微生物發酵產赤霉素的研究進展

彭輝，施天穹，聶志奎，郭東升，黃和，紀曉俊

（1南京工業大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816；2江西新瑞豐生化有限公司，江西 新干 331300）

微生物發酵產赤霉素的研究進展

彭輝1，施天穹1，聶志奎2，郭東升1，黃和1，紀曉俊1

（1南京工業大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 211816；2江西新瑞豐生化有限公司，江西 新干 331300）

赤霉素為植物五大激素之一，對植物生長具有多種生理作用，如調控植物的莖干延長、種子發芽、打破種子休眠、誘導開花等。目前赤霉素已經廣泛應用于農業、林業、釀造業等，具有很大經濟效益和市場前景。赤霉素的工業化生產主要通過藤倉赤霉液體發酵。盡管赤霉素具有多樣性的應用及巨大的經濟效益，但高生產成本嚴重制約其廣泛的應用。本文首先介紹了赤霉素的生物合成途徑以及赤霉素合成基因表達的調控機制，隨后重點總結了赤霉素發酵過程的菌種、營養因素、發酵參數、發酵工藝以及下游分離提純工藝等研究進展。同時指出未來的研究重點在于利用新型的誘變方法與分子生物學方法選育高產菌株以及發酵工藝的革新，以提高赤霉素的產量，降低發酵成本，促進赤霉素的大規模應用。

赤霉素；萜類；發酵；藤倉赤霉

赤霉素（gibberellins，簡稱GAs），是一種天然的植物生長調節劑，屬于生物體內的一類四環二萜類化合物，至今已發現136種，總稱赤霉素類（GAs）。常見具有生物活性的主要有GA1、GA3、GA4、GA7等（化學結構如圖1所示）［1-3］，它與生長素（auxins）、細胞分裂素（cytokinins）、脫落酸（abscisic acid）、乙烯（ethylene）稱為植物五大激素［4］。赤霉素對植物生長具有多種生理功能，例如通過調節水解酶活性從而調控種子發芽、莖干延長、誘導開花、打破休眠、性別分化等過程［5-6］，因而廣泛應用于農業、林業、釀造業等。赤霉素不僅分布于綠色植物，在一些細菌和真菌中也有發現［7］。目前獲取赤霉素主要方式有3種：植物中提取，化學合成，微生物發酵。由于前兩種方法價格昂貴、效率較低，而微生物發酵法具有周期短、效率高等優點，所以工業大規模生產赤霉素主要通過微生物發酵法。目前用于工業化生產的微生物主要是是絲狀真菌藤倉赤霉（Fusarium fujikuroi）、無性狀態為串珠鐮孢（Fusarium moniliforme），下文所描述的發酵菌種均為藤倉赤霉。但目前價格高依舊是阻礙赤霉素大規模應用的主要障礙［8］，因而必須通過菌種改良、發酵工藝優化、下游純化工藝優化等方法提高赤霉素產量，降低赤霉素的生產成本，以促進赤霉素的大規模應用。

圖1　赤霉素GA1、GA3、GA4、GA7的化學結構

1　赤霉素的合成途徑和調控機制

赤霉素作為一種典型的微生物次級代謝產物，在發酵中只有當氮源耗盡時才開始合成［9］。盡管合成途徑復雜，但研究者通過研究突變菌株、采用放射性標記等方法，已經將赤霉素合成途徑闡釋清晰［10-11］。同時赤霉素的合成除了受氮源調控，也受Velvet蛋白家族、信號分子等調控［12-13］。

