兩株土壤放線菌ZSM-1和ZSM-2的分離與鑒定

孔望君，蔣會芳，冉火苗，王 傲，呂 曼，楊 柯，辛志宏*（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

兩株土壤放線菌ZSM-1和ZSM-2的分離與鑒定

孔望君，蔣會芳，冉火苗，王 傲，呂 曼，楊 柯，辛志宏*
（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

對分離自土壤的2 株編號為ZSM-1和ZS M-2的放線菌進行分類鑒定，提取基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）后經聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增菌株16S rDNA，基因測序并進行同源性分析，構建進化樹并進行系統發育分析，結合培養特征、生理生化特征，將該2 株菌分別鑒定為納士維爾鏈霉菌（Streptomyces nashvillensis）與土地戈登氏菌（Gordonia terrae）。

放線菌；鑒定；16S rDNA；系統發育分析

放線菌（Actinomycete）是一類具有分支狀菌絲體、高（G+C）mol%含量的革蘭氏陽性細菌[1]，廣泛存在于不同的自然生態環境中，種類繁多、代謝功能各異。放線菌是擁有巨大應用價值的一類微生物類群，能產生多種有益代謝產物且具有很高的經濟價值，目前從微生物中發現的大約8 000 種生物活性物質中，大約70 %是由放線菌產生的[2]。目前臨床上使用的抗生素有2/3來自放線菌[3]。因此作為一類重要的微生物資源，放線菌的研究受到了世界各國學者的極大重視。常顯波[4]比較了不同方法的分離效果，并通過純培養和16S rDNA系統發育分析對黃海冷水團、北極海區及青島鹽池的沉積物樣品進行了放線菌多樣性研究。胥秀英等[5]對土壤放線菌的一種新分離技術進行了研究。結果表明，用加有氟哌酸、青霉素、制霉菌素的培養基，可以選擇性地從土壤中分離放線菌，0.05%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）在40 ℃條件下處理土壤樣品，可以促進放線菌的孢子萌發而獲得更多的放線菌株，進一步提高放線菌的分離效果。焦少娟等[6]從陜西楊凌地區不同類型土壤中分離出1 株對稻瘟病菌（Pyricularia grisea）、小麥赤霉病菌（Gibberella zeae）和小麥白粉病菌（Blumeria graminis）等病原菌均具有強烈拮抗作用的JSJ-129-08號菌株，并對其生物學活性進行了初步測定。孫強等[7]對放線菌菌株MY02中的抗真菌成分進行了分離。Rajamanickam等[8]從印度東南海岸的紅樹林根際土壤中分離出1 株能產生L-天冬酰胺酶（L-asparaginase）的放線菌KUA106，并研究了該菌發酵條件與酶產量之間的關系，結果表明KUA106產生L-天冬酰胺酶的最佳培養基組合是天冬酰胺、胰蛋白胨、葡萄糖和氯化鈉。Fguira等[9]對抗真菌鏈霉菌us80菌株中的活性成分進行了提純和結構認定。葉海霞等[10]以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為供試菌株篩選出對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有較好抑制作用的放線菌菌株Y-71。王勇等[11]對放線菌菌株BOS-009進行分離及鑒定，并對其拮抗活性進行研究。吳春燕等[12]從三亞附近海域采集的海綿體內分離出一株具有較強抗血球凝集素1型、神經氨酸酶1型（hemagglutinin 1 neuraminidase 1，H1N1）活性的放線菌HA10201，其發酵液稀釋20 倍后抑制率仍達68.1%（陽性對照利巴韋林抑制率為80.0%）。因此，放線菌依然是一類急待開發的微生物資源，在生物環保、食品、制藥、發酵工業、農業生產等領域具有潛在的應用價值。

本實驗對采自中山陵的土壤進行了放線菌的篩選，共得到16 株土壤放線菌，其中菌株ZSM-1、ZSM-2表型特征比較特殊，前者在高氏一號培養基上呈灰白色，菌絲體由內向外呈放射狀生長，后者呈橘紅色，表面光滑中央凸起。因此對這2 株菌形態特征、培養特征以及16S rDNA序列進行研究，對其進行分類鑒定，確定其種屬地位，為放線菌的深入開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

土壤采自江蘇省南京市中山陵。

D3350-01 E.Z.N.A細菌DNA提取試劑盒 美國Omega公司；DR001AM PCR試劑、Ver.3.0 D823A瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒、D102A pMD19-T載體 日本TaKaRa公司。

培養特征、生理生化特性實驗所用培養基均采用放線菌培養、分類鑒定常規培養基[13-14]。

1.2 儀器與設備

Microfuge 22R臺式微量冷凍離心機 美國Beckman公司；TP600型梯度PCR儀 日本TaKaRa公司；DYCP-31DN電泳儀 北京市六一儀器廠；JS-380C全自動數碼凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；SPX-25085H-II生化培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 放線菌的分離純化

