拮抗阪崎腸桿菌乳酸菌的篩選鑒定及抑菌特性

杜靜芳，繆璐歡，馬歡歡，呂欣然，李 瑩，白鳳翎*，李 春，勵建榮（渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

拮抗阪崎腸桿菌乳酸菌的篩選鑒定及抑菌特性

杜靜芳，繆璐歡，馬歡歡，呂欣然，李 瑩，白鳳翎*，李 春，勵建榮
（渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）是引起新生兒敗血癥、腦膜炎和壞死性小腸結腸炎的條件致病菌，感染后死亡率高達80%。實驗采用雙層瓊脂擴散法從淡水魚腸道（19 株）和泡菜（7 株）中篩選出1 株來源于鯉魚腸道的對Enterobacter sakazakii（106CFU/mL）具有較強拮抗作用的乳酸菌菌株LY-4。結果表明，抑菌活性物質存在于乳酸菌無細胞上清液（cell free supermatant，CFS）中，抑菌最佳培養時間為28 h。CFS經胃蛋白酶處理可完全喪失抑菌活性，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶處理后抑菌活性降至76.44%和54.38%，對α-淀粉酶不敏感；在pH 3.0～4.5范圍內保持抗菌活性穩定；經40～80 ℃范圍內處理2 h后其拮抗活性基本不變，100 ℃和121 ℃處理2 h后活性降至79.57%和75.71%。初步判定菌株LY-4產生的抑菌物質為非糖基化類細菌素，并篩選出初步純化抑菌物質的最佳萃取劑為乙酸乙酯，粗提物的最小抑菌濃度為6.0 mg/mL。經生理生化和16S rDNA鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

乳酸菌；阪崎腸桿菌；鯉魚腸道；篩選與鑒定；抑菌作用

阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）是近些年嬰兒配方食品中新發現的腸桿菌科的一種條件致病菌[1]，1980年由黃色陰溝腸桿菌更名為阪崎腸桿菌（E. sakazakii），由其引發的嬰兒和早產兒腦膜炎、敗血癥及壞死性結腸炎的病例已在全球相繼出現，死亡率高達80%以上。研究證明，E. sakazakii可誘導腸壁上皮細胞產生NO引起IEC-6細胞死亡，增加壞死性小腸結腸炎的發病率[2]。從1961年至今60多例關于E. sakazakii對不同人群感染率的報道顯示嬰兒屬于E. sakazakii感染的高危人群[3]。近幾年國內也爆發了多起E. sakazakii的重大感染事件[4]，引起各界和研究人員的普遍關注。

乳酸菌通過形成乳酸、乙酸等有機酸、過氧化氫、雙乙酰、乳酸菌素、羅伊菌素、羥基脂肪酸、環狀肽等抑菌物質，有效地控制食品中致腐和致病微生物的生長[5]。乳酸菌在自然界中分布廣泛，從發酵乳制品、發酵肉制品、發酵面團、泡菜以及人畜胃腸道均可分離獲得對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、副溶血弧菌、單核增生李斯特菌和大腸桿菌O157:H7等具有拮抗性的乳酸菌菌株[6-10]。Saddam等[11]研究分離自嬰兒糞便中的Lb. acidophilus和Lb. cas ei，發現兩者對E. sakazakii的抑菌圈直徑分別達到22.0 mm和32.0 mm，并鑒定出抑菌物質為不耐熱的細菌素類。Shaker等[12]以牛奶為載體研究乳酸菌對E. sakazakii的抑制作用，發現5 h后E. sakazaki i數量開始變化，實驗組中E. sakazakii的數量開始減少，7 d后降至3.08（lg（CFU/mL）），而對照組增加至5.40（lg（CFU/mL）），說明乳酸菌可顯著抑制牛奶中E. sakazakii生長繁殖。Hunter等[13]通過動物實驗證實Lb. bulgaricus能夠減少腸壁中NO的產生，保護腸細胞的完整性，降低由E. sakazakii引起的壞死性小腸結腸炎發病率。目前國內針對E. sakazakii拮抗性乳酸菌的篩選與研究未見報道。本實驗從淡水魚腸道和泡菜中篩選對E. sakazakii具有拮抗作用的乳酸菌菌株，對其抑菌作用物質進行初步研究，為應用乳酸菌生物制劑控制食品中E. sakazakii奠定理論與應用基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

