抗骨增生膠囊含藥血清對大鼠成骨細胞增殖、分化的影響※

宋永周 劉會玲 馬 維 童九輝 李 飛 孫淑芹

(河北醫科大學第二醫院骨科，河北 石家莊 050000)

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抗骨增生膠囊含藥血清對大鼠成骨細胞增殖、分化的影響※

宋永周 劉會玲 馬 維△童九輝 李 飛1孫淑芹1

(河北醫科大學第二醫院骨科，河北 石家莊 050000)

目的 探討抗骨增生膠囊含藥血清對大鼠成骨細胞增殖、分化及骨保護蛋白(OPG)和核因子-кB受體活化子配體(RANKL)蛋白表達的影響。方法 采用中藥血清藥理學方法制備含抗骨增生膠囊大鼠血清。取乳鼠顱骨，利用復合膠原蛋白酶反復消化，離心，體外培養成骨細胞。加入不同濃度的抗骨增生膠囊含藥血清進行干預，噻唑藍(MTT)法檢測中藥血清對成骨細胞增殖的影響，測定堿性磷酸酶(ALP)活性，Western Blot檢測OPG和RANKL蛋白表達。結果 成骨細胞經抗骨增生膠囊含藥血清作用后，細胞的生長呈現不同程度的增殖，中、高劑量中藥組在24、48、72 h均有明顯的促進作用(P<0.01)，且呈劑量依賴性。低劑量中藥組在24、48 h時與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，72 h時作用較強(P<0.05 )。除低劑量組培養24 h外，低、中、高劑量中藥組培養24、48、72 h后，ALP分泌均呈不同程度增加，均有明顯的促進作用(P<0.01)。成骨細胞經過抗骨增生膠囊含藥血清低、中、高劑量作用72 h后，對比值進行統計分析，與空白對照組比較，OPG表達明顯升高(P<0.01)，RANKL表達明顯降低(P<0.01)。結論 抗骨增生膠囊含藥血清可以促進成骨細胞的增值、分化，從而促進骨形成。

成骨細胞；堿性磷酸酶；細胞增殖；藥物作用；中藥療法

骨質疏松癥是以骨量減少，骨的微觀結構退化為特征，致使骨的脆性增加，易于發生骨折的一種全身性骨骼疾病[1-2]。近年來，大量的臨床和實驗研究證明，中醫藥治療骨質疏松癥具有良好的效果[3-8]。抗骨增生膠囊為江蘇康緣藥業股份有限公司生產的治療骨關節疾病的中成藥，由熟地黃、肉叢蓉、骨碎補、淫羊藿、雞血藤、牛膝、狗脊、女貞子、萊菔子等藥物組成的復方制劑。本實驗采用血清藥理學和體外培養成骨細胞的方法來觀察抗骨增生膠囊含藥血清對成骨細胞增殖及骨保護蛋白(OPG)和核因子-κB受體活化子配體(RANKL)蛋白表達的影響，以探討其應用于防治骨質疏松癥的效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生24 h內SD乳鼠10只，用于分離培養原代成骨細胞。體質量200 g左右SD大鼠40只，雌雄不拘，用于制備含藥血清。由河北醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。

1.2 藥品及試劑 抗骨增生膠囊(江蘇康緣藥業股份有限公司，國藥準字Z10980006)，堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒(南京建成科技有限公司)，ALP測定試劑盒(南京建成科技有限公司)，復合膠原蛋白酶(Sigma公司)，胎牛血清(Sigma公司)，DMEM培養基(Sigma公司)，兔抗鼠OPG抗體(美國SANTA Cruz)，兔抗鼠RANKL抗體(美國SANTA Cruz)，FITC標記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)抗體(美國Jackson Immuno Research公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 含藥血清的制備 取40只SD大鼠，隨機分為空白對照組及低、中、高劑量中藥組，每組10只灌胃給藥。低劑量按人日臨床劑量，經人大鼠體表面積比值折算成相當于人臨床等效用量1.16 g/100 g給藥，中、高劑量中藥組予低劑量的3倍和9倍給藥，空白對照組予同等容積的0.9%氯化鈉注射液[9]。連續給藥12 d，末次給藥后2 h戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹主動脈采血，3 000 r/min離心10 min，分離血清后于56 ℃烤箱中滅活30 min，0.22 μm濾膜抽濾除菌，分裝后-20 ℃低溫保存備用。

