基于乙烯基砜化學(xué)的高分子膜表面化學(xué)糖基化及其活性研究*

孫世猷，李明洋，王漢奇，程 昉

(大連理工大學(xué) 精細(xì)化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，制藥科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024)

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基于乙烯基砜化學(xué)的高分子膜表面化學(xué)糖基化及其活性研究*

孫世猷，李明洋，王漢奇，程 昉

(大連理工大學(xué) 精細(xì)化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，制藥科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024)

在高分子膜表面通過化學(xué)方法構(gòu)建糖基化層，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物膜致密“糖被“層的仿生模擬，可以充分拓展及發(fā)揮膜材料和糖的生物學(xué)功能。利用二乙烯基砜與羥基反應(yīng)的特性，以乙烯基砜為偶聯(lián)劑將甘露糖接枝到聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯(PHEMA)聚合物膜表面，制備甘露糖糖基化PHEMA膜。利用傅里葉變換紅外光譜對(duì)糖基化膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，根據(jù)血凝素蛋白特異性識(shí)別糖的性質(zhì)對(duì)糖基化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并在蛋白和細(xì)胞水平對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，制備的甘露糖糖基化PHEMA膜具有良好的抗垢性能，能夠特異性識(shí)別和吸附伴刀豆球蛋白A(ConA)；糖基化膜能夠引起小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)特異性粘附且具有較低的細(xì)胞毒性。提供了一種高分子膜表面糖基化的簡(jiǎn)單方法，為仿生膜表面的構(gòu)建以及細(xì)胞表面糖參與的生物代謝活動(dòng)的研究提供了基礎(chǔ)。

聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯；乙烯基砜化學(xué)；糖基化膜；蛋白吸附；細(xì)胞學(xué)響應(yīng)

0 引 言

細(xì)胞作為機(jī)體生命活動(dòng)的體現(xiàn)者在生物代謝過程中扮演極其重要的作用，而存在于細(xì)胞膜外表面由聚糖構(gòu)成的“糖被”層[1-3]是生物膜功能的主要體現(xiàn)者，在細(xì)胞粘附、細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)以及防止外界生物分子在細(xì)胞膜上的非特異性吸附[4-6]等一系列生物學(xué)過程中起到關(guān)鍵作用。如炎癥和癌癥的發(fā)生與細(xì)胞表面聚糖表達(dá)的變化息息相關(guān)[7]；如糖作為“活化劑”可以激活巨噬細(xì)胞以起到抵御感染和抗腫瘤的效果，而且糖(如甘露糖)與巨噬細(xì)胞的特異性識(shí)別[8-9]也可以產(chǎn)生干擾素在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還可以保護(hù)正常細(xì)胞，以此達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的作用[10]。受此啟發(fā)，以聚合物膜-糖為結(jié)構(gòu)模型來構(gòu)建生物膜表面仿生“糖被”[11]，在賦予聚合物膜類似生物膜特性和功能的同時(shí)以此為模型在體外實(shí)現(xiàn)生物體糖代謝過程的模擬，對(duì)于認(rèn)識(shí)和研究膜表面糖參與的生理過程具有指導(dǎo)意義。

表面糖基化[12]即在材料表面通過自組裝或接枝等修飾方法引入糖基，而高分子材料作為廣泛使用的膜材料[13]在進(jìn)行表面糖基化時(shí)，各種傳統(tǒng)和新型的糖基化方法都能采用。表面糖基化方法主要分為3大類[14]：非共價(jià)固定，共價(jià)固定和酶催化表面糖基化。