應試菌株：Enterobacter sakazakii ATCC29004，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，由渤海大學食品科學研究院保藏；供試菌株：7 株乳酸菌分離自遼西地區傳統發酵酸菜，19 株乳酸菌分離自鯉魚、鳙魚、鯽魚和鏡鯉等淡水魚腸道。

1.1.2 培養基與試劑

MRS培養基、LB肉湯、營養瓊脂 北京奧博星生物技術有限公司；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒、DNA Marker-D、Taq PCR Master mix 生工生物工程（上海）股份有限公司；乳酸菌生化鑒定管 杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設備

DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺 東聯哈爾（北京）儀器制造有限公司；賽福智能生化培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠；5804R冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國艾本德股份有限公司；DYY-8C電泳儀北京市六一儀器廠；Cheimdox XRS凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；RE-2000A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；LabconcoFreeZone 2.5臺式真空冷凍干燥機美國Labconco公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌菌株的拮抗實驗

分別取渤海大學食品科學與工程學院微生物學與分子生物學實驗室保藏的分離自淡水魚腸道和泡菜中的乳酸菌，在MRS液體中活化3 代后取菌株24 h MRS發酵液經4 ℃、8 000 r/min離心5 min的菌體和上清液，上清液經0.45 μm濾器過濾獲無細胞上清液（cell free supernatant，CFS）；E. sakazakii ATCC29004在LB肉湯中活化（37 ℃恒溫、靜置培養12 h）至3 代，濃度維持在107CFU/mL水平（通過菌落計數得出），以稀釋10 倍后濃度達到106CFU/mL的E. sakazakii菌懸液為指示菌，參照文獻[14]利用雙層瓊脂擴散法進行拮抗性實驗，篩選拮抗性強的乳酸菌菌株，設置3 個平行。

1.2.2 拮抗性乳酸菌的篩選與鑒定

參照方法1.2.1節篩選效果較好的乳酸菌菌株。

生理生化鑒定：對篩選的乳酸菌菌株參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》和《常見細菌系統鑒定手冊》中乳酸菌的鑒定方法進行生理生化鑒定[15-16]。

分子生物學鑒定：選取篩選出的乳酸菌菌株對數期培養物用DNA快速抽提試劑盒提取菌株DNA。采用通用引物，正向引物為27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），反向引物為1492r（5’-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3’）。PCR擴增反應體系（25 μL）：上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，Taq PCR Master mix 12.5 μL，超純水9.5 μL。PCR擴增反應程序：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，循環30 次，4 ℃保溫。PCR產物大小經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證后送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測得序列登錄GenBank進行BLAST同源性比較，應用MEGA5.0軟件構建系統發育進化樹。

1.2.3 乳酸菌生長與拮抗活性曲線

取0.3 mL乳酸菌菌懸液接種于15 mL MRS液體培養基，置于37 ℃恒溫培養箱中靜置培養，每隔4 h取菌株CFS按照1.2.1節測定抑菌活性。同時，在580 nm波長處測定菌株細胞生長量和pH值。

1.2.4 乳酸菌拮抗性能研究

酶敏感性實驗：在菌株CFS中分別加入胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和α-淀粉酶，使最終質量濃度達到1.0 mg/mL，37 ℃水浴中孵育2 h，參照1.2.1節測定抑菌活性。未經酶處理的菌株CFS為對照組。并計算抑菌活性喪失率。

