多元模塊工程在代謝工程中的應用與研究進展

劉丁玉，孟嬌，王智文，陳濤，趙學明

（1天津大學化工學院，天津 300072；2教育部系統生物工程重點實驗室，天津 300072；3天津化學化工協同創新中心，天津 300072）

多元模塊工程在代謝工程中的應用與研究進展

劉丁玉1，2，3，孟嬌1，2，3，王智文1，2，3，陳濤1，2，3，趙學明1，2，3

（1天津大學化工學院，天津 300072；2教育部系統生物工程重點實驗室，天津 300072；3天津化學化工協同創新中心，天津 300072）

隨著代謝工程理論體系的發展，代謝工程的研究方法目前已從對單一途徑的調控轉變為對整個代謝網絡的全局調控。同時，為了在工業微生物領域實現與化學工業生產規模相當的生物煉制過程，代謝工程需要一套通用的菌株優化策略。其中關鍵問題之一，是解決代謝通量的不平衡。本文介紹了基于傳統的理性代謝工程與近年來興起的組合工程中存在的問題，研究者提出了一種模塊化的代謝網絡優化策略——多元模塊工程（multivariate modular metabolic engineering，MMME）。闡述了多元模塊工程的原理和方法，列舉了其常用的調控技術和手段，在此基礎上綜述了近年來模塊化策略在代謝工程領域的應用進展，提出了該策略面臨的主要問題并展望了其未來的發展方向。

多元模塊工程；代謝工程；組合工程；合成生物學

人們利用微生物進行工業發酵生產已經有悠久的歷史，發酵產品遍布食品、藥品、能源、化工等多個領域。在此基礎上，BAILEY和STEPHANOPOULOS于1991年最先提出了代謝工程的概念。經過二十多年的研究與發展，人們在利用微生物進行發酵生產方面取得了顯著成效［1］。代謝工程最早致力于利用系統已知計量關系、動力學方程及相關知識對細胞表型進行理性修飾［2］，目前在這方面取得了輝煌的成果并產生了深遠的影響［3］。這些理論和技術目前仍被人們不斷地深入發展和研究。代謝工程前期研究已經取得了豐碩成果［4］，其一條重要原則是消除代謝途徑中的瓶頸，使代謝通量的分配達到平衡以獲得期望的目標表型［5］。

在代謝工程理論體系發展的二十年間，隨著“后基因組時代”的到來，大量的基因組、蛋白質組、代謝物組學數據已被獲得［6］，人工合成基因片段的成本顯著下降［7］，對胞內代謝機制的研究更加精確［8］。因此，代謝工程的研究重點已經逐漸從對單一基因或途徑的擾動發展到對整個細胞代謝通路的調控［9］。代謝工程的研究方法（toolbox）已經從傳統對單個基因或單一途徑的調控［10］轉變為對整個細胞的基因表達和代謝網絡進行全局調控［11］。

為了在工業微生物領域實現與化學工業生產規模相當的生物煉制過程，代謝工程需要具備一套標準的通用的菌株優化策略［12］。其關鍵點在于發現并有效地解決代謝通量的不平衡問題［13］。傳統理性代謝工程采用解調關鍵酶、基因敲除、過表達限速步驟基因等方法來解決代謝途徑中的瓶頸［14］。然而，由于生物系統的高度復雜性和生化反應非線性的特點，完全理性預測和設計途徑平衡的最優方案是很難實現的［4］。上述“極端”（過表達、基因敲除）的操作方法往往會給代謝途徑引入新的瓶頸。由于途徑中各基因的相關性，因此需要一種更加大尺度的調控多基因的方法來尋求代謝通量的最優平衡。