非共價(jià)固定是指基底材料表面與糖基通過疏水相互作用、靜電相互作用、范德華力和氫鍵等非共價(jià)作用力結(jié)合來實(shí)現(xiàn)表面糖基化。此類方法的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)材料基底表面不進(jìn)行或只進(jìn)行簡(jiǎn)單處理，操作過程簡(jiǎn)單，如Yang將末端為三苯基的烷基甘露糖以疏水作用連接在孔板表面并以此表面糖基化的孔板得到甘露糖與伴刀豆球蛋白A的特異性作用[15]。共價(jià)固定[14]指的是基底材料表面與糖基以化學(xué)鍵的形式固定來實(shí)現(xiàn)表面糖基化，與前者相比糖基共價(jià)固定途徑廣且得到的糖基化膜穩(wěn)定性有所提高。Knaus等人對(duì)葡萄糖疊氮化修飾后與聚丙烯和聚乙烯薄膜表面連接，明顯改善聚烯烴膜材料表面的親水性能[16]。酶催化表面糖基化[17]，即糖基在生物催化劑或酶的作用下通過化學(xué)鍵與基底表面相連來實(shí)現(xiàn)表面糖基化，該法反應(yīng)條件溫和、糖苷鍵的形成具有較高的選擇性。Egusa將乳糖通過纖維素酶固定在纖維素膜表面，并利用該乳糖基化膜進(jìn)行肝細(xì)胞的培養(yǎng)[18]。以上所提及的方法仍存在一些弊端，如糖合成復(fù)雜且基底與糖基之間的作用力較弱，造成糖基化層穩(wěn)定性差，或活性糖基供體合成提取困難且穩(wěn)定性差，構(gòu)建表面仿生‘糖被’的應(yīng)用難以推廣等。目前仍缺乏一種操作簡(jiǎn)單、糖基化效果好且易于推廣的糖基化新方法。

乙烯基砜化學(xué)[19]是指二乙烯基砜在室溫條件下其水溶液在各個(gè)PH條件下均呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)，且對(duì)巰基、氨基和羥基[20]具有較強(qiáng)的反應(yīng)活性，從而可以作為一種出色的生物偶聯(lián)劑，廣泛用于藥物輸送[21]、生物傳感[22]以及親和層析[23]等領(lǐng)域。

本文所提供了一種基于天然單糖對(duì)高分子聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯(PHEMA)膜進(jìn)行化學(xué)糖基化的新方法，利用甘露糖作為糖基化底物，以二乙烯基砜為連接配體將其直接接枝到PHEMA聚合物膜表面制備甘露糖糖基化PHEMA膜，對(duì)其進(jìn)行了分析和表征，并利用血凝素蛋白特異性識(shí)別糖的性質(zhì)對(duì)糖基化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，分別在蛋白和細(xì)胞水平對(duì)制備的甘露糖糖基化膜進(jìn)行了生物學(xué)評(píng)價(jià)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與材料

聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯(PHEMA)， SIGMA公司產(chǎn)品，Mw=300 000；二乙烯基砜(DVS)，北京中科拓展化學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品，純度≥98%；D-(+)-甘露糖，TCI公司產(chǎn)品，純度≥98.0%；PierceTMHoechst 33342 Fluorescent Stain，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；LIVE/DEAD?Viability/Cytotoxity Kit(Invitrogen L3224，含Calcein AM和EthD-1)，Life Techonologies公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 甘露糖糖基化聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯膜(PHEMA膜)的制備與表征

如圖1所示，將50 mg PHEMA溶于1 mL無水乙醇中均勻涂覆在硅片表面，室溫干燥制備PHEMA薄膜。將PHEMA薄膜浸沒于10%(體積分?jǐn)?shù))DVS(pH值=11，含 10% 丙酮)溶液中室溫活化2 h，蒸餾水沖洗2次。將DVS活化的PHEMA薄膜置于20%(m/v)甘露糖溶液(pH值=10)中室溫反應(yīng)12 h，蒸餾水沖洗2次，室溫干燥制備甘露糖糖基化PHEMA膜。制備的糖基化膜用傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet 6700 Flex，美國Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行表征。

圖1 甘露糖糖基化聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯膜(PHEMA膜)的制備流程

1.2.2 甘露糖糖基化PHEMA膜制備條件優(yōu)化

在96孔板中分別選擇不同pH值條件DVS活化液-甘露糖糖基化溶液對(duì)PHEMA膜糖基化，制備甘露糖糖基化PHEMA膜，制備流程同1.2.1，并并加入巰基-聚乙二醇溶液(1 mmol/L，pH值=7.5)封閉殘留的乙烯基砜基團(tuán)。分別在PHEMA膜和甘露糖糖基化PHEMA膜的孔板內(nèi)加入植物血凝素蛋白-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物，本實(shí)驗(yàn)采用牛血清白蛋白(BSA)和伴刀豆球蛋白A(Concanavalin A，Con A，能夠特異性識(shí)別甘露糖基團(tuán))。37 ℃孵育2 h后采用QuantaBluTMFlurogenic Peroxidase Substrate試劑盒測(cè)定孔板上蛋白吸附情況。

