強骨膠囊對糖尿病腎病患者維生素D-FGF23-Klotho蛋白內分泌軸及骨代謝指標的影響

蘇保林 李 敬 陳剛毅

(廣州中醫藥大學第一附屬醫院腎病科，廣東 廣州 510405)

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強骨膠囊對糖尿病腎病患者維生素D-FGF23-Klotho蛋白內分泌軸及骨代謝指標的影響

蘇保林 李 敬1陳剛毅

(廣州中醫藥大學第一附屬醫院腎病科，廣東 廣州 510405)

目的 觀察糖尿病腎病(DN)患者維生素D、成纖維細胞生長因子23(FGF23)、Klotho蛋白及相關骨代謝指標的變化，初步探討強骨膠囊對慢性腎臟病骨礦物質代謝紊亂(CKD-MBD)的影響。方法 將DN-Ⅳ期患者75例隨機分為2組。對照組37例予常規西醫治療，治療組38例在對照組治療基礎上加用強骨膠囊治療。治療3個月后比較2組血肌酐(Cr)、鈣(Ca)、磷(P)、鈣磷乘積(Ca×P)、全段甲狀旁腺激素(iPTH)、25-羥維生素D[25-(OH)D]、血清FGF23、Klotho蛋白、骨特異性堿性磷酸酶(BAP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)、骨密度(BMD)及T值，選取同時期我院體檢中心的健康志愿者35例作為健康組。結果 治療組、對照組治療前Cr、P、Ca×P、iPTH、FGF23、BAP 、TRAP5b明顯高于健康組(P<0.05)，校正Ca、25-(OH)D、Klotho蛋白、BMD、T值明顯低于健康組(P<0.05)；2組治療后FGF23、BAP、TRAP5b均較本組治療前下降(P<0.05)，治療組下降更明顯(P<0.05)；2組治療后Klotho蛋白、BMD、T值均較本組治療前升高(P<0.05)，治療組升高更明顯(P<0.05)；治療組治療后校正Ca、Ca×P、25-(OH)D與本組治療前比較明顯升高(P<0.05)，對照組以上指標治療前后差異無統計學意義(P>0.05)。Pearson相關性分析顯示BMD與BAP、TRAP5b、FGF23呈負相關(P<0.05)，與Klotho蛋白、25-(OH)D呈正相關(P<0.05)，而與Cr、Ca、iPTH無相關性(P>0.05)。結論 強骨膠囊可以改善骨代謝，提高骨密度，增強骨礦化，其作用機制或許與影響維生素D-FGF23-Klotho蛋白內分泌軸有關。

糖尿病腎病；膠囊；中藥療法

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是全球性公共衛生問題，糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是DM主要微血管并發癥，是引起終末期腎臟病(end-stage renal disease，ESRD)的主要原因之一。根據流行病學統計研究，預計到2030年，世界范圍內的DM患者將達到3.66億，而DN患者將超過1億[1]。鈣磷代謝紊亂是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)特別是ESRD患者重要的并發癥之一，近年來CKD骨礦物質代謝紊亂(CKD-mineral and bone disorder，CKD-MBD)成為研究熱點。成纖維細胞生長因子23(FGF23)是近年發現的主要由成骨細胞分泌的重要內分泌因子，參與機體鈣、磷及維生素D代謝的調節，形成維生素D-FGF23-Klotho蛋白內分泌軸。2015-05—2015-12，我們通過觀察DN患者維生素D、FGF23、Klotho蛋白及相關骨代謝指標的變化初步探討強骨膠囊對CKD-MBD的影響，結果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取廣州中醫藥大學第一附屬醫院腎病科門診30例和住院45例，共75例患者，按隨機數字表法分為2組。治療組38例，男20例，女18例；年齡48～65歲，平均(57.28±7.42)歲；病程10～16年，平均(13.16±2.08)年；血紅蛋白(Hgb)(100.53±7.19)g/L；糖化血紅蛋白(HbA1c)(7.32±1.12)%；體質量指數(BMI)(21.07±2.06)；平均動脈壓(MAP)(13.80±2.57)kPa。對照組37例，男19例，女18例；年齡50～67歲，平均(59.31±6.97)歲；病程11～16年，平均(12.97±2.33)年；Hgb(98.76±10.13)g/L； HbA1c(7.87±0.92)%；體質量指數(BMI)(20.74±2.72)；MAP(14.03±2.78)kPa。2組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。選取同時期我院體檢中心的志愿者共35例作為健康組，經體格檢查及實驗室檢查，綜合評估排除心、腦、肝、腎、肺及內分泌等主要器官系統病變。其中男19例，女16例；年齡45～62歲，平均(51.88±9.92)歲。健康組性別、年齡分別與治療組、對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

