基于酶法交聯的再生納米彈性蛋白膜構建*

洪言情，王 平，朱雪珂，王 強，范雪榮

(江南大學 生態紡織教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

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基于酶法交聯的再生納米彈性蛋白膜構建*

洪言情，王 平，朱雪珂，王 強，范雪榮

(江南大學 生態紡織教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

彈性蛋白有良好的彈性、穩定性和生物相容性，可作為構建組織工程復合材料的組成部分。本文以4種不同的酚類物質為介體，通過酪氨酸酶催化氧化介體從而對彈性蛋白進行酶法交聯，并借助靜電紡絲方法制備納米纖維膜。結果表明，酪氨酸酶能催化氧化酚類介體物質，且酶催化效率與酚類物質的種類有關；SDS-PAGE凝膠電泳和體積排阻色譜(SEC)表明彈性蛋白在酪氨酸酶/咖啡酸以及酪氨酸酶/兒茶素體系中發生了交聯反應，生成了大分子蛋白聚合物。圓二色譜(CD)結果表明酶促交聯反應導致彈性蛋白二級結構發生變化，α-螺旋結構含量增多。酪氨酸酶/兒茶素催化體系改善了彈性蛋白的可紡性，制得的納米纖維粗細均勻，且膜材料有較好的生物相容性。

彈性蛋白；酪氨酸酶；介體；靜電紡絲；生物相容性

0 引 言

作為一種細胞外基質中高度交聯的纖維狀蛋白質，彈性蛋白(Elastin，簡稱EL)極難溶于水，具有被動伸縮的特性，能賦予器官和組織可逆形變的能力[1-3]。因此，在經常拉伸而變形的器官和組織，如肺、大動脈及韌帶中都有大量的彈性蛋白，對維持器官和組織的正常運轉起重要作用[4]。同時，彈性蛋白還有著良好的生物相容性、穩定性和自組裝性等，使其成為較友好的生物材料而運用于組織工程中[5-6]。然而，彈性蛋白由于高度交聯而不溶于水，使其難以加工成型，不同程度上限制了其在生物材料中的應用[7]。水溶性彈性蛋白作為彈性蛋白的水解產物，可通過與其它高分子交聯的方法，制備不溶性生物材料[8]。

生物酶法作為一種新型的改性方法，與化學改性相比，具有反應條件溫和、高效、專一以及生態環保的優點。酪氨酸酶(Tyrosinase，簡稱TYR，EC 1.14.18.1)是一種含銅的金屬酶，也被稱作多酚氧化酶，廣泛存在于自然界的微生物、植物以及動物體內[9]。酪氨酸酶具有雙重生物催化特性，既有單酚酶活性又有二酚酶活性，能將單酚物質氧化生成鄰苯二酚，并繼續氧化成鄰苯醌。作為活性物質的鄰苯醌能自身發生鍵合，也能與氨基、巰基等親核試劑發生席夫堿和邁克爾加成反應反應[10]。國內外許多學者通過酪氨酸酶對蛋白質進行酶法改性，如Sampaio等[11-13]以酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白上的酪氨酸剩基，從而將殼聚糖接枝在絲素表面，驗證了酪氨酸酶對蛋白改性的可行性。然而，由于不同蛋白間存在著酪氨酸含量與空間可及度的差異，使得部分蛋白不能夠被酪氨酸酶直接催化交聯改性。Thalmann等[14]通過酪氨酸酶催化氧化作為外源“介體”的咖啡酸，實現了對乳清蛋白、乳球蛋白以及溶菌酶的化學交聯，其反應機理如圖1所示。

圖1 蛋白在咖啡酸/酪氨酸酶體系中交聯機理

目前，對彈性蛋白材料的研究主要集中在以化學法與其它高分子材料復合上，采用生物酶法進行水溶性彈性蛋白生物材料構建方面的研究鮮有報道。本文以4種不同的酚類物質為介體，借助于酪氨酸酶催化氧化作用，進行了酶促彈性蛋白交聯研究，并制備出彈性蛋白納米纖維膜材料。

1 實 驗

1.1 實驗材料與儀器

實驗材料：水溶性彈性蛋白(美國Amresco)；酪氨酸酶(900 U/mg，美國Worthington)；鄰苯二酚(PC，國藥試劑)；咖啡酸(CA，阿拉丁試劑)；兒茶素(CAT，Sigma)；阿魏酸(FA，阿拉丁試劑)；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲酸(國藥試劑)。