近年來，隨著合成生物學技術的發展，大量基因編輯和調控工具的開發使一種“組合工程”策略被廣泛應用。其與傳統理性代謝工程相比是一種隨機的、大尺度的優化代謝網絡的方法。其中包括直接調控基因表達強度的方法，如構建啟動子文庫和RBS文庫［15-16］。此外，還有利用轉錄因子進行轉錄水平的優化方法gTME［17］，直接在基因組進行多靶點操作的組合優化方法，如MAGE［18］、CAGE［19］、TRMR［20］、CRMAGE［21］等。這些策略的共同點是先獲得大量不同突變組合的文庫，再利用高通量篩選技術從中獲得最優表型［22］。雖然“組合工程”有很大的前景，但其廣泛的應用受限于需要依靠表型（如顯色產物、產物耐受性等）的高通量篩選，許多目標表型目前不具備高通量篩選的前提［23］。因此，基于以上兩種方法存在的問題，代謝工程研究者開發了一種模塊化的代謝網絡調控策略——多元模塊工程（multivariate modular metabolic engineering，MMME）［24］。這種模塊化思想與理性代謝工程相比更加簡單通用，不需要對某個基因或某條途徑的機理詳細認知，與“組合工程”相比卻更加系統和理性，而且避免了高通量的篩選過程，因此近年來被廣泛應用于代謝網絡的優化。本文闡述了多元模塊工程的原理和方法，列舉了其常用的調控技術和手段，在此基礎上綜述了近年來模塊化策略在代謝工程領域的應用進展，提出了該策略面臨的主要問題并展望了其未來的發展方向。

1　多元模塊工程的原理

多元模塊工程與傳統理性代謝工程和組合工程有所不同，如表1所示，是一種介于這兩者之間的代謝工程策略。其工程思路是將整個代謝通路分成不同的模塊，再利用代謝工程技術與合成生物學調控元件對各個模塊的強度進行調節以及協調不同模塊的表達，最終達到對整個代謝通路的優化。多元模塊工程思想來源于對細胞信號通路的模塊化行為的理解和啟發［25］，代謝網絡中的各種酶可以按照途徑分支、化學組成或酶學特性分成一系列模塊。只需構建少數的模塊組合，就可以在大范圍內優化代謝通路。

表1　不同代謝工程策略的對比

多元模塊工程的原理如圖1所示，對非線性的代謝網絡機制，用一系列模塊重新劃分代謝網絡，調控不同模塊強度的平衡表達，以解調或消除途徑瓶頸。將復雜的代謝系統簡單化，通過轉錄、后轉錄、翻譯水平的機制調控模塊表達，模塊間強度配置可用多元統計方法進行篩選，巧妙地通過一系列的模塊重新劃分傳統代謝網絡，更利于調整通量平衡和消除途徑中的瓶頸。一般來講，當以一個操縱子形式表達一個代謝途徑時，這條途徑的反應速率由這一途徑中反應速率最慢的酶所決定。這意味著，途徑中有些酶的反應速率難以達到其本身的最優值。將整個途徑中相似反應速率的酶歸為一個模塊，通過調整模塊表達量來平衡不同模塊的通量，從而使整體代謝網絡的效率最優化。同時將代謝網絡重新劃分為幾個相互影響的模塊不僅能夠使復雜的代謝系統更加易于分析，而且每個獨立模塊內部的基因表達可通過一系列的轉錄、后轉錄和翻譯機制進行模塊內部調節，模塊的強度可以用簡單的多元統計方法進行評價。隨著合成生物學技術的發展，大量標準化調控原件的構建以及基因序列合成成本的逐漸降低，意味著可以更加高效的構建不同強度的模塊并迅速進行檢測和分析。

圖1　多元模塊工程原理［12］

2　模塊強度的調控方法

目前模塊強度的調控主要依賴于質粒拷貝數、啟動子、RBS序列，如圖2所示。模塊強度調控方法主要有質粒拷貝數（高、中、低）、啟動子強度、RBS強度，3種方法通常結合使用，可以在大尺度強度范圍內精確調控多個模塊的平衡表達。這3種調控方法簡單、經濟，并且在同一宿主菌株中具有通用性，因此是多元模塊工程調控的首選。