取10 g土壤溶于90 mL無菌水中，180 r/min振蕩20 min，即得到10－1的土壤懸浮液。靜置后，取1 mL上懸液依次梯度稀釋，制備10－2、10－3、10－4、10－5、10－6的土壤懸浮液，充分振蕩，靜置30 min備用。取上述土壤懸浮液（10－4、10－5、10－6）100 μL注入高氏合成一號平板上（含質量分數0.05%的重鉻酸鉀），用無菌涂布器涂布均勻，每個土壤稀釋濃度做3 個平行，置于28 ℃恒溫培養箱內培養5～7 d后，觀察菌落的生長情況，然后進行純化、保存、備用。

1.3.2 菌株的初步鑒定

1.3.2.1 培養特征

參照《放線菌的分類和鑒定》和《鏈霉菌鑒定手冊》中的方法。將菌株接種于高氏一號等8 種放線菌分類鑒定常規培養基上，28 ℃培養7～10 d，觀察氣生菌絲、基內菌絲、可溶性色素的顏色及表觀特征。

1.3.2.2 生理生化特征

參照《放線菌的分類和鑒定》和《鏈霉菌鑒定手冊》中的方法測定菌株的生理生化特性。測定指標包括：碳源利用、硝酸鹽還原、纖維素水解、淀粉水解、明膠液化、產硫化氫及牛奶凝固與胨化。

1.3.2.3 16S rDNA 序列提取與PCR擴增

采用細菌DNA提取試劑盒提取放線菌基因組DNA，對其16S rDNA序列進行PCR擴增。PCR擴增反應體系包括：2×Taq Master Mix 12.5 μL、DNA 1 μL、Primer 1 1 μL、Primer 2 1 μL、ddH2O 9.5 μL。引物為16S（F）（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和16S（R）（5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）；PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸100 s ，共35 個循環，最后72 ℃延伸7 min。

1.3.2.4 16S rDNA 序列克隆與分析

采用DNA回收試劑盒回收PCR產物，純化后的PCR產物與pMD19-T載體連接，然后轉化至E.coli DH5α感受態細胞中。將－70 ℃條件下保存的感受態細胞E.coli DH5α 100 μL中加入10 μL連接產物，輕輕混合均勻，冰中放置30 min，取出后42 ℃熱激90 s，再在冰中放置5～10 min，加入890 μL LB液體培養基37 ℃振蕩培養1 h。取200 μL菌液涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，倒置過夜培養，挑取白色單菌落培養。取0.5 μL菌液進行PCR擴增，引物為M13-RV和M13-47，電泳檢測是否含有目的片段。PCR反應體系（共25 μL），包括2×Taq Master Mix 12.5 μL、模板DNA 1 μL、 M13-RV 1 μL、M13-47 1 μL、ddH2O 9.5 μL。將含有目的DNA序列的菌液送交上海美吉生物有限公司進行序列測定。

1.3.2.5 16S rDNA序列系統發育樹分析

獲得序列后，在EzBioCloud數據庫中進行比對，下載與供試菌株16S rDNA序列同源性相近的菌株序列，利用ClustalX軟件進行序列的多重比對，利用MEGA5.0軟件鄰接（Neighbor-Joining，N-J）方法構建系統發育樹，自展數為1 000。

2 結果與分析

2.1 菌株形態學觀察

菌株ZSM-1在高氏一號培養基28 ℃培養7 d后，菌落正面灰白色，菌絲呈放射狀，反面褐黃色（圖1A、B）。電子顯微鏡掃描結果顯示，菌株ZSM-1的孢子絲細長，有分支，光滑透明（圖1C）。

圖1 菌株ZSM-1的菌落特征及顯微結構Fig. 1 Morphological characteristics of strain ZSM-1

菌株ZSM-2在高氏一號培養基28 ℃培養7 d后，菌落正面呈蘋果紅色，光滑，中央凸起，反面蘋果紅色（圖2A、B）。電鏡掃描結果顯示，菌株ZSM-2不產生芽孢，不形成細長的菌絲，呈大片的蜂窩狀（圖2C）。

圖2 菌株ZSM-2的菌落特征及顯微結構Fig. 2 Morphological characteristics of strain ZSM-2

2.2 培養特征觀察

在放線菌分類鑒定的8 種常規培養基上，放線菌菌株ZSM-1、ZSM-2經28 ℃培養7～10 d后，培養特征見表1。將菌株ZSM-1與模式菌株Streptomyces nashvillensis[15]，菌株ZSM-2與模式菌株Gordonia terrae[16-17]進行對比，菌絲及胞外色素顏色以《鏈霉菌鑒定手冊》[13]為參照。