1.1合成途徑

作為一種二萜類物質，赤霉素生物合成與其他萜類物質類似，主要分為3個階段。第一階段是牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）的合成，在真菌中它由乙酰輔酶A通過甲羥戊酸（MVA）途徑合成甲羥戊酸，再經過5-磷酸甲羥戊酸、5-焦磷酸甲羥戊酸、異戊烯焦磷酸（IPP）、3,3-二甲烯丙基焦磷酸、牻牛兒基焦磷酸（GPP）、法尼基焦磷酸（FPP）而得到［14］；而在植物中IPP合成主要是通過甲基赤藻糖磷酸（MEP）途徑，由丙酮酸和3-磷酸甘油醛經過多步催化反應合成IPP，后續合成GGPP則與真菌類似。第二階段是GA12-醛的合成，是由GGPP經過古巴焦磷酸合成酶（CPS）和內根-貝殼杉烯合成酶（KS）催化，第一次環化合成內根-貝殼杉烯，該反應為赤霉素合成的限速步驟［15］；內根-貝殼杉烯的C-19位的甲基經細胞色素P450-4單氧化酶的一系列催化下合成內根-貝殼杉烯酸，內根-貝殼杉烯酸再經過P450-1單氧化酶兩步催化合成GA12-醛。在此階段中，高等植物和真菌的赤霉素合成途徑是基本相似的［16］。第三階段赤霉素的合成，在真菌中GA12-醛首先經過羥基化合成GA14-醛，再經過一系列催化步驟合成GA3；而在高等植物中GA12-醛先經過19C的氧化合成GA12，再經過一系列氧化去飽和合成GA1等［17-19］。具體合成途徑如圖2所示。

1.2調控機制

類似于其他微生物次級代謝產物，在高濃度氮源條件下赤霉素合成基因表達受到嚴格的限制。在藤倉赤霉的發酵中只有在氮源限制時赤霉素才被大量合成［20］。研究表明赤霉素是第一個嚴格依賴GATA型的轉錄因子AreA的次級代謝產物。轉錄因子AreA能夠直接結合到赤霉素合成基因的啟動子上，進而調控赤霉素合成基因的表達［21］。近年MICHIELSE等［22］發現第二個GATA轉錄因

子——AreB，也是赤霉素合成基因表達所必不可少的。在藤倉赤霉中，谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）是另一個次級代謝產物的調控因子，也是合成谷氨酰胺的唯一酶。谷氨酰胺是最容易利用的氮源，其較高濃度時強烈抑制所有氮源限制基因的表達。當谷氨酰胺合成酶被移除后，細胞內谷氨酰胺的濃度處于較低水平，赤霉素合成基因則會大量表達。然而有學者發現當編碼谷氨酰胺合成酶的基因GLN1被敲除后，相反所有赤霉素合成基因表達水平均下降，導致赤霉素的產量降低［23］。在藤倉赤霉中Velvet蛋白家族的全局調控因子FfVel1、FfVelB也影響赤霉素合成基因的表達。FfVel1能夠促進赤霉素的合成。當它被移除后幾乎不合成赤霉素［24］。任何次級代謝產物的合成均是應對某種環境因素的刺激。腺苷酸環化酶（adenylyl cyclase）能夠刺激合成環磷酸腺苷（cAMP），隨后激活蛋白激酶A（Pka）。而Pka能對目的蛋白進行磷酸化修飾，從而改變蛋白活性［25］。MICHIELSE等［13］與GARCíA-MARTíNEZ等［26］研究均發現在藤倉赤霉中，當腺苷酸環化酶編碼基因被敲除后，細胞內赤霉素的積累水平急劇下降。