1.2.3 甘露糖糖基化PHEMA膜的細(xì)胞粘附和材料毒性實(shí)驗(yàn)

分別在96孔板中制備PHEMA膜、DVS活化PHEMA膜和甘露糖糖基化PHEMA膜，制備流程同1.2.1，并用巰基-聚乙二醇溶液(1 mmol/L，pH值=7.5)封閉甘露糖基化膜中殘留的乙烯基砜基團(tuán)。分別以每孔20 000的細(xì)胞密度接種巨噬細(xì)胞(RAW 264.7，細(xì)胞膜具有甘露糖受體，能夠特異性識(shí)別甘露糖基團(tuán))。接種細(xì)胞的孔板在37 ℃，5% CO2條件下無血清培養(yǎng)4 h后去除培養(yǎng)液并用緩沖液沖洗，向孔板內(nèi)加入100 μL Hoechst 33342(1 μg/mL)和Invitrogen L3224(2 μmol/L)混合液，37 ℃孵育20 min后棄去染色液并用緩沖液沖洗后用倒置熒光顯微鏡分別在461，515和590 nm波長(zhǎng)下觀測(cè)細(xì)胞粘附情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

圖2 PHEMA膜、DVS活化PHEMA膜和甘露糖糖基化PHEMA膜的紅外譜圖

2.2 甘露糖糖基化PHEMA膜制備條件優(yōu)化

糖作為一類多羥基化合物，其具有的極強(qiáng)的親水性可以用來抑制蛋白質(zhì)等在膜表面的非特異性吸附[26]。除此之外，糖的另一重要生物功能是能夠特異性識(shí)別蛋白質(zhì)，可以根據(jù)糖基類型識(shí)別目標(biāo)蛋白。凝集素就是糖能夠識(shí)別的一類蛋白，且對(duì)糖基有高度專一的結(jié)合性[27]，如甘露糖能夠特異性識(shí)別伴刀豆球蛋白A。

圖3比較了不同pH值條件下活化-糖基化處理得到的甘露糖糖基化PHEMA膜對(duì)蛋白的特異和非特異性吸附情況。由圖可知，與PHEMA膜相比，甘露糖糖基化PHEMA膜對(duì)BSA蛋白的非特異性吸附(圖3(a))和對(duì)ConA的特異性吸附(圖3(b))量均有增多， DVS活化PH-糖基化pH值在11-11條件下非特異性吸附量最低；在11-11、12-10條件下特異性吸附量最高。為了便于比較，將相同條件下得到的特異性吸附與非特異性吸附量做比(圖3(c))，在11-11的pH值條件下糖基化的特異性吸附相對(duì)較高的同時(shí)非特異性吸附相對(duì)較低。該結(jié)果說明制備的甘露糖糖基化PHEMA膜能夠特異性識(shí)別和吸附ConA，且非特異性蛋白吸附量小，即具有一定的抗垢性能，證明經(jīng)過該法制備的糖基化高分子膜在蛋白水平具有糖生物活性。

2.3 甘露糖糖基化PHEMA膜細(xì)胞粘附和材料毒性實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞膜表面存在大量的糖蛋白受體，能夠識(shí)別和調(diào)節(jié)細(xì)胞間相互作用[6]，因此糖基化膜可以用來模擬細(xì)胞膜，研究細(xì)胞識(shí)別以及糖基與細(xì)胞間的作用機(jī)理，如小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7表面有甘露糖的特異性識(shí)別受體[28]，能夠選擇性識(shí)別并結(jié)合甘露糖，可以提高RAW264.7在膜表面的粘附能力。