實驗儀器：JPB-607型溶解氧分析儀(上海雷磁有限公司)；BIO-RAD Mini-P TET蛋白質凝膠電泳儀(美國伯樂公司)；ALLIANCE E2695高效液相色譜儀(美國Waters公司); MOS-450型圓二色光譜儀(美國Biologic公司)；Su1510型掃描電子顯微鏡(日本HITACHI公司)；JYB-1800型注射泵(長沙健源醫療科技有限公司)；ELISA酶標儀(美國Thermo公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 酪氨酸酶酶促交聯彈性蛋白

配制不同酚類介體(鄰苯二酚、咖啡酸、兒茶素或阿魏酸)溶液，加入0.25%(質量分數)彈性蛋白和100 U/mL酪氨酸酶液，在30 ℃、pH值為7條件下反應8 h；介體濃度分別為0，0.1，0.5，1，2，5和10 mmol/L。

1.2.2 彈性蛋白納米纖維膜材料的制備

將上述反應后的彈性蛋白冷凍干燥后，以98%甲酸溶解，分別配制成20%和30%(質量分數)的紡絲液，構建納米纖維膜。靜電紡參數：注射器針頭內徑為0.7 mm，針頭至纖維收集輥筒間距為10 cm，紡絲電壓為25 kV，注射速度為0.3 mL/h。

1.3 測試方法

1.3.1 酶促反應體系溶解氧測試

在密封條件下使用溶解氧分析儀測量反應體系中的氧濃度，記錄不同反應時間條件下體系溶解氧，直至體系中的溶解氧含量穩定。

1.3.2 SDS-PAGE凝膠電泳

將20 μL樣品與4 μL上樣緩沖液混合均勻，并在100 ℃水浴中沸煮10 min，取5 μL混合液上樣到10%～16%梯度膠上，然后進行電泳實驗，濃縮膠階段電壓100 V，分離膠階段電壓200 V。電泳結束后，蛋白膠在考馬斯亮藍 R-250染色，最后進行脫色。

1.3.3 體積排阻色譜(SEC)

采用0.22 μm的濾膜對彈性蛋白溶液樣品進行過濾，在高效液相色譜儀中分析蛋白分子量的變化。用含有0.3 mol/L的NaCl的磷酸緩沖液(50 mm, pH值為7)為洗脫液，洗脫速度為0.5 mL/h，以檢測波長為214 nm的紫外檢測器檢測洗脫蛋白質。

1.3.4 圓二色譜(CD)

通過圓二色光譜儀研究彈性蛋白溶液二級結構的變化，取蛋白樣品加入到1 mm比色皿中，檢測波長范圍為 195～250 nm的CD光譜，掃描速度100 nm/min。

1.3.5 掃描電子顯微鏡(SEM)

使用SEM觀察所制備的納米纖維膜的表觀形態結構，樣品經過濺射鍍膜處理，掃描時加速電壓為5 kV。

1.3.6 細胞毒性實驗

采用CCK-8實驗評價彈性蛋白納米纖維膜材料的生物相容性，樣品經過24 h的紫外消毒殺菌后，以10%胎牛血清高糖培養基浸泡3 d，去除樣品得到浸漬培養基，備用。將100 μL的NIH/3T3細胞懸浮液(5×104個/mL)注入96孔細胞培養板，在溫度為37 ℃、飽和濕度以及5% CO2培養箱中培養8 h，使細胞完全貼壁，然后去除培養基，添加浸漬培養基再培養24 h。最后向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在培養箱中孵育2 h，并在酶標儀測定450 nm處吸光度，每個樣品做5個重復實驗。

2 結果與討論

2.1 酶促反應體系溶解氧測試

酪氨酸酶催化氧化底物的過程中，需消耗溶液中的氧氣。測反應體系中溶解氧濃度變化，可了解酪氨酸酶對不同底物的催化效率。實驗中在不同底物中加入100 U/mL酪氨酸酶，測定密封反應體系中溶解氧含量變化，結果見圖2。

圖2 酪氨酸酶催化不同底物溶解氧含量的變化

由圖2可以看出，隨著反應時間的增加，酪氨酸酶溶液中溶氧量變化較少；酪氨酸酶/介體體系中氧含量隨處理時間延長而急劇下降，其中鄰苯二酚溶液中含氧量下降速率最快，含氧量下降較慢的兒茶素在8 min后溶解氧也趨于消耗殆盡。圖2中3種酚類介體均較易被酶催化氧化，這可能與其結構特性相關，三者均含有鄰苯二酚結構，使得酪氨酸酶可直接氧化底物成鄰苯醌類物質，而未經歷催化效率較慢的單酚物質羥基化生成鄰苯二酚過程。此外，3種酚類體系耗氧量的快慢也表明酶催化氧化速率與底物結構有關，底物結構越簡單，其催化速率也越快。