1.3.2 成骨細胞的分離純化和培養 取10只出生24 h內SD乳鼠，無菌條件下取頭蓋骨，將頭蓋骨切碎至1 mm×1 mm大小，復合膠原蛋白酶37 ℃振蕩消化30 min，棄消化液，再次加入復合膠原蛋白酶37 ℃振蕩消化90 min，離心，棄上清液后加入含10%胎牛血清DMEM培養液，制成細胞懸液，靜置10 min，輕輕吸取上清液至另一培養瓶中，再靜置10 min，將上清液計數后按2×105/mL接種于培養瓶中，37 ℃、5%CO2培養箱培養，每3 d換液1次。當細胞增殖至占據瓶底約80%表面時，進行傳代。倒置相差顯微鏡每天觀察細胞的形態特征及生長情況并攝片。

1.4 檢測方法

1.4.1 成骨細胞的鑒定 取第3代細胞稀釋成2×105/mL ，接種于孔底鋪有無菌玻片的6孔板，待細胞長滿后，采用重氮鹽法進行ALP染色，對所培養的成骨細胞進行鑒定。

1.4.2 噻唑藍(MTT)法檢測中藥血清對成骨細胞增殖的影響 取第3代對數生長期細胞，制成單細胞懸液，按1×104/mL密度接種于96孔培養板，每孔200 μL，37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。棄上清液，分別加入10%空白血清，低、中、高劑量中藥血清培養基各200 μL，每組設6個復孔，繼續培養24、48、72 h，分別每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續培養4 h，棄上清液，各孔加150 μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，490 nm波長處測定吸光度值。重復3次。

1.4.3 ALP檢測 取第3代對數生長期細胞，制成單細胞懸液，按1×104/mL密度接種于96孔培養板，每孔200 μL，37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。棄上清液，分別加入10%空白血清，低、中、高劑量中藥血清培養基各200 μL，繼續培養72 h，棄去培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，每孔加入100 μL 0．1%Triton X-100，超聲裂解細胞，按ALP檢測試劑盒說明書進行操作，分光光度計測定490 nm 波長的吸光光度值，計算ALP含量。

1.4.4 免疫印跡(Western blot)測定OPG及RANKL蛋白表達 取第3代對數生長期細胞，制成單細胞懸液，按1×104/mL密度接種于25 mL培養瓶中，待細胞貼壁后，分別加入10%空白血清，低、中、高劑量中藥血清培養基，繼續培養72 h，棄上清，加入4 ℃裂解緩沖液中，超聲裂解細胞，在4 ℃的冰凍環境下14 000 r/min離心5 min。取上清液，二喹啉甲酸法(BCA)測定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，同時上Marker，電泳后進行轉膜和封膜。分別采用封閉一抗(兔抗鼠OPG抗體、兔抗鼠RANKL抗體)和熒光二抗(FITC標記的山羊抗兔IgG抗體)，掃描并且記錄各個條帶的積分光密度值(IOD)。使用其與內參蛋白IOD的比值來反映目標蛋白的表達水平。

2 結 果

2.1 各組不同時間點成骨細胞增殖情況比較 見表1。

組 別n培養時間24h48h72h空白對照組60.103±0.0110.233±0.0350.406±0.025低劑量中藥組60.195±0.0210.323±0.0390.598±0.040△中劑量中藥組60.423±0.014*0.599±0.042*0.812±0.022*高劑量中藥組60.639±0.036*0.828±0.030*0.960±0.035*

與空白對照組比較，*P<0.01，△P<0.05

由表1可見，成骨細胞經抗骨增生膠囊含藥血清作用后，細胞的生長呈現不同程度的增殖，中、高劑量中藥組在24、48、72 h均有明顯的促進作用(P<0.01)，且呈劑量依賴性。低劑量中藥組在24、48 h時與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，72 h時作用較強(P<0.05)。