圖2　模塊強度的調控方法

2.1質粒拷貝數

作為一種簡單、便捷且效果顯著的方法，質粒拷貝數的調節被頻繁地應用于途徑平衡優化。目前許多基因功能線路和代謝通路都是在質粒上構建，質粒的拷貝數對基因線路的表達強度會產生一定影響。多種不同拷貝數質粒可以在工業化菌株中實現各模塊不同水平的表達。目前利用質粒拷貝數優化模塊組合的最突出成果是XU等［26］利用其課題組自主開發的ePathBrick元件［27］，在大腸桿菌中協調表達與脂肪酸生產途徑相關的3個模塊，達到了該菌株中目前游離脂肪酸的最高產量。這個例子是多元模塊工程應用的經典案例，利用不同拷貝數的質粒簡單高效的調節3個模塊的強度，對8種模塊強度組合進行評價，最終篩選到最優組合。質粒作為一種最通用、經濟、方便的調控工具其優勢在這個例子中被充分發揮。除此之外，在類黃酮［28-29］、烯萜類［30］等代謝途徑中均有以質粒作為模塊優化工具的成功案例。但質粒表達基因的同時會給細胞帶來一定生理負擔，同時發酵后期可能出現質粒丟失的現象。因此，隨著基因組編輯技術和生物標準化元件的發展，在基因組上通過基因表達元件的調控來擾動基因的表達成為了更好的選擇。

2.2啟動子調控

在細胞代謝通量各個水平的調控中，轉錄水平的調控起著關鍵作用，啟動子在轉錄水平調控中居于關鍵的地位［31］。轉錄水平的模塊調節優化可通過不同啟動子來實現，啟動子的獲得途徑一般是，利用菌株已報道的不同強度啟動子，理性或半理性設計啟動子［32］，隨機篩選構建啟動子文庫［33］。目前，大部分研究中會將質粒拷貝數和啟動子調控聯合使用。WU等［29］以E.coli為宿主菌生產白藜蘆醇的研究中，將5個外源酶劃分為3個模塊，重新構建了生產白藜蘆醇的代謝途徑。最初將3個模塊表達在3個質粒上，白藜蘆醇產量只有3.03mg/L，進一步利用E.coli中常用的強啟動子Trc、T7，結合不同拷貝數的質粒協調平衡3個模塊的強度，最終最優菌株的產量達到35.02mg/L。從這個例子看出，將啟動子與質粒拷貝數兩種調控方法結合使用，可以增大調控幅度，優化設計方案，更加容易獲得最優型菌株。除E.coli外，利用啟動子進行模塊調控的方法在Bacillus subtilis［34］、Yeast［35］等其他模式菌株中也均有成功運用的案例。隨著目前啟動子工程技術的發展，利用啟動子調控相對于質粒拷貝數具有更寬的調控范圍，同時啟動子調控除了可以在質粒上實現外，還可通過基因編輯技術在基因組上實現，避免了過多的代謝負擔。

2.3RBS序列強度

RBS序列和蛋白翻譯的速率密切相關，能顯著影響目的蛋白表達量，因此是調控翻譯強度的重要元件。RBS序列一般用來調控單個基因的表達強度，不足以進行整個模塊強度的調控，但同樣可以將其運用到模塊化策略中，RBS序列由于其方便操作和便于理性設計的因素，可以在單一途徑中運用模塊化思想調控多個基因的表達強度。作者課題組利用自主開發的MIPE系統［36］和RBS計算器［16］，調控核黃素操縱子上5個基因的RBS強度，通過不同組合的篩選，使最終菌株核黃素產量提高了2.6倍。

目前對模塊強度的調控方法主要以上述3種方法為主，自多元模塊工程策略誕生以來，短短幾年內代謝工程研究者已經將其應用于多種途徑產品的生產，取得了顯著成果。如表2所示。

表2　近年來多元模塊工程在代謝工程中的應用

3　多元模塊工程在代謝工程中的應用

多元模塊工程作為代謝工程的一種重要菌株優化策略，已分別在原核和真核的不同模式菌株中有成功的應用案例。依據模塊劃分的方法，可將其在代謝工程中的應用分為兩部分。

3.1依據代謝支路節點劃分模塊的應用

以代謝支路為依據劃分模塊是最簡單有效的策略，將復雜的代謝網絡按途徑節點分割，每條途徑作為一個模塊。一般這種方法不僅可以劃分菌株自身的代謝途徑，同時可以將引入的外源途徑與本身的內源途徑結合起來重新劃分代謝網絡，這對有外源途徑引入的菌株是一種非常有效的平衡代謝通量的策略。

以代謝支路劃分模塊最經典的例子是AJIKUMAR等［30］在大腸桿菌中生產紫杉醇類化合物的研究，這也是第一次明確提出模塊化的概念，也開啟了該思想在代謝工程領域的廣泛應用。