圖3 不同PH條件活化-糖基化處理得到的甘露糖糖基化PHEMA膜對(duì)蛋白的特異和非特異性吸附情況

由圖4可知，RAW264.7細(xì)胞在PHEMA膜上幾乎沒有粘附(圖4(a)-(c))，該結(jié)果說明富含羥基的PHEMA膜有一定的抗細(xì)胞粘附的特性。細(xì)胞在經(jīng)過DVS活化后的PHEMA膜上有大量粘附(圖4(d))但存在大量的死亡細(xì)胞(圖4(f))，這表明細(xì)胞可以在DVS活化PHEMA膜上粘附，但對(duì)細(xì)胞的毒性較高，可以在短期內(nèi)殺死細(xì)胞，不適于細(xì)胞體外培養(yǎng)。細(xì)胞在甘露糖糖基化PHEMA膜上有大量粘附(圖4(g))，并且活細(xì)胞數(shù)目(圖4(h))明顯高于死細(xì)胞數(shù)目(圖4(i))，表明甘露糖糖基化PHEMA膜可以用于巨噬細(xì)胞的初期粘附，且細(xì)胞毒性低，短期內(nèi)不會(huì)引起細(xì)胞的死亡。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明甘露糖糖基化PHEMA膜能夠引起巨噬細(xì)胞細(xì)胞的特異性粘附，并具有較低的細(xì)胞毒性，在細(xì)胞水平具有糖生物活性。

糖基化膜作為一類仿生材料，在細(xì)胞識(shí)別、體外培養(yǎng)以及人工器官和組織的構(gòu)建[29]等方面具有重要研究意義。但由于糖基合成提取復(fù)雜以及糖基-基底膜間化學(xué)穩(wěn)定差等原因?qū)е绿腔さ难芯侩y以推廣。本文利用二乙烯基砜與羥基反應(yīng)的特點(diǎn)，建立一種簡(jiǎn)單可行的高分子膜表面糖基功能改性的新方法，可以改善高分子膜抗污染能力并可以作為細(xì)胞的體外培養(yǎng)基質(zhì)，豐富高分子膜的生物功能。

圖4 RAW 264.7細(xì)胞在PHEMA膜、DVS活化PHEMA膜和甘露糖糖基化PHEMA膜上的粘附

3 結(jié) 論

建立了一種新穎的高分子膜表面糖基化的新方法，利用無需修飾的甘露糖作為糖基化底物，以二乙烯基砜為偶聯(lián)劑將糖接枝到聚甲基丙烯酸-2-羥乙酯(PHEMA)聚合物膜表面，成功制備得到了甘露糖糖基化PHEMA膜。該法所制備的糖基化高分子膜在蛋白質(zhì)水平對(duì)伴刀豆蛋白A具有良好的的特異性識(shí)別和吸附能力并具有一定的抗垢性能，同時(shí)還能夠引起巨噬細(xì)胞(RAW264.7)的特異性粘附且具有較低細(xì)胞毒性，賦予了PHEMA膜抗非特異性吸附和特異性識(shí)別的仿生功能，使其可以作為體外載體進(jìn)行細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)，為人工組織和器官的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)。

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Preparation and bioactivity study of glycosylated polymer film based on vinyl sulfone chemistry

SUN Shiyou,LI Mingyang, WANG Hanqi, CHENG Fang

(State Key Laboratory of Fine Chemicals, School of Pharmaceutical Science and Technology,Dalian University of Technology, Dalian 116024, China)

Glycosylation of polymer film is essential for mimicking the dense “glycocalyx” in biomembrane and development of bio-functional materials. In this study, a convenient method was developed to conjugate glycose onto poly(2-hydroxyethyl methacrylate)(pHEMA) film using divinyl sulfone(DVS) as the coupling agent. A mannose glycosylated pHEMA film was prepared and characterized by Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR). The reaction conditions were optimized using specific protein adsorption studies, and the bioactivity of the glycosylated film was assessed at protein and cell level. The protein level results show that the mannose glycosylated pHEMA film has good anti-fouling capabilities and can specifically recognize Concanavalin A (ConA). The cell adhesion experiment using macrophages (RAW 264.7) suggest that the glycosylated film is highly bioactive and low cytotoxic. The glycosylation of polymer film using DVS provides a neat approach for the construction of biomimetic membrane and researches on glycometabolism process at cell level.

poly (2-hydroxyethyl methacrylate);vinyl sulfone chemistry; glycosylated film;protein adsorption;cell response

1001-9731(2016)10-10019-05

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21104008)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(DUT13LAB07)

2015-09-15

2015-12-20 通訊作者：程 昉，E-mail: ffcheng@dlut.edu.cn

孫世猷 (1989-)，男，遼寧阜新人，在讀碩士，師承程昉副教授，從事生物材料研究。

TB34

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.10.004