2.2 蛋白分子量分析

考慮到小分子介體酶促氧化后，可作為彈性蛋白分子間的天然交聯劑。實驗中考察了介體濃度為2 mmol/L條件下，酪氨酸酶催化彈性蛋白交聯的效果，借助SDS-PAGE凝膠電泳測定彈性蛋白體系蛋白分子量分布的變化，結果見圖3。

M-標準蛋白, 1-EL, 2-EL/TYR, 3-EL/PC, 4-EL/TYR/PC, 5-EL/CA, 6-EL/TRY/CA, 7-EL/CAT, 8-EL/TYR/CAT, 9-EL/FA, 10-EL/TYR/FA

圖3中彈性蛋白分子量主要集中在60 kD左右，經酪氨酸酶處理后，其分子量并沒有發生變化，表明酪氨酸酶對彈性蛋白沒有催化作用。對于只加酚類介體的彈性蛋白的分子量也幾乎沒有變化，表明僅介體處理并不能促進彈性蛋白交聯。彈性蛋白在酪氨酸酶/咖啡酸、酪氨酸酶/兒茶素催化體系中分子量均明顯增大，表明彈性蛋白分子間發生了交聯。盡管鄰苯二酚較易被酪氨酸酶催化氧化，但圖3中酪氨酸酶/鄰苯二酚處理后彈性蛋白分子量并未增加，其原因可能與鄰苯二酚氧化產物趨于發生自聚相關[15]。

為考察酪氨酸酶/介體催化體系中介體濃度對交聯效果的影響，選用圖3中介體效果較明顯的兒茶素進行研究。考察不同兒茶素體濃度條件下酶促彈性蛋白的交聯效果，結果見圖4。

M-標準蛋白, 1-EL, 2-EL/TYR, 3-EL/TYR/0.1 mmol/L CAT, 4-EL/TYR/0.5 mmol/L CAT, 5-EL/TYR/1 mmol/L CAT, 6-EL/TYR/2 mmol/L CAT, 7-EL/TYR/5 mmol/L CAT, 8-EL/TYR/10 mmol/L CAT

圖4中可以看出，在一定濃度范圍內，彈性蛋白分子量隨著兒茶素濃度增加而增大，其原因可能與兒茶素濃度增大，被催化生成的活性醌類物質增多，酶促彈性蛋白交聯效率隨之增加。當兒茶素濃度繼續增加至10 mmol/L，泳道8的上方條帶深度不及泳道7，這可能是由于較高濃度的兒茶素氧化產物部分發生了自聚反應所致[15]，使彈性蛋白分子間交聯效果不再進一步增加。借助體積排阻法，測定不同兒茶素濃度催化條件下彈性蛋白酶促交聯后的分子量分布，結果如圖5。

圖5 不同兒茶素濃度條件下酶促反應后彈性蛋白體積排阻色譜

圖5中可以看出，彈性蛋白分子在23.8 min時有一明顯的洗脫峰，表明彈性蛋白分子量比較集中。經過酪氨酸酶和5 mmol/L兒茶素催化體系處理后，彈性蛋白樣品的洗脫時間和洗脫峰的峰型發生了明顯的變化，如圖5所示，t1與t2區間的蛋白出峰時間提前，原先23.8 min處洗脫峰強度減弱，表明明彈性蛋白分子發生了交聯反應，形成了新的彈性蛋白大分子。此外，色譜圖中在28 min左右出現延遲峰，可能是由于兒茶素分子間發生聚合反應引起的[15]。

2.3 蛋白二級結構的變化

圓二色譜是研究溶液中蛋白質結構的快速、有效方法。實驗中借助于圓二色譜，考察彈性蛋白在以兒茶素為介體的酶促交聯過程中二級結構的變化，結果見圖6。

圖6 不同兒茶素濃度條件下酶促反應后彈性蛋白圓二色譜圖

從圖6可以看到，彈性蛋白在208和220 nm處有負峰，這說明彈性蛋白的二級結構以α-螺旋為主。隨著兒茶素濃度的增加，彈性蛋白的交聯程度增大，彈性蛋白在208 nm處負峰基本消失，同時220 nm處負峰強度增大，表明彈性蛋白的二級結構發生了變化。通過計算得到彈性蛋白二級結構的分布，如表1所示。