該研究以IPP為節點將整個途徑分為兩個模塊：一是上游的內源MEP途徑模塊（dxs，idi，ispD，ispF）；二是兩個外源萜類化合物合成酶構成的下游模塊。使用不同強度的啟動子和不同拷貝數質粒組合調控上游和下游模塊的強度，協調兩個模塊通量平衡的同時也限制了副產物吲哚的積累。在作者構建的不同模塊組合的菌株中，成功篩選了高產紫杉二烯的菌株，其最高產量能達到1g/L，是對照菌株的15000倍。這個例子中，上游MEP途徑由8個基因組成，用傳統策略調控需要對該途徑代謝機理有詳細的認知，并且在默認其屬于線性系統的條件下進行，這會造成忽視很多非特異性效果（中間代謝物毒性、質粒造成的負擔等）。但研究者將其簡化為由4個限速步驟基因組成的模塊，通過整體的調控模塊強度回避了復雜的非線性作用，從而以“小尺度”的設計優化了大尺度的整體。將多元模塊工程的優勢充分發揮出來，對后來研究者采用模塊化策略是一個很好的引導。

AJIKUMAR等成功運用多元模塊工程后，國內外許多研究者追蹤了這項研究，成功的將該策略應用到各自的研究中，目前在不同菌株，不同途徑中均有成功應用多元模塊工程的范例。XU等［26］的研究也是根據途徑節點劃分模塊的典型例子，整個代謝網絡的15個基因依據中間代謝物節點被劃分為3個模塊，協調平衡模塊表達后使乙酰輔酶A的合成與丙酰基輔酶A的消耗之間達到平衡，最終菌株脂肪酸產量達到8.6g/L。DARMAWI等［37］將多元模塊工程運用于E.coli生產L-酪氨酸的研究中，以中間產物莽草酸為節點，將整個途徑分為上下游兩個模塊，逐步平衡兩個模塊的通量水平，結合組學技術進一步確定靶點，對基因做更加精細的調控。克服了之前文獻中對該產物途徑的研究僅局限于局部靶點而無法涉獵全局的缺點，是多元模塊工程與組學技術結合的范例。

ZHAO等［38］將多元模塊工程應用于大腸桿菌中β胡蘿卜素的生產，將整個代謝系統劃分為5個模塊，其中2個直接參與β胡蘿卜素合成的模塊：上游是E.coli的自身的MEP途徑模塊，下游是整合到基因組的外源途徑模塊（crtE、crtB、crtl、crtY）。除此之外還設計了3個中心代謝模塊：ATP合成模塊，TCA循環模塊和PP途徑模塊。利用其課題組自主構建的mRs文庫［39］對各個模塊的強度進行理性優化，根據不同優化組合下菌體生長狀況和β胡蘿卜等產量協調各模塊間的表達強度，從而優化整個系統的代謝平衡。通過多元模塊方法的調控，提高了生產β胡蘿卜素的前體物IPP和DMAPP以及輔因子ATP和NADPH的供給，成功獲得了穩定的重組菌株，其產量可達2.1g/L，比對照菌株提高了74倍。該例子中的模塊劃分不僅涉及產物合成途徑，中心碳代謝相關模塊也被統籌考慮，這樣不但可以更加全面地優化產物生成途徑的通量，同時將菌體生長情況也作為重要的參考指標，最終可獲得既穩定又高產的菌株。證明了用多元模塊工程的思路優化代謝途徑，可以更加全面的考慮各種相關因素，從而獲得遺傳背景更加符合工業化生產的菌株。

LIU等［34］首次在Bacillus subtilis中成功的運用了模塊化策略，將N-乙酰葡糖胺的相關代謝途徑分為3個模塊：①N-乙酰葡糖胺合成模塊；②糖酵解模塊；③肽聚糖生成模塊。其中模塊1與產物生成直接相關，首先用不同強度啟動子調控模塊1內部的通量平衡，使最終產量提高32%。模塊2、3均是競爭途徑模塊，用不同強度的弱化元件sRNA進行調控，最終綜合優化3個模塊的組合，使N-乙酰葡糖胺的最終產量達到31.65g/L。該研究對多元模塊工程的應用更加精細，運用模塊化思路從單一模塊到多個模塊逐級調控，主次分明，效果顯著，為這一方法的應用提供了重要參考。

