紅樹莓原液對D-半乳糖模型小鼠抗衰老作用

李書丹，宋　娜，李曉東，于曉紅

(1.齊齊哈爾中醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.哈爾濱市兒童醫院，哈爾濱 150010;3.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040)

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紅樹莓原液對D-半乳糖模型小鼠抗衰老作用

李書丹1，宋娜2，李曉東1，于曉紅3*

(1.齊齊哈爾中醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.哈爾濱市兒童醫院，哈爾濱 150010;3.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040)

目的從抗氧化及免疫調節機制探討紅樹莓原液對D-半乳糖模型小鼠抗衰老作用。方法觀察測定紅樹莓原液對D-半乳糖模型小鼠的治療作用；應用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清IL-2、IL-10水平，取小鼠肝臟測其丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)。結果紅樹莓原液可上調D-半乳糖模型小鼠IL-2的表達，下調IL-10的表達水平，可以提高GSH-Px水平，降低MDA水平。結論紅樹莓原液可以通過調節D-半乳糖模型小鼠的免疫狀態，從而起到抗衰老的作用。

紅樹莓原液；IL-2；IL-10；丙二醛；谷胱甘肽過氧化物酶

紅樹莓為半灌木性聚合漿果植物，富含多種維生素和礦質元素，尤其富含SOD，鞣質酸等抗癌、抗疲勞物質，美國人稱之為“生命之果”，是中藥覆盆子家族的一員，俗稱“托盤”“刺莓”等[1]。藥典記載:覆盆子甘、酸、溫；歸肝、腎、膀胱經；有益腎固精縮尿，養肝明目之效。民間紅樹莓也被廣泛食用，其果實柔嫩多汁，酸甜可口，具有止渴、活血及抗腫瘤等功效，已被人們作為良好的防病保健水果。遂選用D-半乳糖模型小鼠作為研究對象，研究探討其抗衰老作用。本實驗從基因角度,通過觀察紅樹莓原液對D-半乳糖模型小鼠的IL-2、IL-10表達的影響及對D-半乳糖模型小鼠MDA、GSH-PX的影響來進一步探討紅樹莓抗氧化的機制及其免疫調節的機制，以期獲得紅樹莓抗氧化、免疫調節作用的全面認識，為紅樹莓的臨床應用提供理論依據和全面可靠的現代醫學研究的基礎資料[2]。

1　材料

1.1動物及分組選用健康昆明系小鼠60只(購于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心，許可證號:黑醫實驗動物單項準第61號。)雌雄各半，體質量(18±2.0)g，采用隨機數字表法將小鼠隨機分為空白組、模型組、維生素E組、紅樹莓原液低劑量組(10 g/kg)、紅樹莓原液中劑量組(20 g/kg)、紅樹莓原液高劑量組(40 g/kg)，共6組，每組10只。

1.2藥物紅樹莓原液： 紅樹莓采摘于黑龍江省尚志市帽兒山，鮮果洗凈、自然干燥、搗碎(不添加蒸餾水)、抽濾去滓，獲得濃度為1.1 g/mL紅樹莓原液。臨用時倍比稀釋成不同濃度的紅樹莓原液。環磷酰胺注射液 ：購于江蘇恒瑞醫藥股份有限公司(批號：H32026196)。甘露聚糖肽： 購于貴州神奇制藥有限公司(批號：H52020862)。

1.3試劑小鼠IL-2、IL-10檢測試劑盒購于美國R&D公司，丙二醛和谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒購于南京建成科技有限公司，D-半乳糖、維生素E、蒸餾水、生理鹽水等均購于哈爾濱博潤生物科技公司。

2　方法

2.1動物模型的制備本實驗采用D-半乳糖亞急性人工衰老模型，即小鼠頸部皮下注射D-半乳糖劑量1 mg/(10 g·d),連續6周。觀察小鼠狀態，小鼠出現毛色灰暗、失去光澤、形態瘦弱、行動緩慢、精神萎靡不振、體質量下降，呈現明顯衰老體征，證明D-半乳糖衰老模型建立成功。2.2給藥方法及劑量空白組：蒸餾水灌胃0.18 mL/(10 g·d)，頸背部皮下注射生理鹽水0.1 mL/(10 g·d)。模型組：蒸餾水灌胃0.18 mL/(10 g·d)，頸背部皮下注射D-半乳糖1 mL/(10 g·d)。維生素E組：維生素E灌胃0.5 mg/(10 g·d)，頸背部皮下注射D-半乳糖1 mL/(10 g·d)。低劑量組：紅樹莓灌胃0.1 g/(10 g·d)，頸背部皮下注射D-半乳糖1 mL/(10 g·d)。中劑量組：紅樹莓灌胃0.2 g/(10 g·d)，頸背部皮下注射D-半乳糖1 mL/(10 g·d)。高劑量組：紅樹莓灌胃0.4 g/(10 g·d)，頸背部皮下注射D-半乳糖1 mL/(10 g·d)。