熱穩定性實驗：將菌株CFS分別在40、60、80、100 ℃和121 ℃條件下處理2 h后，按照1.2.1節測定抑菌活性。

pH值實驗：應用1.0 mol/L的HCl和1.0 mol/L的NaOH將菌株CFS的pH值分別調節為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0，參照1.2.1節測定抑菌活性。

1.2.5 乳酸菌拮抗物質的初步提取

根據分子質量大小及耐熱性可將乳酸菌產生的細菌素分為4 類[17]，本實驗細菌素的初步分離純化分2 步進行，先采用硫酸銨沉淀法確定分子質量的大致范圍，后用有機溶劑來進行萃取初步純化細菌素[18]。

硫酸銨沉淀法：采用二次鹽析法，加硫酸銨粉末到CFS中使其飽和度達到30%，4 ℃放置12 h后4 ℃、8 000 r/min離心30 min，取上清液繼續加入硫酸銨至飽和度為80%，放置12 h后離心取沉淀，用無菌水溶解后測抑菌活性[18]。

有機溶劑萃?。喝绻蛩徜@沉淀效果不佳，則可以認為該細菌素為小分子蛋白，采用有機溶劑萃取法來獲取細菌素。選取乙酸乙酯、石油醚、乙醚作為萃取劑，參考文獻[18]進行實驗。取乳酸菌CFS 100 mL于干凈的分液漏斗中，有機溶劑100 mL分5 次每次加入20 mL進行萃取，加入溶劑后沿同一方向輕輕振蕩，使兩者充分混勻后靜置，待分層明顯取有機相于另一個三角瓶中，將5 次萃取液合并，于45 ℃、100 r/min真空旋轉蒸發直至溶液中無有機溶劑氣味，將殘留液轉存于滅菌的離心管中，4 ℃保存備用。

1.2.6 乳酸菌最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的測定

MIC測定參考文獻[19]兩倍微量稀釋肉湯法并稍作修改進行測定。用旋轉蒸發器將乙酸乙酯萃取后的粗提物蒸發至無有機溶劑氣味，真空冷凍干燥制成粉末，置于－18 ℃冰箱保存備用。用LB液體培養基將粗提物粉末稀釋至終濃度為24.0、12.0、6.0、3.0、1.5、0.75、0.25、0.375 mg/mL。取5.0 mL為實驗組，以不加粗提物的LB培養基為對照組，分別加入200 μL、106CFU/mL指示菌菌懸液，37 ℃恒溫靜置培養24 h，肉眼觀察，無混濁現象的最低濃度為粗提物的最小抑菌濃度，每組重復3 次。

1.3 實驗數據處理

采用Microsoft Excel 2010和Origin 8.0進行實驗數據分析處理，數據平行3 次，結果表示為±s。

2 結果與分析

2.1 拮抗性乳酸菌的篩選

采用雙層瓊脂擴散法從2 種乳酸菌菌源中篩選出1 株對E. sakazakii抑菌效果較好的菌株見表1（其中乳酸菌菌體無抑制作用，未列出），指示菌菌懸液濃度調節至106CFU/mL。從中可以看出26 株乳酸菌均能夠拮抗E. sakazakii，魚源乳酸菌總體效果優于泡菜源乳酸菌，其中分離自鯉魚腸道的菌株LY-4效果最好，抑菌圈直徑為19.89 mm，因此，選取菌株LY-4進行后續實驗。

表1 乳酸菌CFS對阪崎腸桿菌的抑制作用Table 1 Antagonistic effect of CFS from lactic acid bacteria against E. sakazakii

2.2 拮抗性乳酸菌的鑒定

菌株LY-4的生理生化鑒定結果見表2，依照文獻[16]可初步判定菌株LY-4為乳桿菌屬的Lb. plantarum。

表2 菌株LY-4的生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical identifi cation of strain LY-4

圖1 菌株LY-4的16S rRNA基因擴增電泳圖Fig. 1 PCR amplifi cation of the 16S rRNA gene of strain LY-4