同時ZHAO和LIU等的研究還有一個重要的共同點，即都基于優良的合成生物學標準化元件的運用（mRs文庫、sRNA），通過這些調控元件的運用使模塊調控更加理性且有針對性，可見多元模塊工程與高質量的生物學元件相結合，可以達到事半功倍的效果，也是這一策略未來的重要發展方向。

近期多元模塊工程的又一顯著成果是CHEN等［35］在酵母中進行高產富馬酸的途徑優化。模塊化思想在該研究中得到更加深刻的充分發揮，研究者以丙酮酸為節點將中心碳代謝途徑分為3個模塊，分別是還原（支路）模塊、氧化（產物生成）模塊、副產物模塊，每個模塊由相應支路中的關鍵酶構成。該研究并不是像以往的多元模塊工程研究那樣調控3個模塊的平衡表達，而是運用轉錄和翻譯水平的多種調控手段逐個對單一模塊進行優化，再將優化后的3個模塊結合表達，最終使富馬酸產量達到33.13g/L。該成果也是模塊化策略在途徑工程中的一種體現，說明多元模塊工程未必是劃分模塊后硬性的平衡模塊間的表達，也代表了一種先分而治之再相互結合的途徑工程思維方式。

3.2依據代謝途徑中的關鍵酶劃分模塊的應用

這種模塊劃分方法適用于更加復雜，多步驟以及代謝瓶頸突出的代謝網絡，把每個分支途徑中的限速酶作為一個模塊，以一個操縱子的形式在質粒或整合到基因組上進行表達，通過調控少數基因的表達達到調控不同代謝支路通量平衡的目的，是模塊化策略“化繁為簡”的充分體現。

WU等［28］在以E.coli生產松屬素的研究中，將整個網絡簡化為一個4模塊的系統。首先將底物到終產物的反應以L-苯丙氨酸為節點分為上下游兩部分，上游部分是由葡萄糖生成L-苯丙氨酸的一系列反應，將這部分簡化為由兩個關鍵步驟酶aroF、pheA組成的模塊1。同時，下游部分以酶的催化效率和消除代謝瓶頸為原則分別劃分為模塊2（PAL、4CL）、模塊3（CHS、CHI）。此外，為了增加另一重要前體物丙酰輔酶A的供應，將其生成途徑的兩個關鍵酶matB、matC作為模塊4。由以上8個關鍵基因重新組成新的模塊途徑，既解決了重要前體物的供給又消除了原來途徑中的通量瓶頸，使松屬素的最終產量達到40.02mg/L。WU等的研究雖然是以代謝途徑中的關鍵酶來劃分模塊，但其每個模塊中的酶仍然是來源于同一條代謝支路，其模塊劃分思路仍然沿襲第一種方法，可以看作是第一種劃分方法的簡化。

YAO等［40］在E.coli中構建丹參素合成途徑的研究則完全擺脫了代謝支路的局限，將整個途徑網絡中不同支路的基因按照酶的不同作用目的整合成4個模塊。模塊1為酪氨酸合成模塊（aroG，tryA，aroE），模塊2為葡萄糖利用模塊（ppsA，tktA，glk），模塊3為PEP-酪氨酸通路模塊（pckA，aroB，tyrB），模塊4為SHK-CHA通路模塊（aroL，aroA，evgA），其中每個模塊的基因并不處于同一條支路，以質粒拷貝數和啟動子調控4個模塊的不同組合，最終菌株中，丹參素產量可達7.1g/L。由于不同代謝支路具有一定的相關性且單一反應的通量與多種因素有關，因此該研究的模塊劃分策略與之前的研究相比更加理性，考慮的因素也更加全面。但這種模塊劃分方法目前依賴了于需要大量的研究基礎和理論積累，因此目前還無法在不同代謝網絡中大量使用，隨著系統生物學多種研究手段的發展以及研究者理論知識的積累，類似的研究方法會越來越廣泛的應用。