表1 彈性蛋白二級結構變化

表1結果表明，在酪氨酸酶/兒茶素催化體系中，彈性蛋白的二級結構隨著兒茶素濃度的增大而發生變化，其中α-螺旋結構含量明顯增大，無規卷曲含量減少，即彈性蛋白交聯導致其結構更加完整，這為再生納米彈性蛋白膜材料構建奠定了基礎。

2.4 彈性蛋白納米膜材料的形態

彈性蛋白經酪氨酸酶和兒茶素(5 mmol/L)介質體系處理后，以甲酸為溶劑制備20%和30%彈性蛋白的紡絲液，考察酶促改性對彈性蛋白可紡性的影響，并與空白樣對比，結果見圖7。

圖7 彈性蛋白納米纖維膜材料SEM圖

從圖7可以看出，當彈性蛋白濃度為20%時紡絲效果較差(圖7(a))，表現為全為串珠液滴，其原因與紡絲液粘度較低相關；當彈性蛋白經過酪氨酸酶/兒茶素催化處理后，納米纖維膜形貌發生變化，珠狀物減少(圖7(b))。增加紡絲液中彈性蛋白濃度至30%，未經酶處理樣品制得的纖維珠狀物減少(圖7(c))；以酶法處理制備的納米纖維直徑略有增加(圖7(d))，纖維表面變得較光滑。

2.5 改性彈性蛋白毒理性的研究

在構建彈性蛋白納米纖維膜基礎上，以CCK-8法測定NIH/3T3細胞的存活率評定該支架材料的生物相容性，結果如圖8。從圖中可以看出，細胞在彈性蛋白浸漬培養基中有著90%以上的存活率，說明彈性蛋白有著很好的生物相容性，能夠作為一種優良的生物材料運用在組織工程中。同時，細胞在改性后的彈性蛋白納米支架的存活率與改性前的基本持平，這表明兒茶素與酪氨酸酶并沒有作為一種有毒物質釋放到培養基中，即酪氨酸酶/兒茶素催化體系并沒有對彈性蛋白生物相容性產生影響，

圖8 NIH/3T3細胞在蛋白納米纖維膜表面的存活率

3 結 論

(1) 酪氨酸酶催化氧化彈性蛋白時，體系中溶氧量未明顯變化，彈性蛋白分子量也沒有增大，表明酪氨酸酶對彈性蛋白催化氧化作用較小。

(2) 應用酪氨酸酶/兒茶素介體可使彈性蛋白分子間發生交聯，形成大分子蛋白聚合物；改性后彈性蛋白α-螺旋結構含量增大，無定型結構減少，表明經酶催化交聯后蛋白二級結構更趨于完整。

(3) 經酪氨酸酶/兒茶素介體改性后，彈性蛋白可紡性增加，制得的納米纖維直徑趨于均勻，納米膜材料的生物相容性較好。

致謝：感謝江蘇省“青藍工程”項目的大力支持！

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Preparation of elastin nano-fiber membrane via enzyme-catalyzed cross-linking

HONG Yanqing, WANG Ping, ZHU Xueke, WANG Qiang, FAN Xuerong

(Key Laboratory of Eco-Textiles, Ministry of Education,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Elastin has excellent properties of elasticity, stability and biocompatibility, and it could be used as a major composite biomaterial for tissue engineering. In the present work, the enzyme-catalyzed cross-linking of elastin was carried out by using tyrosinase and four mediators of phenolic compounds, followed by preparation of elastin nano-fiber membrane by using electrospinning method. The results indicated that tyrosinase could oxidize the phenolic mediators and the oxidation efficiency was highly depended on the sort of phenolic compounds. SDS-PAGE and size exclusion chromatography (SEC) analysis demonstrated that elastin could be cross-linked by tyrosinase in the presence of catechin or caffeic acid, resulting in an increase of molecular weight of elastin. Circular Dichroism (CD) data revealed that the enzymatic cross-linking led to the changes of the secondary structures, the content of α-Helix was increased. Modification of elastin with tyrosinase/catechin improved elastin’s spinnability, and the obtained nano-fibers exhibited uniform fineness and good biocompatibility as well.

elastin;tyrosinase; mediator; electrospinning; biocompatibility

1001-9731(2016)10-10076-05

國家自然科學基金資助項目(51373071)

2015-07-02

2016-01-14 通訊作者：王 平，E-mail: pwang@jiangnan.edu.cn

洪言情 (1989-)，男，江西景德鎮人，碩士，師承王平教授，從事紡織品生態染整加工技術研究。

TS195

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.10.013