1.2 病例選擇

1.2.1 診斷標準

1.2.1.1 DM診斷標準 參考世界衛生組織(WHO)2011年標準[2]：有糖尿病癥狀(高血糖所導致的典型的癥狀，包括多尿、多飲、多食、不明原因的體質量下降、皮膚瘙癢及視力模糊等)，并且隨機血糖(靜脈血漿葡萄糖水平)≥11.1 mmol/L，或空腹血糖(靜脈血漿葡萄糖水平)≥7.0 mmol/L，或葡萄糖負荷2 h血糖(靜脈血漿葡萄糖水平)≥11.1 mmol/L。1.2.1.2 DN診斷標準 參考《中國2型糖尿病防治指南(2013年版)》[3]，符合以下任何一項可以考慮為DN：①大量白蛋白尿；②糖尿病視網膜病變伴微量白蛋白尿；③在10年以上糖尿病病程的1型糖尿病中出現微量白蛋白尿。以下情況應考慮非DN：糖尿病病程較短，單純腎源性血尿或蛋白尿伴血尿，短期內腎功能迅速惡化，不伴視網膜病變，突然出現水腫和尿白蛋白排泄率≥300 mg/24h而腎功能正常，顯著腎小管功能減退，合并明顯的異常管型。鑒別困難時可通過腎穿刺病理檢查進行鑒別。

1.2.2 納入標準 ①診斷符合DN標準，且按照國際公認的1987年Mogensen分期[4]屬于Ⅳ期患者；②知情同意者；③年齡18～65歲。

1.2.3 排除標準 ①進行血液透析或腹膜透析的患者；②合并感染、腫瘤、慢性肝病、心力衰竭、結核及酮癥酸中毒患者；③服用免疫抑制劑或糖皮質激素患者；④正在或近3個月服用鈣劑及維生素D類等影響骨代謝藥物的患者；⑤妊娠患者。

1.3 治療方法

1.3.1 對照組 予優質蛋白飲食(每日0.6～0.8 g/kg攝入蛋白質)，皮下注射胰島素控制血糖(目標值空腹血糖6.0 mmol/L，餐后2 h 血糖8.0 mmol/L)，他汀類降脂藥物調節血脂，鈣拮抗劑，α、β-受體阻滯劑等控制血壓[目標值18.00/13.33 kPa(135/85 mmHg)]，促紅細胞生成素糾正貧血(血紅蛋白目標值110 g/L)等基礎治療，不予鈣劑及維生素D類等影響鈣磷代謝的藥物。

1.3.2 治療組 在對照組治療基礎上加用強骨膠囊(北京岐黃制藥有限公司，國藥準字Z20030007，0.25 g×30粒/瓶) 1粒，每日3次口服。

1.3.3 健康組 不予特殊處理。

1.3.4 療程 治療組、對照組均治療3個月后統計臨床療效。

1.4 觀察指標 治療組、對照組治療前后分別采集空腹外周靜脈血標本送至廣州中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科檢測血肌酐(Cr)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、25-羥維生素D[25-(OH)D]、鈣(Ca)、磷(P)、全段甲狀旁腺激素(iPTH)；同時計算校正鈣、鈣磷乘積(Ca×P)。其中校正鈣(mmol/L)=血清總鈣(mmol/L)+0.8×(0.4-白蛋白濃度g/dL)。健康組入組時檢測以上指標。