圖1 是菌株LY-4的16S rRNA基因擴增電泳圖，可以看到在1 500 bp處出現特異性亮帶，表明目標片段被成功擴增。擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，獲得菌株LY-4的16S rDNA核苷酸序列。將菌株測序結果與美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數據庫中進行BLAST比對，選取相似性較高的幾株菌的16S rDNA序列，用MEGA5.05構建系統發育樹，結果見圖2。菌株LY-4與Lb. plantarum FJ378889.1在同一個分支上，置信度為99%，因此菌株LY-4被鑒定為植物乳桿菌（Lb. plantarum），此結果與生理生化鑒定結果一致。

圖2 菌株LY-4的16S rDNA系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain LY-4 based on 16S rDNA sequence

2.3 乳酸菌生長與拮抗活性曲線

圖3 乳酸菌LY-4生長和拮抗活性曲線Fig. 3 Growth and antagonistic activity curves of strain LY-4

菌株LY-4對E. sakazakii ATCC29004的抑菌活性、生長和pH值變化曲線如圖3所示，菌株LY-4對ATCC29004的抑菌活性與細胞生長量之間呈現同步增長趨勢，在穩定期表現為平穩狀態。隨著抑菌活性和細胞生長量的增加，pH值呈現迅速下降在16 h后趨于平穩狀態。LY-4對ATCC29004的最大抑菌活性為28 h的CFS，說明在穩定后期菌株產生抑菌活性物質，因此28 h時菌株發酵液的CFS是作為研究抑菌作用的最佳選擇。

2.4 乳酸菌拮抗性能結果

2.4.1 酶處理的影響

菌株LY-4的CFS經木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和α-淀粉酶37 ℃處理2 h后對ATCC29004的抑菌結果見表3，與對照組相比，經蛋白酶處理后對E. sakazakii的抑菌活性均降低，對胃蛋白酶的敏感性最高，抑菌活性完全喪失，其次是木瓜蛋白酶，活性喪失率為45.62%，變化最小的為中性蛋白酶。經α-淀粉酶處理后，菌株LY-4的活性基本不變。從酶處理的結果來看，可知LY-4的抑菌活性物質具有蛋白性質，可初步判定LY-4所產生的抑菌物質為非糖基化類蛋白[20]。Jang等[21]研究分離自泡菜的Pediococcus pentosaceus T1對Listeria monocytogenes有很好的抑制作用，對抑菌物質進一步分離純化后發現為含有LysM結構域的蛋白，其分子質量為23 kD。Miao Jianyin等[22]用基質輔助激光解吸飛行時間串聯質譜（matrix-associated laser desorption-ionization time of fl ight mass spectrmtry，MALDI-TOF/MS）方法研究出分離自西藏藏靈菇中的Lb. paracase所產生的細菌素F1分子質量為2.1 kD，且有封閉的N末端，對真菌和細菌有抑制作用。

表3 酶處理對菌株LY-4拮抗阪崎腸桿菌活性的影響Table 3 Effect of enzymatic treatment on antagonistic activity of strain LY-4 against E. sakazakii

2.4.2 熱處理的影響

圖4 熱處理對菌株CFS拮抗阪崎腸桿菌活性的影響Fig. 4 Effect of th ermal treatment on antagonistic activity of CFS against E. sakazakii

不同溫度熱處理后，菌株LY-4的CFS抑菌活性變化結果如圖4所示。菌株LY-4的代謝產物經40、60 ℃和80 ℃處理2 h后，抑菌活性基本不變，經100 ℃和121 ℃處理2 h后E. sakazakii的抑菌活性仍保留原活性的79.57%和75.71%，表明其代謝產物具有較好的穩定性。這和Miao Jianyin[22]、Lü Xin[23]及Todorov[24]等的研究結果一致。

