Gao L，Zhao X，et al.Effect of Gubenfangxiao decoction on respiratory syncytial virus-induced asthma and expression of asthma susceptibility gene orosomucoid 1-like protein 3 in mice [J].Journal of traditional Chinese medicine，2016，36(1)：101-106.

[5]Cantero-Recasens G，Fandos C，Rubio-Moscardo F，et al.The asthma-associated ORMDL3 gene product regulates endoplasmic reticulum-mediated calcium signaling and cellular stress [J].Hum Mol Genet，2010，19(1)：111-121.

[6]McGrath KW，Icitovic N，Boushey HA，et al.A large subgroup of mild-to-moderate asthma is persistently noneosinophilic [J].Am J Respir Crit Care Med，2012，185(6)：612-619.

[7]Ron D，Walter P.Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response [J].Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8(7)：519-529.

[8]Toth A，Nickson P,Mandl A，et al.Endoplasmic reticulum stress as a novel therapeutic target in heart diseases [J].Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets，2007，7(3)：205-218.

[9]Osorio F，Lambrecht B，Janssens S.The UPR and lung disease [J].Semin Immunopathol，2013，35(3)，293-306.

[10]Kim SR，Kim DI，Kang MR，et al.Endoplasmic reticulum stress influences bronchial asthma pathogenesis by modulating nuclear factor κB activation [J].J Allergy Clin Immunol，2013，132(6)：1397-1408.

[11]Hetz C.The unfolded protein response：controlling cell fate decisions under ER stress and beyond [J].Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13(2)：89-102.

[12]Bertolotti A，Zhang Y，Hendershot LM，et al.Dynamic interaction of BiP and ER stress transducers in the unfolded-protein response [J].Nat Cell Biol，2000，2(6)：326-332.

[13]Cullinan SB，Diehl JA.Coordination of ER and oxidative stress signaling：the PERK/Nrf2 signaling pathway [J].Int J Biochem Cell Biol，2006，38(3)：317-332.

[14]Gotoh T，Mori M.Nitric oxide and endoplasmic reticulum stress [J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(7)：1439-1446.

[15]Yamazaki H，Hiramatsu N，Hayakawa K.et al.Activation of the Akt-NF-kappaB pathway by subtilase cytotoxin through the ATF6 branch of the unfolded protein response [J].J Immunol，2009，183(2)：1480-1487.[16]Kim HJ，Jeong JS，Kim SR，et al.Inhibition of endoplasmic reticulum stress alleviates lipopolysaccharide-induced lung inflammation through modulation of NF-κB/HIF-1α signaling pathway [J].Sci Rep，2013，3：1142.

[17]Martino ME，Olsen JC，Fulcher NB，et al.Airway epithelial inflammation-induced endoplasmic reticulum Ca2+store expansion is mediated by X-box binding protein-1 [J].J Biol Chem，2009，284(22)：14904-14913.

[18]Mahn K，Hirst SJ，Ying S，et al.Diminished sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase(SERCA)expression contributes to airway remodelling in bronchial asthma [J].Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(26)：10775-10780.

[19]Reimold AM，Iwakoshi NN，Manis J，et al.Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1 [J].Nature，2001，412(6844)：300-307.

[20]Iwakoshi NN，Pypaert M，Glimcher LH.The transcription factor XBP-1 is essential for the development and survival of dendritic cells [J].J Exp Med，2007，204(10)：2267-2275.

[21]Hotamisligil GS.Endoplasmic reticulum stress and the inflammatory basis of metabolic disease [J].Cell，2010，140(6)：900-917.

[22]DuRose JB，Scheuner D，Kaufman RJ，et al.Phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha coordinates rRNA transcription and translation inhibition during endoplasmic reticulum stress [J].Mol Cell Biol，2009，29(15)：4295-4307.

[23]Peters LR，Raghavan M.Endoplasmic reticulum calcium depletion impacts chaperone secretion，innate immunity，and phagocytic uptake of cells [J].J Immunol，2011，187(2)：919-931.

[24]Panaretakis T，Kepp O，Brockmeier U，et al.Mechanisms of pre-apoptotic calreticulin exposure in immunogenic cell death [J].EMBO J，2009，28(5)：578-590.

[25]Garg AD，Krysko DV，Verfaillie T，et al.A novel pathway combining calreticulin exposure and ATP secretion in immunogenic cancer cell death [J].EMBO J，2012，31(5)：1062-1079.

[26]Obeid M，Tesniere A，Ghiringhelli F，et al.Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death [J].Nat Med，2007，13(1)：54-61.

(2016-09-09收稿責任編輯：洪志強)

Effects of Gubenfangxiao Decoction on Lung Tissue ER Stress-associated Apoptotic Genes CRT and EDEM in Murine Asthmatic Remission Models

Lu Yuan，Zhao Xia

(Jiangsu Key Laboratory of Pediatric Respiratory Disease，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China)

Objective:To explore the effects of Gubenfangxiao Decoction(GBFXD)on lung tissue ER stress-associated apoptotic gene CRT and EDEM in murine asthma remission models．Methods:According to former studies，OVA sensitization and RSV-OVA were used for stimulation and inducement on BALB/c female mice to build animal asthma remission models，which were then randomly grouped into normal group，model group，GBFXD high dose group，GBFXD medium dose group，GBFXD low dose group，Montelukast Sodium group and Dexamethasone group.The mRNA levels of ER stress-associated apoptotic genes CRT and EDEM were detected via RT-PCR method．Results:The lung tissue CRT expression of the model group is significantly higher than that of the normal group(P<0.05)； In GBFXD high dose group，GBFXD medium dose group，Montelukast Sodium group and Dexamethasone group，inhibited ER stress-associated apoptotic genes CRT were observed through the significant reduction of mRNA expressions after GBFXD treatment.(P<0.05)Conclusion:Guben Fangxiao Decoction significantly attenuates RSV-OVA-induced persistent airway inflammation in murine asthma remission model.These effects may be mediated，at least partially，by inhibiting the activation of ER stress-associated apoptotic genes CRT.

Guben Fangxiao Decoction； Asthma remission； Unfolded protein response； CRT； EDEM

國家自然科學基金項目(編號：81473723)

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.09.003