2.3 標本采集及檢測

2.3.1肝臟稱重小鼠自由進食3 d，適應環境。第3天稱重，按以上劑量給藥。1次/d，連續6周。自給藥第1天起，每7 d稱重調整給藥劑量。末次給藥后，禁食12 h，稱重，摘眼球取血，頸椎脫臼處死，以75%乙醇浸泡消毒后取肝臟。

2.3.2小鼠血清中IL-2和IL-10含量的測定具體步驟按照所購試劑盒說明書操作，分離各組小鼠血清，應用ELISA方法檢測各組血清中IL-2和IL-10。

2.3.3小鼠肝臟中MDA和GSH-Px的測定取經75%乙醇浸泡消毒后的肝臟，加入生理鹽水，用玻璃勻漿器充分研磨使組織漿化，制成10%勻漿。3 000 r/min離心10～15 min，取上清液。然后按照MDA和GSH-Px試劑盒說明書操作。

3　結果

3.1紅樹莓原液對D-半乳糖模型小鼠IL-2和IL-10的影響見表1。

組　別IL?2IL?10空白組5．75±1．67　　3．94±1．19　　模型組3．04±0．88　　6．86±1．58　　維生素E組4．99±1．88##4．64±1．76##低劑量組4．48±2．30#　4．45±1．60##中劑量組4．54±1．66#　4．31±1．13##高劑量組4．21±1．92　　4．45±1．60##

注：與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.2紅樹莓原液對D-半乳糖模型小鼠GSH-Px、MDA的影響見表2。

組　別GSH?PXMDA空白組349．04±61．17　　0．76±0．160　　模型組221．12±54．91　　1．16±0．250　　維生素E組323．49±80．14##0．80±0．160##低劑量組296．14±118．65#　0．92±0．260#　中劑量組322．40±87．16#　0．85±0．240##高劑量組290．89±59．38##0．90±0．280#　

注：與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

4　討論

紅樹莓原液主要是對免疫器官的影響和對體液及細胞免疫調節，從而起到抗衰老作用[3]，提高人體免疫功能延緩人體的衰老過程。T淋巴細胞在免疫調節方面起一定主導作用,根據CD4+T細胞所產生的細胞因子種類及介導功能不同，可將其分為Th1、Th2和Tr細胞，Th1型細胞主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12及TNF-β/α等Th1型細胞因子,主要參與細胞免疫；Th2型細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等Th2型細胞因子,起到輔助體液免疫應答作用；機體免疫功能正常狀態下Th1、Th2型細胞及其分泌的細胞因子在數量上維持一種相對平衡狀態，共同參與協調、促進機體免疫功能的發揮,這種生理平衡狀態的打破,即Th1/Th2漂移，將引發各種疾病。IL-2是重要免疫增強因子，主要由活化的Th1細胞產生[4-7]。具有促進T細胞增殖、誘導LAK細胞、促進B細胞分泌抗體、促進T細胞殺傷作用及增強NKC活性等作用，主要參與機體的免疫調節。IL-10可通過多種途徑參與免疫抑制，IL-10能減少如NO、自由基和前列腺素等炎性調節因子的分泌。實驗研究表明，用D-半乳糖造模之后，這個平衡被打破，出現了Th1/Th2失衡，而紅樹莓不同劑量組給藥后，小鼠的血清中不同程度的升高了IL-2水平，并可下調IL-10水平，從而形成一種自身的正反饋調節，使機體接近正常水平，改善機體的免疫狀態，延緩免疫器官機能的衰退，從而提高機體對外界病原體的抵抗能力來抗衰老[8-12]。

MDA是脂質過氧化的主要產物之一，可間接反映機體受自由基攻擊的嚴重程度，其不僅反映評價衰老的重要指標，更重要的是可以反映組織氧化的程度和細胞損失的程度。GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的抗氧化酶，可以特異性催化還原GSH對過氧化氫的還原反應，直接反應機體氧化程度的生化指標[13-15]。實驗研究發現造模之后，機體抗氧化酶活性降低及抗氧化劑減少，使機體總抗氧化能力下降，從而防御自由基能力降低，GSH-Px、MDA的濃度的變化直接證實D-半乳糖模型小鼠造模成功，增加機體對過氧化氫的還原能力，降低機體MDA濃度，降低組織和細胞的氧化水平，機體抗氧化酶活性提高，清除自由基的能力增強，使抗衰老能力也得到增強，用藥組接近正常小鼠氧化水平[16-18]。

上述實驗說明，紅樹莓原液可以改善機體免疫狀態，提高免疫器官的機能，增強對外界病原體的抵抗能力，起到抗衰老作用。同時紅樹莓原液可以降低機體的氧化水平，提高機體抗氧化能力有效的起到抗衰老作用。本實驗為紅樹莓的分離、提純有效成分，研究開發其醫藥保健作用等后續研究提供了基礎依據。

[1]陳旭.益氣養陰組方對細胞衰老干預作用及其機理的實驗研究[J].長春中醫藥大學學報,2013,29(2):196-197.