2.4.3 pH值處理的影響

不同pH值條件下菌株LY-4的CFS對阪崎腸桿菌的抑菌活性變化情況如圖5所示。乳酸菌CFS的抑菌活性隨著pH值的升高呈現逐漸降低趨勢，其中，當pH 3.0時，抑菌效果最好；當pH值大于3.94（菌株CFS的pH值）時，抑菌活性基本不變；當pH值為4.5時，抑菌活性變為原來的87.28%；當pH值大于5.0時，抑菌活性消失（數據未列出），表明菌株CFS中除含有乳酸等酸性代謝物質，還具有其他抑菌活性成分，且該抑菌成分在酸性條件下活性較好。Lü Xin等[23]研究分離自中國傳統發酵蔬菜中的Lb. coryniformis MXJ32可產生Lactocin MXJ32A，能夠抑制多種食源性致病菌，且具有很好的pH值耐受性和熱穩定性。Casaburi等[25]對分離自意大利傳統發酵香腸中的Lactobacillus curvatus 54M16所產乳酸菌素經反相高效液相色譜（reversed phase highperformance liquid chromatography，RP-HPLC）純化，通過MALDI-TOF/MS后得出分子質量為2.5 kD，該乳酸菌素具有很好的pH值耐受性。

圖5 pH值處理對菌株CFS拮抗阪崎腸桿菌活性的影響Fig. 5 Effect of pH on antagonistic activity of CFS against E. sakazakii

2.5 乳酸菌拮抗物質的初步純化菌株LY-4的CFS經二次鹽析后收集的沉淀基本無抑菌效果，而CFS（pH值為3.94）的抑菌效果顯著，結果如圖6所示，硫酸銨沉淀無法初步純化細菌素，認為該株菌所產抑菌物質為小分子質量的蛋白，采用有機溶劑萃取法初步純化細菌素。

圖6 菌株LY-4的CFS硫酸銨沉淀抑菌效果Fig. 6 Antibacterial effect of CFS after ammonium sulfate precipitation

2.5.1 最佳萃取劑選擇

選用乙酸乙酯、乙醚、石油醚3 種有機溶劑萃取，細菌素在有機溶劑中的溶解度大于在水相中的溶解度，因此抑菌活性物質大部分被萃取到有機相中，將有機相經旋轉蒸發至無有機溶劑氣味后進行抑菌實驗，結果如表4和圖7所示。相比對照組的抑菌效果（抑菌圈直徑（18.35±0.41） mm），乙酸乙酯的萃取效果最好，萃取后抑菌圈直徑明顯大于乙醚、石油醚和未經萃取的CFS，乙醚效果次之，石油醚效果最差。乙酸乙酯初步純化細菌素效果較為明顯，粗提蛋白后的上層溶液抑菌效果微弱，可見初步粗提較為完全。因此選擇乙酸乙酯為最佳萃取劑進行后續實驗。

表4 菌株LY-4抑菌物質的有機溶劑粗提取抑菌效果Table 4 Antimicrobial substances extracted from strain LY-4 mm

圖7 有機溶劑萃取后抑菌效果Fig. 7 Antibacterial effect of fractions obtained from successive organic solvent extraction of CFS

2.5.2 最小抑菌濃度MIC的測定結果

用無菌LB液體將粗提物粉末制成終質量濃度分別為24.0、12.0、6.0、3.0、1.5、0.75、0.25、0.375 mg/mL的溶液。取5.0 mL加入100 μL的106CFU/mL指示菌菌懸液，37 ℃靜置、恒溫培養24 h，肉眼觀察6.0 mg/mL及其以上質量濃度的試管無混濁現象，確定6.0 mg/mL為粗提物對E. sakazakii的MIC。Lu Xin等[17]研究分離自駱駝乳中的Lb. casei TN-2所產生的類細菌素物質對Escherichia coli ATCC25922和Staphylococcus aureus ATCC25923的MIC分別為2.5 mg/mL和5.0 mg/mL。