圖2　赤霉素生物合成途徑

2　菌 種

自1959年日本科學家首次將赤霉素從水稻病原菌的培養基中分離出來，逐漸發現赤霉素廣泛存在于植物、微藻以及部分真菌和細菌中。雖然植物中含有多種赤霉素，但含量較少，僅僅滿足自身需求，不適合工業化生產。目前用于工業化生產的是絲狀真菌藤倉赤霉（Fusarium fujikuroi），具有易于培養、產量高等優點。在藤倉赤霉菌菌種的研究方面，外國學者早期主要集中于通過物理誘變或化學誘變，或通過原生質體化及再生作用，得到了大量有關赤霉素合成途經缺失的突變體，以分析赤霉素的合成途徑。例如BEARDER等［27］通過紫外誘變獲得突變菌株B1-41a，其內根-貝殼杉烯氧化酶基因缺失無法合成赤霉素。CANDAU等［28］通過亞硝基胍誘變獲得突變菌株SG123、SG133，其C-13羥化酶的基因缺失導致不能合成GA3而是大量積累GA7。LALE等［29］通過紫外誘變獲得菌絲長度較短的突變菌株，有利于提高發酵過程中的溶氧水平，GA3產量提高近兩倍。而國內關于赤霉素高產菌株研究主要開始于“九二零菌種選育協作組”所篩選到的高產變種“4303”，該菌成為國內工業化生產上主要菌株。但是該菌為營養繁殖，無法生產孢子且為多核菌絲，給后續誘變帶來困難。近年來研究者主要通過制備原生質體進行誘變篩選高產菌株。例如余卿等［30］對赤霉素生產菌株85104的原生質體進行紫外誘變獲得高產菌株，產量提高近32%。李武軍等［31］通過對藤倉赤霉菌207融合重組誘變獲得高產菌株，產量提高近25%。張金兒、王衛［32-34］等采用氯霉素、脂肪酶、制菌霉素、萘比特芬等不同的半理性、理性的篩選方法獲取高產菌株。本文作者課題組在菌種選育方面也做了不少工作，已通過常壓常溫等離子體誘變（ARTP）以及采用酮康唑為篩選壓力獲得赤霉素產量較高且遺傳穩定的優勢菌株。近年來國內外主要赤霉素高產菌株研究概況如表1所示。

表1　不同赤霉素高產菌株研究概況

3　發酵過程

發酵過程的優化與優良菌種一樣是提高產物產量必不可少的策略。發酵過程優化主要包括對最佳營養因素、發酵條件、發酵工藝的研究與探索。研究者發現藤倉赤霉的發酵過程的參數以及發酵工藝對赤霉素的產量和品質影響巨大。

3.1營養因素

3.1.1氮源

氮源的濃度和種類對發酵產赤霉素至關重要，因為赤霉素只有在氮源限制的情況下才開始合成［45］。所有的研究都指出高濃度的赤霉素含量均是在低濃度的氮源條件下才能積累［46］。常用的無機氮源有硫酸銨、氯化銨，有機氮源有甘氨酸、酒石酸銨、植物粉、玉米漿等［47］。GOHLWAR等［48］發現在乳清培養基中添加含氮化合物時，生物量會急劇增加，但赤霉素的含量卻在降低。而VASS等［49］發現在低溶度的銨鹽或者硝酸鹽的培養基中添加少量的玉米漿、花生粉、大豆粉等能夠促進赤霉素的合成。原因可能是這些復合物中含有赤霉素合成的前體物質或者促進劑。CANDAU等［50］發現無論是發酵開始存在或者中途添加硝酸根離子、銨根離子和谷氨酰胺都會抑制赤霉素的合成。SANCHEZ-FERNANDEZ等［51］同樣發現包括尿素和氨基酸都是赤霉素合成的抑制劑。LALE等［52］研究發現當用小麥蛋白代替脫脂豆粕作為氮源時，GA3的含量大大降低，而GA4的含量卻增加了兩倍多。本文作者課題組通過對十余種氮源進行篩選，發現脫脂豆粕為最優氮源。這說明氮源的種類還會影響赤霉素合成途徑中酶的活性。

3.1.2碳源

不同的研究者嘗試過不同種類的碳源用來生產赤霉素。主要可以分為速效碳源和遲效碳源，兩者也經常以不同的比例混合使用。葡萄糖和蔗糖是經常使用的兩種碳源，但葡萄糖的初始濃度不能超過20%，否則會引起代謝抑制阻斷赤霉素的合成［46］。GONZáLLEZ等［53］發現蔗糖和淀粉的混合物是發酵產赤霉素的最優碳源。GANCHEVA等［54］發現在發酵中添加油脂，例如葵花籽油、大豆油，有利于提高赤霉素的產量。主要原因可能是由于赤霉素合成中需要乙酰輔酶A的提供，而油脂代謝過程能夠提供大量乙酰輔酶A；另外油脂作為碳源也不會引起碳代謝抑制。一些廉價的工業廢料如牛奶乳清、甜菜渣、糖蜜也常作為碳源使用。而國內赤霉素的工業化生產大多使用經過淀粉酶液化的淀粉作為碳源，這樣不僅可以降低成本，而且還可同時提供速效碳源（如葡萄糖）和遲效碳源（如糊精、淀粉），供細胞生長和赤霉素積累的需要。