[2]譚麗鶴,李紅玉.桑蠶蛹多糖超聲提取優化及水溶性多糖組分分析[J].中成藥,2016,38(6):1254-1259.

[3]錢鈞強,葉因濤,王冬,等.白藜蘆醇治療阿爾茨海默病的研究進展[J].現代藥物與臨床,2016,31(6):924-928.

[4]魯文杰,袁德培,曾楚華.竹節參作用的研究進展[J].生物技術世界,2016,13(5):236.

[5]關玥,孫長波,李慧萍,等.槲寄生的化學成分及藥理作用研究進展[J].上海中醫藥雜志,2016,50(5):102-105.

[6]徐碩,姜文清,鄺詠梅,等.茯苓的化學成分及生物活性研究進展[J].西北藥學雜志,2016,31(3):327-330.

[7]王晶,黃勇,李海龍,等.黨參水提物對D-半乳糖致衰老小鼠腎組織microRNA表達譜的影響[J].中國中醫藥信息雜志,2016,23(5):69-72.

[8]宋格格,李夢云,張克喆,等.D-半乳糖對小鼠免疫功能的影響[J].黑龍江畜牧獸醫,2016,39(8):180-182.

[9]劉秋麗,馮遠.馬齒莧多糖的提取及生理作用研究進展[J].飼料與畜牧,2016,37(5):44-47.

[10]翟燕娟,朱振華,錢大瑋,等.麋鹿角中脂肪酸的分析研究[J].藥物分析雜志,2016,24(5):790-797.

[11]劉娟,楊立,張洪.中醫藥治療阿爾茨海默病的研究進展[J].世界中醫藥,2016,32(5):932-935.

[12]王先麗,陳龍菊.五鶴續斷對衰老小鼠免疫功能的影響[J].中國老年學雜志,2016,42(9):2059-2061.

[13]劉春杰,董立珉,鄭亞萍,等.絲瓜提取物對衰老小鼠學習記憶能力及部分生化指標的影響[J].黑龍江畜牧獸醫,2016,25(10):157-160.

[14]未小明,王愛梅,羅朝輝,等.黃精對AD模型大鼠空間學習記憶及α7nAChR表達的影響[J].神經解剖學雜志,2016,22(3):391-396.

[15]林智君,陳煜森,鄭選梅,等.螺旋藻多糖對阿爾茨海默病模型小鼠腦線粒體氧化應激保護[J].海南醫學,2016,27(11):1731-1733.

[16]王麗波,程龍,徐雅琴,等.南瓜籽多糖水提取工藝優化及其抗氧化活性[J].農業工程學報,2016,32(9):284-290.

[17]肖代敏,張志敏,呂純莉,等.戴氏綠僵菌多糖對衰老小鼠免疫功能的影響[J].中國老年學雜志,2016,22(11):2625-2627.

[18]唐新征,何芝.益氣養陰組方對衰老細胞P16基因表達影響的實驗研究[J].貴陽中醫學院學報,2011,33(4):149-151.

Red raspberry on aging mice induced by D-galactose

LI Shudan1,SONG Na2,LI Xiaodong1,YU Xiaohong3*

(1.Qiqihaer Hospital of Traditional Chinese Medicine,Qiqihaer 161000,Heilongjiang Province,China;2.Children's Hospital of Harbin,Harbin 150010,China;3.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

ObjectiveTo research the antioxidant and immunomodulatory effects of red raspberry on aging mice induced by D-galactose.MethodsTreatment of red raspberry on D-galactose in mice,the serum levels of IL-2 and IL-10 were assayed with ELISA,and the levels of MDA and GSH-PX of livers were examined.ResultsRed raspberry significantly up-regulated the expression of IL-2 and dow-regulated the espression of IL-10.Red Raspberry obviously increased the level GSH-PX and lower the level of MDA.ConclusionRed raspberry is able to adjust the immune status of the D-galactose model mice.So as to play the role of antiaging.

Red raspberries;IL-2;IL-10;MDA;GSH-PX

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.05.008

李書丹(1982-)，女，碩士研究生，主管檢驗師，主要從事免疫方面的研究。

于曉紅，女，教授，碩士研究生導師，電子信箱-hljyxh@sina.com

R285.5

A

2095-6258(2016)05-0902-03

2016-05-24)