4　展 望

多元模塊工程已經成為代謝工程的一種重要研究方法，與其他代謝工程策略相比可以更加高效、系統、簡約地調控代謝通路中的通量平衡，其在短短幾年內被應用于多種代謝途徑的產品生產。它也為研究者們提出了一種研究代謝網絡調控機制的策略，開發了一個應對目前調控手段瓶頸的辦法。而且它的設計理論在多種宿主菌株以及不同代謝途徑中具有通用性，模塊化思想更有利于把代謝工程發展為更加系統和規范化的學科。多元模塊工程的未來發展趨勢主要為以下幾點。

（1）更加精確、理性地劃分模塊。模塊節點的選擇無疑是多元模塊工程最重要的環節，準確、高效地劃分模塊是實現代謝通量平衡和優化代謝網絡的基礎。目前的模塊劃分主要是從已知的代謝支路和途徑中的關鍵酶出發，隨著代謝通量分析技術和多種“組學”技術的發展，未來的研究者們對模塊的劃分將更加精確，模塊調控效果更佳突出。

（2）應用更加多樣、系統化的模塊調控方法。目前模塊表達水平的調控主要依賴于質粒拷貝數、啟動子等“粗糙”的調控手段，隨著合成生物學技術的發展，基于轉錄和翻譯水平的多種新的調控工具和元件將被運用（TIGRs［41］、SSR［42］等）。

（3）實現多模塊、大尺度的模塊組裝和調控。為了擴大調控范圍和引入更加復雜的外源途徑，除了運用更多轉錄及翻譯水平的調控元件外，多模塊的組裝和整合也是未來的重要發展方向。近年來開發的大量DNA組裝技術（Gbison［43］、CLIVA［44］、GoldenGate［45］）和基因組編輯技術（CIChE［46］）都有應用于多元模塊工程的潛力。此外，近期在細胞與分子克隆領域倍受關注的CRISPR-Cas9基因編輯技術，可以更加高效、多位點地修飾基因組和進行DNA片段的編輯。本文作者課題組LI等［47］利用此技術對E.coli生產β胡蘿卜素的代謝途徑進行修飾，在短時間內測試了33個基因組位點操作，構建了超過100株不同基因型的菌株，可見該技術的應用潛力。以上這些技術都為未來構建更加復雜、龐大的模塊代謝網絡提供了可能。

未來的代謝工程研究中，隨著各種“生物工具”的運用和分析技術的提高，多元模塊工程與理性代謝工程和組合工程之間將會有更多的交叉，三者的界限也會越來越“模糊”。這3種策略相互彌補，結合使用，會更加高效地構建出期望的生物表型。

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Progress and application on multivariate modular metabolic engineering in metabolic engineering

LIU Dingyu1，2，3，MENG Jiao1，2，3，WANG Zhiwen1，2，3，CHEN Tao1，2，3，ZHAO Xueming1，2，3
（1School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2Key Laboratory of Systems Bioengineering，Ministry of Education，Tianjin 300072，China；3Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering，Tianjin 300072，China）

With the development of metabolic engineering，the metabolic engineering research method of single pathway regulation has evolved into global metabolic network regulation. In order to realize the chemical industrial vision of ‘biorefineries' in the field of industrial biotechnology，metabolic engineering requires a systematic study with well-defined principles and tools. One of the key problems is balancing metabolic flux. Based on the traditional，rational metabolic engineering and the rise of the problems existing in the combinatorial engineering in recent years，the researchers proposed a modular metabolic network optimization strategy using multiple module projects. The modular strategies in progress of application in metabolic engineering during recent years are summarized. In addition，the main problem and future direction of this strategy to optimize metabolic pathways are presented in light of the current knowledge of multiple module application.

multivariate modular metabolic engineering；metabolic engineering；combinatorial engineering；synthetic biology

Q819

A

1000-6613（2016）11-3619-08

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.11.035

2016-04-19；修改稿日期：2016-05-27。

國家自然科學基金（NSFC-21576200，NSFC-21576191）、國家973計劃（2012CB725203）及天津市自然科學基金（15JCQNJC06000）項目。

劉丁玉（1987—），男，博士研究生，E-mail dingyuliu@tju.edu.cn；孟嬌（1990—），女，碩士研究生，E-mail jiaomeng@tju.edu.cn。聯系人：王智文，博士，講師。E-mail zww@tju.edu.cn。