3.1.3無機鹽與微量物質

除了碳源、氮源，鎂、鉀、鋅等無機鹽也是

赤霉素積累的必須營養因素。JEFFERYS［55］發現，添加單種金屬離子時，微量鋅能有效促進藤倉赤霉產赤霉素；添加多種金屬離子時，鋅、鉬、銅的共同作用能有效促進藤倉赤霉產赤霉素。而其他微量物質作為前體或者促進劑的添加對赤霉素的合成也有一定的促進作用，例如，維生素B1、谷氨酸等。CIHANGIR［56］發現在黑曲霉發酵產赤霉素時添加少量的甲羥戊酸時，赤霉素的產量可以提高近50mg/L。

3.2發酵參數

3.2.1pH

pH是對發酵產赤霉素影響最大的因素之一，它主要影響赤霉素的含量以及赤霉素的種類。對于GA3的生產，pH值主要在3.5～5.8之間，過高（＞6.0）則偏向于生產GA4和GA7，過低（＜3.5）則偏向于生產GA1［6］。主要原因可能是過高pH促進中間代謝物GA4和GA7等分泌到胞外而不能再轉運回胞內繼續合成終產物GA3，另外的原因可能pH影響赤霉素合成途徑中的酶的活性［57］。MELEIGY等［43］在串珠鐮孢發酵產赤霉素時發現在pH為5時，總赤霉素產量為2.25g/L；當pH為3和7時，總赤霉素的產量分別為0.36g/L和0.21g/L。在固體發酵中，pH測定比較復雜。因而固體發酵產赤霉素時，一般很少考慮pH。ESCAMILLA等［41］在固定化發酵中發現初始pH為5時赤霉素產量最高。

3.2.2溫度

溫度對赤霉素產量的影響與菌株的種類相關。利用藤倉赤霉或者串珠鐮孢發酵產赤霉素時，提出過的最適溫度分別有25℃、27℃、28℃、29℃、30℃［58-61］。JEFFERYS［55］發現在藤倉赤霉中31～32℃利于菌體生長，而29℃更利于產物赤霉素的合成，高于29℃赤霉素的產量則急劇下降。MELEIGY等［43］發現在串珠鐮孢培養中發現，在30℃時赤霉素的產量最高可達1.84g/L。隨著溫度的升高赤霉素的產量開始下降，直到40℃時赤霉素的合成受到抑制。ESCAMILLA等［41］發現在流化床中培養固定化藤倉赤霉產赤霉素時，在30℃時赤霉素的產量最高。