血清可溶性Klotho蛋白、FGF23、人骨特異性堿性磷酸酶(BAP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)測定：均采用酶聯免疫吸附(ELISA)雙抗體夾心法測定，試劑盒均購自上海盛唐生物科技有限公司。血清標本采集、試劑配置、操作步驟均嚴格按照說明書進行。

骨密度(BMD)測定：采用GE Medical Systems Prodigy雙能X射線吸收儀(DXA)測量所有受試者第1～4腰椎，測得的BMD值均以g/cm2為單位，T值為與正常年輕成人(峰值骨量)比較值。根據WHO骨質疏松診斷標準[5]：T值≥-1.0為正常；-2.5

2 結 果

2.1 3組治療前后生化指標比較 見表1。

表1 3組治療前后生化指標比較 ±s

與健康組比較，*P<0.05；與本組治療前比較，△P<0.05；與對照組治療后比較，#P<0.05

由表1可見，治療組、對照組治療前Cr、P、Ca×P、iPTH明顯高于健康組(P<0.05)，校正Ca、25-(OH)D明顯低于健康組(P<0.05)；治療組治療后校正Ca、Ca×P、25-(OH)D與本組治療前比較明顯升高(P<0.05)；對照組各指標治療前后比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 3組治療前后相關指標比較 見表2。

表2 3組治療前后相關指標比較 ±s

與健康組比較，*P<0.05；與本組治療前比較，△P<0.05；與對照組治療后比較，#P<0.05

由表2可見，治療組、對照組治療前FGF23、BAP、TRAP5b明顯高于健康組(P<0.05)，Klotho蛋白、BMD、T值明顯低于健康組(P<0.05)；2組治療后FGF23、BAP、TRAP5b均較本組治療前下降(P<0.05)，治療組下降更明顯(P<0.05)；2組治療后Klotho蛋白、BMD、T值均較本組治療前升高(P<0.05)，治療組升高更明顯(P<0.05)。

2.3 BMD與各指標的相關分析 以BMD作為自變量，行Pearson相關性分析顯示DN患者BMD 水平與BAP、TRAP5b、FGF23呈負相關(r=-0.593，P<0.01；r=-0.601，P<0.05；r=-0.645，P<0.05)，與Klotho、25-(OH)D呈正相關(r=0.757，P<0.05；r=0.860，P<0.01)，而與Cr、Ca、iPTH無相關性(r=0.183，P>0.05；r=0.179，P>0.05；r=0.095，P>0.05)。見表3。

表3 DN患者BMD與各指標的相關性

3 討 論

CKD-MBD是由于CKD患者鈣磷代謝紊亂及長期透析繼發的骨代謝活動異常，是CKD重要并發癥之一，其不僅可導致骨骼損壞，嚴重降低患者的生活質量，而且還可以導致血管鈣化及心血管事件的增加，影響CKD患者的預后。FGF23是一種由骨細胞和成骨細胞合成的具有內分泌功能的蛋白質，主要功能為抑制腎臟對磷酸鹽的重吸收，促進尿磷排泄。現已證實，FGF23在骨—腎—甲狀旁腺軸中起重要作用，參與調控骨礦物質代謝[6]。FGF23通過與靶組織上的成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptors，FGFRs)結合，進而激活下游信號通路，介導其生物學活性。FGF23與FGFRs結合時需要Klotho蛋白參與，Klotho蛋白是體內FGF23介導受體活化所必需的輔助因子[7]。