表1 菌株ZSM-1、ZSM-2與對照菌株S.nashvillensis G. terrae的培養特征Table 1 Growth characteristics of strains ZSM-1 and ZSM-2 and the control strains S. nashvillensis and G. terrae

2.3 菌株生理生化特性

2.3.1 碳源的利用

測定了菌株ZSM-1、ZSM-2對多種供試碳源的利用情況，結果見表2。通過菌株ZSM-1與S. nashvillensis[16]、ZSM-2與G. terrae碳源的利用情況比較發現，它們的碳源利用情況相一致。

表2 放線菌ZSM-1、ZSM-2與對照菌株S. nashvillensis G. terrae碳源利用Table 2 Carbon utilization capacity of actinomycetes ZSM-1 and ZSM-2 and the control strains S. nashvillensis and G. terrae

2.3.2 酶學特征

菌株的酶學特征測定結果如表3所示。比較菌株ZSM-1與S. nashvillensis、Z SM-2與G. terrae的生理生化指標發現，它們的生理生化指標基本相符。

表3 放線菌ZSM-1、ZSM-2與對照菌株S. nashvillensis、G. terrae生理生化指標Table 3 Physiological and biochemical properties of actinomycetes ZSM-1 and ZSM-2 and the control strainsS. nashvillensis

2.4 系統發育學分析

系統發育樹是基于共同祖先原則，用于描述生物傳代譜系的常用表達方式，可以直觀地表達分類群（物種或基因）之間的親緣關系和進化方向[18]。

序列測定結果表明，菌株ZSM-1和ZSM-2的16S rDNA序列全長分別為1 448 、1 445 bp（圖3），在EzBioCloud數據庫中經序列相似性搜索，發現菌株ZSM-1與鏈霉菌屬的菌株高度相關，ZSM-2與戈登式菌屬的菌株高度相關，說明菌株ZSM-1是鏈霉菌屬的成員，ZSM-2是戈登式菌屬的成員。與菌株ZSM-1相似性最高的鏈霉菌屬的有效種為Streptomyces nashvillensis，相似性為99.45%，與菌株ZSM-2相似性最高的戈登式菌屬的有效種為Gordonia terrae，相似性為100%。基于16S rDNA基因序列的系統發育分析顯示菌株ZSM-1與鏈霉菌菌株Streptomyces nashvillensis聚為一支，自展值為100%，菌株ZSM-2與Gordonia terrae聚為一支，自展值為100%，表現出非常近的親緣關系（圖4、5），因此初步將菌株ZSM-1和ZSM-2分別鑒定為S. nashvillensis和G. terrae。

圖3 ZSM-1和ZSM-2 16S rDNA的PCR擴增圖譜Fig. 3 PCR-amplifi ed fragments of the 16S rDNA from ZSM-1 and ZSM-2

圖4 ZSM-1基于16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig. 4 Phylogenetic tree constructed for ZSM-1 by Neighbor-Joining based on 16S rDNA gene sequences

圖5 ZSM-2基于16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig. 5 Phylogenetic tree constructed for ZSM-2 by Neighbor-Joining based on 16S rDNA gene sequences

綜合培養特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析結果，將菌株ZSM-1鑒定為放線菌綱Actinobacteria、鏈霉菌目Streptomycetales、鏈霉菌科Streptomycetaceae、鏈霉菌屬Streptomyces、納士維爾鏈霉菌Streptomyces nashvillensis。菌株ZSM-2鑒定為放線菌綱Actinobacteria、棒桿菌目Corynebacteriales、諾卡氏菌科Nocardiaceae、戈登式菌屬Gordonia、土地戈登氏菌Gordonia terrae。

3 討 論

傳統的放線菌分類鑒定主要通過觀察菌種的形態特征、培養特征和生理生化特征等表型來確定其種屬地位，鑒定的主要內容有：培養后觀察菌落特征，顯微鏡下觀察氣生菌絲、基內菌絲、孢子絲的形狀和生長狀況，通過淀粉水解、碳源利用實驗、明膠液化等酶活力測定實驗[19]。然而放線菌種類繁多，形態特征復雜，且少數形態特征和生理生化指標有可能隨著環境的變化而發生改變，給分類鑒定工作帶來不便。隨著現代分子生物學的發展，DNA序列分析已被廣泛應用到放線菌的鑒定中，尤其是通過分析放線菌16S rDNA序列來確定菌種在放線菌中的分類地位，已經成分鑒定放線菌的有效方法。