3.2.3溶氧

赤霉素發酵過程是需氧過程，整個發酵過程都需要充足氧氣的供應。除了菌體正常生長所需的氧氣，赤霉素的合成也需要大量氧氣的參與。因為在赤霉素合成途徑中涉及到許多氧化步驟，如細胞色素P450單加氧酶、雙加氧酶、脫氫酶所催化的反應都需要氧氣的參與，所以在赤霉素生產過程合適的溶氧供給至關重要［62］。當發酵過程中溶氧供應過低時會導致菌絲體內的代謝發生改變，厭氧呼吸產生大量對細胞有毒害作用的乙醇、乙酸等；同時赤霉素的合成受到抑制并產生大量的副產物；造成pH急劇下降，菌絲體自溶，發酵終止，從而產量偏低。在實際生產中，可以通過提高轉速、通氣量，添加氧載體、表面活性劑以及改變發酵方式等保證氧氣的供應。但是發酵過程中并不是溶氧越高越好，當溶氧過高時，不但會造成溶氧過剩提高生產成本，而且也會造成一些副產物的大量合成如脂肪酸等，赤霉素的產量反而降低。BORROW等［63］發現在通氣中加入少量的二氧化碳能夠大大減少延滯期，GA3的最終產量達0.62g/L，而不添加二氧化碳赤霉素的產量僅僅0.42g/L。MACHADO等［64］在固體發酵期間發現在發酵72h之前提供較低的溶氧［0.24L/（h·kg）］，而在其后提供高供氧［0.72L/（h·kg）］，GA3的產量可達到最高。莊木坤［65］通過基因工程手段將透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）整合到藤倉赤霉菌染色體中，得到轉化菌株，該工程菌對發酵過程中溶氧的需求降低，從而降低發酵成本，在低溶氧條件下也能獲得較高赤霉素的產量。

3.3發酵工藝

赤霉素的發酵工藝有著長足的發展歷史。最早由日本學者通過表面培養方式產赤霉素，但產量極低［66］。隨著固體發酵技術的成熟以及固體發酵法生產具有設備簡單、操作容易等優點，赤霉素的固體發酵在20世紀五六十年代已成功應用。FOCKE等［67］第一次利用玉米廢棄物作為固體培養基生產赤霉素。后來研究者發現利用麥麩替換玉米廢棄物赤霉素的產量能夠提高1.6倍［68］。KUMAR等［69］指出在同等含量的碳水化合物的培養基中，在固體發酵中赤霉素的產量可以達到液體發酵的1.6倍。RODRIGUES等［42］發現利用檸檬果肉作為底物時赤霉素的產量可達5.9g/kg。但固體發酵也存在一些明顯的缺點，如固體發酵過程穩定性差，各項參數（pH、溶氧、溫度等）不易檢測與控制，無法實現大規模工業生產。現在赤霉素工業化生產多采用液體深層發酵。人們對赤霉素液體發酵的研究，除了對營養因素、發酵參數、前體的添加等研究之外，也對不同的液體發酵工藝進行嘗試。SHUKLA等［44］采用反復分批發酵方式，赤霉素的產量為1.31g/L，大大縮短了發酵周期，降低了發酵成本。連續發酵也成功應用于赤霉素的生產，不過由于生產成本過高，并沒有在大規模工業生產中應用［70］。近年來由于固定化發酵技術的成熟以及該技術的經濟性，很多學者都對赤霉素生產菌的固定化發酵進行研究［71-74］。常用的固定化材料有聚氨酯、卡拉膠、海藻酸鈣、硅藻土等。ESCAMILLA等［41］在流化床中培養固定化的藤倉赤霉產GA3，通過優化pH、碳氮比、米粉濃度和溫度后，產物的濃度是之前懸浮和固體發酵濃度的3倍以上。但固定化大規模生產赤霉素也存在很多問題，例如菌種的退化、無菌環境的維持、發酵過程的控制等。隨著固定化材料、生物反應器、發酵過程控制的發展，大規模固定化生產赤霉素將會實現。由于赤霉素發酵中存在產物反饋抑制和赤霉素在水溶液中易于降解失去生物活性的問題導致產量降低，研究者通過采取萃取發酵工藝解決以上問題。例如HOLLMANN等［75］發現通過萃取發酵赤霉素的產量提高了近2倍。但是該工藝存在價格昂貴等問題，難以大規模工業化生產。