在鈣磷代謝方面，越來越多的證據顯示，在維生素D、FGF23及Klotho蛋白之間存在某種內在的相互聯系，形成一個內分泌調節軸。正常情況下，由腎臟1α羥化酶催化合成的活性維生素D與維生素D受體相互作用下抑制腎素的生成。在腎素—血管緊張素—醛固酮(RAAS)系統不被激活的情況下，Klotho蛋白作為FGF23的輔助因子發揮正常功能，而FGF23作為1α羥化酶合成的負調節因子發揮正常的調節功能。某些異常情況下，由于1α羥化酶減少導致活性維生素D的合成減少，低水平的活性維生素D又使腎素生成增加，激活RAAS系統，導致Klotho蛋白表達減少，而Klotho蛋白又是FGF23發揮正常信號傳導的重要因子，這樣就引起FGF23水平升高。高水平的FGF23又抑制1α羥化酶的活性，進一步降低活性維生素D的水平。這樣的反饋環就導致維生素D缺乏，RAAS系統激活，FGF23升高及腎臟分泌Klotho減少[8]。

現已證實，甲狀旁腺組織表達Klotho蛋白和FGFRs。FGF23與甲狀旁腺上的FGFRs-Klotho蛋白復合物結合，通過活化絲裂原活化蛋白激酶旁路發揮對甲狀旁腺合成的調控作用[9]。在CKD透析患者血漿中FGF23水平明顯升高，增高的FGF23與血磷和甲狀旁腺激素(PTH)水平呈正相關[10]，CKD患者繼發性甲狀旁腺功能亢進的成因可能與FGF23-Klotho蛋白軸失衡密切相關。

BAP是成骨細胞分泌活動的標志物之一，分子量為80 kDa，主要在骨形成及礦化過程中發揮作用，腎功能減退和透析濾過不影響其血清濃度，易于檢測，且研究表明與iPTH及骨組織形態學相關性較好[11]。當人體鈣營養不良時血鈣下降，iPTH上升，促進腎臟合成1，25(OH)2 D3，后者可使靜止的成骨細胞轉變成活動的成骨細胞，合成大量的BAP釋放進入血液[12]。BAP能夠快速、準確地評價體內鈣的營養狀況，可以早期反映骨轉換改變。TRAP5b主要存在破骨細胞中，在成骨細胞含量較少。血液中的TRAP5b主要來源于骨吸收過程中破骨細胞的釋放，在骨吸收的過程中,破骨細胞活躍并大量分泌TRAP5b。TRAP5b值越高，BMD值越低，骨質越疏松。TRAP5b可以作為較敏感的骨吸收指標，是反映破骨細胞活性和骨吸收狀態的特異性指標[13]。

腎性骨病屬中醫學骨痹、骨痿范疇，其病因為年老體衰，肝腎虧虛，其病理特點是“本虛標實”。中醫學認為，腎主骨生髓。《素問·陰陽應象大論》曰“腎生骨髓……在體為骨”，骨骼的生長、發育、修復，均需依賴腎臟精氣的滋養和推動。強骨膠囊所含骨碎補為水龍科植物槲蕨的干燥根莖，其性溫味苦，苦能瀉能燥，溫能通能散，入腎補骨，補中有行，行中有補，具有補腎強骨、養傷止痛之功效，在臨床上廣泛應用于腎虛腰痛、耳鳴耳聾、牙齒松動、跌仆閃挫、筋骨傷折等癥[14]。現代藥理研究顯示，骨碎補提取物骨碎補總黃酮具有增加骨量，改善骨質量，維持骨微結構的完整程度，增強成骨細胞活性，促進成骨細胞分化與增殖，促進鈣在骨的沉積，增強骨的礦化等作用[15]。