16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA（16S rRNA）的基因，是放線菌系統分類研究中最有用和最常用的分子鐘，16S rDNA種類少，含量大（約占細菌RNA含量的80%），分子大小適中，存在于所有的生物中，進化具有良好的時鐘性質，在結構與功能上具有高度的保守性[20]，素有“細菌化石”之稱。由于其大小適中，約1.5 kb左右，既能體現不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術較容易地得到其序列，因此是種屬鑒定的分子基礎。

本實驗采用培養特征、生理生化特征觀察與分子生物學相結合的方法，對分離自土壤的2 株放線菌進行鑒定。提取菌株基因組DNA后，擴增16S rDNA基因片段并測序，測序結果在EzBioCloud數據庫進行有效種的序列相似性搜索，下載與供試菌株16S rDNA序列同源性相近的菌株序列，構建16S rDNA基因序列進化樹。根據進化樹結果，結合培養特征、生理生化特征，將菌株ZSM-1鑒定為納士維爾鏈霉菌Streptomyces nashvillensis，ZSM-2鑒定為土地戈登氏菌Gordonia terrae。

目前關于納士維爾鏈霉菌和土地戈登氏菌的研究報道較少。納士維爾鏈霉菌具有抑制陽性細菌和耐多種抗菌素的生物活性，宮彩霞[21]將能夠產生強抗腫瘤活性抗生素美達霉素（medermycin）的菌株AM-7161鑒定為納士維爾鏈霉菌。Ikeda等[22]利用同位素標記法研究了納士維爾鏈霉菌所產抗生素Bellenamine的生物合成途徑。Tsuchida等[23]發現納士維爾鏈霉菌能夠產生抑制巴斯德菌（Pasteurella piscicida）的抗生素Tetrodecamycin和Dihydrotetrodecamycin，表明該菌具有產生抗生素的能力。研究報道發現Gordonia terrae可以降解污染土壤中的致癌性芳香族化合物奈。曹林等[24]從活性污泥中分離出1 株Gordonia terrae，該菌株具有良好的異養硝化和好氧反硝化能力，能夠去除活性污泥中的氨和氮，并且在硝化過程中沒有亞硝酸鹽氮或硝酸鹽氮的累積。Hernandez-Perez等[25]發現Gordonia terrae能夠生物降解汽油中的高辛烷值調和組分。Wang Wei等[26]發現土地戈登氏菌具有脫硫作用的遺傳因子，可以將化石燃料燃燒產生的含硫化合物苯并噻吩（benzothiophene，BT）降解，避免造成環境污染。

放線菌的生長與代謝產物常常易受發酵條件和培養基成分的影響，不同的發酵條件與培養基往往產生不同的代謝產物。今后，將對菌株ZSM-1和ZSM-2的發酵條件進行優化，對其發酵產物進行分離純化得到單體化合物，結合現代波譜學手段鑒定化合物的結構，以期發現具有生物活性的新型化合物。

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Isolation and Identifi cation of Two Soil Actinomycetes ZSM-1 and ZSM-2

KONG Wangjun, JIANG Huifang, RAN Huomiao, WANG Ao, Lü Man, YANG Ke, XIN Zhihong*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Actinomycete strains ZSM-1 and ZSM-2 isolated from soil were studied for their taxonomy. The 16S rDNA was amplifi ed by polymerase chain reaction (PCR) after the extraction of mycelial genomic DNA and the amplifi cation products were subjected to sequencing and homology analysis. A phylogenetic tree was established based on the sequences of 16S rDNA, and cultural characteristics, physiological and biochemical properties were evaluated as well. As a result, both strains were identifi ed as Streptomyces nashvillensis and Gordonia terrae, respectively.

Actinomycete; identifi cation; 16S rDNA gene; phylogenetic analysis

10.7506/spkx1002-6630-201611020

TS255.1

A

1002-6630（2016）11-0114-06

孔望君, 蔣會芳, 冉火苗, 等. 兩株土壤放線菌ZSM-1和ZSM-2的分離與鑒定[J]. 食品科學, 2016, 37(11): 114-119. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611020. http://www.spkx.net.cn

KONG Wangjun, JIANG Huifang, RAN Huomiao, et al. Isolation and identification of two soil actinomycetes ZSM-1 and ZSM-2[J]. Food Science, 2016, 37(11): 114-119. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611020. http://www.spkx.net.cn

2015-08-10

2015年農產品質量安全風險評估項目（GJFP2015012）

孔望君（1991—），男， 碩士研究生，研究方向為食品營養與安全。E-mail：2013108064@njau.edu.cn

*通信作者：辛志宏（1974—），男，教授，博士，研究方向為食品營養與安全。E-mail：xzhfood@njau.edu.cn