2.2 各組不同時間點ALP活性水平比較 見表2。

與空白對照組比較，*P<0.01

由表2可見，除低劑量組培養24 h外，低、中、高劑量中藥組培養24、48、72 h后，ALP分泌均呈不同程度增加，均有明顯的促進作用(P<0.01)。2.3 成骨細胞的鑒定 剛接種的成骨細胞成球形,懸浮于培養液中并逐漸沉降貼壁展開，24 h后,大量細胞貼壁生長,呈長梭形、三角形或不規則多邊形,并且有2～3個突起,胞質透亮、飽滿，數量無明顯增多。單核成卵圓形，1～3個核仁,胞質豐富、清晰。4 d后,細胞數明顯增加,細胞周圍有半透明光暈,胞漿內可見許多大小不一的深色顆粒散布核周,胞核橢圓居中,輪廓清晰；7～8 d后細胞融合成單層,細胞突起細長,細胞體積較前明顯增大, 細胞鋪滿整個平皿底面, 細胞為梭形或立方塊狀，部分區域出現重疊生長(見圖1)。ALP染色的細胞，細胞核呈深紫黑色或灰黑色圓形或橢圓形，染色較胞漿深，胞漿呈淺紫黑色，高倍鏡下胞漿中見黑色顆粒,部分胞膜呈紫黑色線狀染色，成骨細胞密集區有大量的棕黑色顆粒(見圖2)。

圖1 接種7 d的成骨細胞(×40)

圖2 成骨細胞的ALP染色(×200)

2.4 各組OPG、RANKL蛋白的表達 見表3、圖3。

組 別OPG/β-actinRANKL/β-actin空白對照組0.149±0.0370.428±0.041低劑量中藥組0.223±0.030*0.327±0.028*中劑量中藥組0.259±0.030*0.301±0.018*高劑量中藥組0.403±0.036*0.252±0.025*

與空白對照組比較，*P<0.01

圖3 各組別OPG、RANKL蛋白表達

由表3可見，成骨細胞經過抗骨增生膠囊含藥血清低、中、高劑量作用72 h后，對比值進行統計分析，與空白對照組比較，OPG表達明顯升高(P<0.01)，RANKL表達明顯降低(P<0.01)。

3 討 論

目前研究認為,骨質疏松癥的發病機制主要是由于骨吸收和骨形成之間的平衡失調所致,其中成骨細胞在骨質疏松發病過程中起重要作用。中醫學認為，“ 腎主骨生髓”，腎虛則髓減骨枯。大量的臨床和實驗研究證明補腎壯骨中藥防治骨質疏松具有良好的效果[3-8]。抗骨增生膠囊由熟地黃、肉叢蓉、骨碎補、淫羊藿、雞血藤、牛膝、狗脊、女貞子、萊菔子等藥物組成。文獻報道淫羊藿、地黃、骨碎補、肉叢蓉等對成骨細胞增殖及分化有促進作用，對骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化也有促進作用，為中藥防治骨質疏松提供了實驗依據[9-12]。課題組在前期的研究成果中發現抗骨增生膠囊對骨折愈合的各個階段均有促進作用，能夠抑制白細胞介素lβ誘導的軟骨細胞凋亡，降低基質金屬蛋白酶13水平[13-15]。對于體外培養的成骨細胞增殖及分化，尚未見相關報道。

體外培養的成骨細胞具有與體內成骨細胞基本相同的生物學特性，能很好地反映成骨細胞的功能活動特點。ALP是成骨細胞分化和功能成熟的前期標志，是最常見的評價骨形成的指標。本研究采用復合膠原酶消化法分離培養乳鼠顱骨細胞，ALP染色呈陽性反應，說明本實驗體外培養的就是成骨細胞，且具有典型的成骨細胞生物學特征。在本研究中，通過體外實驗觀察了各組含藥血清對成骨細胞增殖、ALP活性的影響。研究結果表明，抗骨增生膠囊含藥血清具有明顯促進成骨細胞生長的分化增殖及ALP的分泌，且具有時間、濃度依賴性，對骨形成有促進作用。