查閱文獻，關于中成藥對于DN患者維生素D-FGF23-Klotho蛋白內分泌軸的影響少有報道。本研究擬通過觀察DN患者骨密度與維生素D-FGF23-Klotho蛋白內分泌軸及骨代謝指標的相關性，初步探討中醫中藥對腎性骨病的調節作用。本研究中，我們發現與健康組比較，DN患者P、Ca×P、iPTH、FGF23、BAP、TRAP5b明顯升高(P<0.05)，校正Ca、25-(OH)D、Klotho蛋白、BMD、T值明顯降低(P<0.05)，說明DN患者存在嚴重的鈣磷代謝紊亂及骨質疏松；經對癥及強骨膠囊治療3個月后，2組FGF23、BAP、TRAP5b均下降，且治療組下降更明顯(P<0.05)，Klotho蛋白、BMD、T值均升高，治療組升高更明顯(P<0.05)，行Pearson相關性分析顯示DN患者BMD水平與BAP、TRAP5b、FGF23呈負相關，與Klotho蛋白、25-(OH)D呈正相關，而與Cr、Ca、iPTH無相關性。本研究提示強骨膠囊可以改善骨代謝，提高骨密度，增強骨礦化，推測其作用機制與影響維生素D-FGF23-Klotho蛋白內分泌軸有關，至于其具體作用途徑則需通過進一步研究驗證，為我們下一步深入研究CKD-MBD提供了思路。

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(本文編輯：董軍杰)

Effects of Qianggu capsule on Vitamin D- fibroblast growth factors 23- Klotho protein endocrine axis and bone metabolism in patients with diabetic nephropathy

SUBaolin*,LIJing,CHENGangyi.

*DepartmentofNephrology,FirstHospitalAffiliatedtoGuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangdong,Guangzhou510405

Objective To observe the changes of Vitamin D, fibroblast growth factors 23 (FGF23), Klotho protein and bone metabolism indexes in patients with diabetic nephropathy (DN), and to preliminary study the effects of Qianggu capsule on chronic kidney disease bone mineral metabolism disorder (CKD-MBD). Methods 75 DN-Ⅳ patients were randomly divided into two groups. 37 cases in control group were treated by routine western medicine treatment, and 38 cases in treatment group were treated by Qianggu capsule on the basis of control group treatment. The serum creatinine (Cr), calcium (Ca), phosphorus (P), Ca×P, intact parathyroid hormone (iPTH), 25-hydroxy vitamin D[25-(OH)D], serum FGF23, Klotho protein, bone-specific alkaline phosphatase (BAP), tartrate-resistent acid phosphatase 5b (TRAP5b), bone mineral density (BMD) and T value after three months treatment were observed in two groups. 35 healthy volunteers were selected as healthy control group in our medical center at the same period. Results The Cr, P, Ca×P, iPTH, FGF23, BAP, TRAP5b before treatment in treatment and control groups were significant higher than those in healthy group (P<0.05), and the correction of Ca, 25-(OH) D, Klotho protein, BMD and T value were lower (P<0.05). The FGF23, BAP and TRAP5b after treatment were decreased in treatment and control group (P<0.05), and the decrease in treatment group was more significant (P<0.05). The Klotho protein, BMD and T value after treatment were increased in treatment and control group (P<0.05), and the increase in treatment group was more significant (P<0.05). The correction of Ca, Ca×P and 25-(OH) D after treatment were increased in treatment group (P<0.05), and there were no statistical differences on such indexes before and after treatment in control group (P>0.05). Pearson correlation analysis showed that a negative relation between BMD and BAP, TRAP5b, FGF23, respectively (P<0.05), and Klotho protein had positive correlation with 25-(OH) D (P<0.05) while there were no correlation with Scr, Ca and iPTH (P>0.05). Conclusion Qianggu capsule can improve bone metabolism, increase BMD, and enhance bone mineralization, the effects may be related with Vitamin D- FGF23- Klotho protein endocrine axis.

Capsule; Diabetic nephropathy; Traditional Chinese herbs therapy

1 華南師范大學醫院內科，廣東 廣州 510631

蘇保林(1980—)，男，主治中醫師，碩士。從事慢性腎臟病的臨床研究工作。

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.08.005

R692.390.531

A

1002-2619(2016)08-1142-05

2016-01-16)