4　分離純化

赤霉素的分離純化過程中主要關鍵問題在于保持赤霉素的活性、高得率和高純度。最早用于赤霉素分離的方法是活性炭吸附法。該法先利用活性炭吸附赤霉素，然后再通過甲醇或者丙酮萃取獲取產量。該方法價格昂貴，效率低下，不宜大規模生產使用［76］。20世紀60年代后主要的分離方法為有機溶劑的液液萃取。常用的有機溶劑有乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁醇等。該法的純化效率可達40%以上。但是該方法需要大量的有機溶劑，回收成本昂貴，同時萃取過程中不可避免的會帶來一些色素、有機酸等副產物。第三種常用的分離純化方法為吸附法，主要分為吸附樹脂分離法和離子交換分離法。吸附樹脂分離法主要通過樹脂對赤霉素的選擇性吸附富集，再用有機溶劑洗脫下來。常用的樹脂是大孔吸附樹脂。王瑞芳等［77］通過大孔樹脂吸附法提純赤霉素，最終收率高達95%。由于赤霉素為一種弱酸，常采用強堿性陰離子交換樹脂，對赤霉素離子交換提純。萬金保等［78］利用強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂提純赤霉素，總收率達到80%。目前工業化生產逐漸采用膜分離法。因為膜分離法具有分離條件溫和、分離效率高、能耗低等優點。但是也存在膜的使用周期短以及價格昂貴的缺點。因此研究新型廉價、耐用的分離膜是進一步促進膜分離法大規模應用的關鍵問題。

5　展 望

赤霉素作為一種植物激素主要對植物生長具有多種生理功能，已廣泛應用于農業、林業、釀造業等行業。目前赤霉素的生產主要通過液體深層發酵方式，產量維持在2g/L左右。但是由于發酵產量一直無法提升，生產成本居高不下，導致赤霉素無法大規模應用。今后的研究應該集中于以下兩個方面。

（1）優良的菌種是提高發酵水平最關鍵的因素之一。菌株的選育應該從兩方面研究，一是采取新型的誘變方法（常溫常壓等離子體誘變、γ射線誘變等）以及高通量的篩選方法，以一種理性誘變方式獲取高產菌株；二則通過合成生物學方法在大腸桿菌或者釀酒酵母等模式生物中構建赤霉素合成途徑，獲得高產赤霉素工程菌。

（2）進一步對藤倉赤霉發酵過程進行優化。首先根據藤倉赤霉內赤霉素合成的調控機制來優化宏觀的發酵條件，以微觀指導宏觀，其次改變傳統的發酵方式，如采用新型的生物反應器，達到提高赤霉素產量的目的。

（3）開發高效低耗的赤霉素分離純化工藝，以較低成本獲取高品質的赤霉素產品。

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Fermentative production of gibberellins：a review

PENG Hui1，SHI Tianqiong1，NIE Zhikui2，GUO Dongsheng1，HUANG He1，JI Xiaojun1
（1State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechogy and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816，Jiangsu，China；2Jiangxi New Reyphon Biochemical Co.，Ltd.，Xingan 331300，Jiangxi，China）

Gibberellins（GAs）are one of the five plant hormones which play an important role in plant growth and development. They affect stem elongation，seed germination，elimination of dormancy，flowering and so on. Gibberellins have been widely used in the agriculture，forestry and brewing industries，and have brought great economic benefits. The industrial production of gibberellins is based on submerged fermentation by Fusarium fujikuroi. Although gibberellins have a diversity of applications and huge economic benefits，high production costs severely restrict their widespread application. This review summarizes the metabolic pathway and the regulatory mechanism for gibberellins biosynthesis. Also，the strains，nutritional factors，fermentation conditions，fermentation techniques and separation and purification process are discussed in detail. Meanwhile，it is pointed out that the focus of future research should be placed on screening high-yield strains as well as improving fermentation technology，in order to reduce the production cost and achieve large-scale application of gibberellins.

gibberellins；terpene；fermentation；Fusarium fujikuroi

Q 939.97

A

1000-6613（2016）11-3611-08

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.11.034

2016-04-12；修改稿日期：2016-07-15。

國家自然科學基金（21376002，21476111）、江蘇省自然科學基金（BK20131405）及江蘇高校優勢學科建設工程項目。

彭輝（1992—），男，碩士研究生。聯系人：紀曉俊，副教授，研究方向為微生物代謝工程。E-mail xiaojunji@njtech.edu.cn。