OPG、RANKL和RANK 均為腫瘤壞死因子(TNF) 超家族成員[16]。成骨細胞可表達OPG與RANKL，二者嚴格控制著破骨細胞的分化，從而影響破骨細胞的形成和骨吸收。OPG是成骨細胞分化過程中產生的破骨細胞抑制因子，可作為餌受體與RANKL結合，從而阻斷RANKL與破骨細胞表面的RANK結合，從而阻斷骨吸收信號的傳遞，抑制破骨細胞的分化和成熟，誘導破骨細胞的凋亡。在本研究中，通過體外實驗觀察了各組含藥血清對成骨細胞OPG、RANKL蛋白表達的影響。研究結果表明，不同濃度的抗骨增生膠囊含藥血清均可增強OPG的表達，對RANKL的表達則有不同程度的抑制作用，與空白血清組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

總之，本實驗發現抗骨增生膠囊含藥血清能明顯促進成骨細胞的分化增殖，促進ALP的分泌，促進成骨細胞OPG的表達，抑制RANKL的表達。因此，抗骨增生膠囊含藥血清有可能通過促進成骨細胞OPG的表達，抑制RANKL的表達，進而通過阻斷骨吸收信號的傳遞，阻止破骨細胞的激活、分化，從而達到抑制破骨細胞活性，并促進破骨細胞凋亡，達到治療骨質疏松癥的目的，具體機制還有待于進一步深入研究和探討。本實驗對于拓展其治療范疇提供理論依據及實驗基礎。

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(本文編輯：董軍杰)

Effects of medicated serum of Kanggu-zengsheng capsules on proliferation and differentiation of osteoblasts in rats

SongYongzhou*,LiuHuiling,MaWei,etal.

*DepartmentofOrthopedics,SecondHospitalAffiliatedtoHebeiMedicalUniversity,Hebei,Shijiazhuang050000

Objective To study the effects of medicated serum of Kanggu-zengsheng capsules on proliferation and differentiation of osteoblasts, and the expression of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of NF-кB ligand (RANKL). Methods The serum of rats administered Kanggu-zengsheng capsules was obtained by the method of serum pharmacology. The cranium of the rats were collected, then digested with compound collagenase repeatedly, and then centrifuged, in order to extract osteoblasts, which were fed with serum from Kanggu-zengsheng capsules at different doses. The proliferation of osteohlasts and the activity of alkaline phosphatase (ALP) were detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method. The expressions of osteoprotegrin (OPG) and RANKL were detected by Western Blot. Results There were different proliferation effects on the growth of osteoblasts after intervention. There were significant promoting effects at the time points of 24, 48 and 72 h in middle and high dose groups (P<0.01), with dose-dependent. There were no statistical differences on the effects at the time points of 24 and 48 h in low-dose group as compared with those in blank control group (P>0.05), and there were better effects at the time of 72 h (P<0.05). The secretions of ALP at 24, 48 and 72 h were enhanced at different degrees in low, middle and high dose groups (P<0.01), except the 24 h of low dose group. The expressions of OPG 72 h after intervention in low, middle and high dose groups were significantly increased as compared with those in blank control group (P<0.01), and the expressions of RANKL were lower (P<0.01). Conclusion The serum containing of Kanggu-zengsheng capsules can stimulate proliferation and differentiation of osteoblasts, then promote the bone formation.

Osteoblast; Alkaline phosphatase; Proliferation; Pharmacological action; Traditional Chinese herbs therapy

※ 項目來源：河北省醫學科學研究重點課題(編號：20150666)

△ 通訊作者：河北醫科大學第二醫院骨科，河北 石家莊 050000

1 河北省定州市人民醫院CT核磁科，河北 定州 073000

宋永周(1973—)，男，副教授，博士。研究方向：骨關節退行性疾病。

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.08.017

R-332;R285.5;R329.24;R329.28;R681.053.1

A

1002-2619(2016)08-1187-05

2016-05-17)