3 結 論

本實驗分離的乳酸菌是一類對其他微生物有拮抗作用的細菌類群。本實驗從淡水魚腸道和泡菜中篩選出1 株拮抗E. sakazakii效果較好的乳酸菌菌株LY-4，其抑菌活性物質主要來自于菌株的CFS中，恒溫靜置培養28 h后的CFS抑菌活性最高。低酸環境能夠協同抑菌活性，pH值在4.5以下均能抑制E. sakazakii生長。經121 ℃處理2 h后抑菌活性仍保留75.71%，說明該抑菌物質有較好的熱穩定性。菌株CFS經不同蛋白酶處理后抑菌活性均有下降，對α-淀粉酶不敏感，可初步判定抑菌活性物質為非糖基化的細菌素類。對抑菌物質采用硫酸銨沉淀和有機溶劑萃取進行初步純化，選出乙酸乙酯為該抑菌物質的最佳萃取劑，經旋轉蒸發、真空冷凍干燥后進行抑菌實驗得出該粗提物的最小抑菌濃度為6.0 mg/mL。經生理生化和16S rDNA鑒定為植物乳桿菌（Lb. plantarum）。

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Screening and Identifi cation of Lactic Acid Bacteria Antagonistic against Enterobacter sakazakii

DU Jingfang, MIAO Luhuan, MA Huanhuan, Lü Xinran, LI Ying, BAI Fengling*, LI Chun, LI Jianrong
(National & Local Joint Engineering Research Center of Storage, Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products, Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province, College of Food Science and Technology, Bohai University, Jinzhou 121013, China)

Enterobacter sakazakii is an opportunistic pathogen that can cause neonatal septicemia and cephalomeningitis and necrotizing enterocolitis with mortality rate of 80%. Lactic acid bacteria with inhibitory activity against E. sakazakii were isolated from the intestine of freshwater fi sh and pickles by double-layer agar diffusion method. The lactic acid bacterial strain isolated from the intestine of common carp, named as LY-4, showed the highest inhibitory activity, which was mainly derived from its cell-free culture supernatant (CFS). The CFS showed the strongest antagonistic activity when the strain was cultured for 28 h. The antagonistic activity was lost entirely after treatment with pepsin, and degraded sharply to 76.44% and 54.38% by treatment with neutral protease and papain, respectively, but it was not sensitive to α-amylase, and was stable at pH 3.0–4.5. The antagonistic activity remained basically unchanged after thermal treatment at temperatures between 40 and 80 ℃ for 2 h, but declined to 79.57% and 75.71% of its original value after incubation at 100 ℃ and 121 ℃ for 2 h, respectively. The inhibitory substance was determined as a non-glycosylated bacteriocin, which was found to be the most extractable with ethyl acetate. The minimum inhibitory concentration (MIC) of this bacteriocin was 6.0 mg/mL. The strain LY-4 was identifi ed as Lactobacillus plantarum by physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence.

lactic acid bacteria; Enterobacter sakazakii; common carp intestine; screening and identifi cation; antagonism

10.7506/spkx1002-6630-201611022

TS201.3

A

1002-6630（2016）11-0125-06

杜靜芳, 繆璐歡, 馬歡歡, 等. 拮抗阪崎腸桿菌乳酸菌的篩選鑒定及抑菌特性[J]. 食品科學, 2016, 37(11): 125-130.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611022. http://www.spkx.net.cn DU Jingfang, MIAO Luhuan, MA Huanhuan, et al. Screening and identifi cation of lactic acid bacteria antagonistic against Enterobacter sakazakii[J]. Food Science, 2016, 37(11): 125-130. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611022. http://www.spkx.net.cn

2015-07-18

遼寧省科技廳攻關項目“海水魚加工副產物的高值化利用關鍵技術及產業化”（2015103020）；遼寧省高等學校創新團隊課題（LT2014024）

杜靜芳（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：dujingfang2013@163.com

*通信作者：白鳳翎（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品安全與質量控制和食品微生物學。E-mail：baifl ing@163.com