等溫滴定量熱法測定酶催化反應的熱動力學參數

彭尚，孫麗霞，熊珍愛，周利琴，蘭雄雕，孫建華，童張法，廖丹葵

（廣西大學化學化工學院，廣西高校資源化工應用新技術重點實驗室，廣西 南寧 530004）

等溫滴定量熱法測定酶催化反應的熱動力學參數

彭尚，孫麗霞，熊珍愛，周利琴，蘭雄雕，孫建華，童張法，廖丹葵

（廣西大學化學化工學院，廣西高校資源化工應用新技術重點實驗室，廣西 南寧 530004）

采用等溫滴定量熱法（ITC）測定豬肺血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）催化水解其體外模擬底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）反應的熱動力學參數，考察了溫度對動力學參數的影響。結果表明，該反應的摩爾水解焓ΔHhydr為正值，是吸熱反應，且隨溫度升高ΔHhydr增大，等壓比熱容cp為0.2126kJ/（mol·K）；ACE催化HHL的水解反應符合Michaelis-Menten機理，在實驗溫度范圍內（298.15～313.15K），米氏常數Km隨溫度升高而減小，催化常數kcat隨溫度的升高先增大后減少，在308.15K時達到最大值2.534s-1。將該法與傳統的初始速率法進行比較，傳統法存在的局限性使測得的Km相對偏大。同時使用ITC結合動力學分析測得ACE抑制劑藥物依那普利拉為競爭性抑制劑，抑制常數KI為12.1 nmol/L，與文獻比較證明該法可用于抑制劑類型的判斷，是一種開發ACE抑制劑的新方法。應用該方法確定活性多肽Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr（RY-5）為非競爭性抑制劑，抑制常數KI為1.0 μmol/L。

等溫滴定量熱；反應動力學；血管緊張素轉化酶；熱力學；生物催化

酶的催化動力學及抑制劑研究是酶學研究中非常重要的一個部分，得到的信息能夠預測催化反應的路徑。傳統酶動力學參數測定的方法是通過光譜、電化學或者色譜等檢測手段測定在不同底物濃度下、一定時間內酶催化底物生成某種產物的量，該方法較繁瑣且有一定局限性［1-2］。等溫滴定量熱（isothermal titration calorimetry，ITC）技術作為一種新興的測定方法，可以快速直接準確測量化學反應過程中產生的熱量變化。

目前，ITC技術在酶催化反應研究中被廣泛應用。LONHIENNE等［3］使用ITC在大分子擁擠體系中測量了丙酮酸激酶等多種酶的酶學常數。CAI等［4］使用核糖核酸酶催化cCMP反應產生的產物3'-CMP抑制劑作為探針測量了核糖核酸酶的動力學參數，為存在產物抑制的酶反應動力學參數的測定開辟了新的思路。BIANCONI等［5］與宋熙熙［6］先后使用等溫滴定量熱法測量了脲酶-尿素水解反應的動力學參數。上述結果均證實了ITC是一種精確快速研究酶動力學的方法。

ACE在人體血壓調節中起著重要的作用，通過將十肽血管緊張素Ⅰ轉化為八肽血管緊張素Ⅱ從而使血壓升高，其抑制劑可以抑制ACE的活性起到降血壓作用［7］。早期對ACE酶學性質的研究是用初始速率法測定其體外模擬底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）與ACE的酶促反應速率來監測反應進程。本實驗擬以ITC法測量ACE酶促反應熱動力學參數及其抑制劑依那普利拉的抑制類型，并將所得結果與傳統法進行比較。將ITC法用于小肽Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr（RY-5）抑制類型的判斷，為開發ACE抑制劑提供一種新的方法和思路。

1　實驗部分

1.1實驗試劑

試劑：豬肺血管緊張素轉化酶（自提，比活為1.2U/mg，具體方法見參考文獻［8］）；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu；HHL），Sigma公司；依那普利拉（Enalaprilat）,標準物質，中國藥品生物制品檢定所；RY-5委托吉爾生化有限公司合成；硼酸、硼砂、氯化鈉，分析純；緩沖溶液均為pH=8.3的0.1mol/L的硼酸緩沖液（含0.3mol/L的NaCl）。

1.2實驗儀器

等溫滴定量熱儀NANO ITC（USA TA），量熱池體積為164μL；高效液相色譜儀1260，美國安捷倫；紫外可見分光光度計UV2501pC，日本島津。

2　實驗方法

2.1ITC法測定不同溫度下ACE催化HHL反應動力學參數

在量熱池中注入0.5μmol/L的ACE酶液至滿，攪拌速度設定為300r/min，待量熱儀達到實驗溫度且基線穩定后開始自動滴加15mmol/L的HHL，共20滴，每滴體積為1μL，時間間隔60s。

2.2初始速率法測定ACE催化HHL反應動力學參數

配制濃度范圍0.5～20mmol/L的HHL溶液，各取40μL加入1.5mL的離心管中，依次加入160μL ACE，在308.15K（催化常數達到最大值時對應的溫度）下保溫反應5min，隨后加入150μL濃度為1mol/L的HCl終止反應。

2.3ITC驗證依那普利拉抑制類型

在量熱池中注入1μmol/LACE與10nmol/L依那普利拉1∶1的混合液至滿，攪拌速度設定為300r/min，待量熱儀達到308.15K且基線穩定后開始自動滴加15mmol/L的HHL，共30滴，每滴體積為1μL，時間間隔60s。將實驗結果與文獻進行比較，確定ITC是否可用于藥物抑制類型的判斷。

2.4初始速率法判斷RY-5抑制劑類型

取12個1.5mL的小離心管，依次加入120μL ACE，每管加入不同濃度的抑制劑以及HHL各40μL。RY-5終濃度為0.86μmol/L和1.72μmol/L。在308.15K下保溫反應5min，隨后加入150μL濃度為1mol/L的HCl終止反應。

2.5應用ITC判斷RY-5抑制類型

采用2.3節的方法判斷RY-5的抑制類型，即將依那普利拉更換為RY-5，濃度為0.8μmol/L，其他條件相同。

2.6數據處理

實驗直接得到的數據為熱功率P，它代表的是單位時間t內熱量值Q 的改變量。

通過式（2）可以計算HHL的摩爾水解焓ΔHhydr。

催化反應的瞬時速率可表示為式（3），可以得知反應速率v與P在相同實驗條件下呈固定倍數關系，反應速率的大小可以直觀的呈現在熱流曲線上。

反應池底物濃度變化如式（4）所示。

無抑制劑、競爭性抑制劑和非競爭性抑制劑存在下的米氏方程及抑制常數KI的計算，如式（5）～式（8）。

3　結果與討論

3.1ACE催化HHL反應的摩爾水解焓

采用ITC法測定反應速率需要知道ΔHhydr，建立熱量與反應速率的關系。表1為298.15～313.15K溫度下，計算得到ACE催化HHL反應的ΔHhydr及等壓熱容cp，ΔHhydr均為正值，說明該反應為吸熱反應，且其數值隨著溫度的升高而增大，較小的cp說明了底物與ACE的結合以剛性結合占主導，酶與底物結合主要由結構的互補性（如較好的三圍結構契合以及合適的非共價的離子鍵和氫鍵作用力）決定［9］。

表1　不同溫度的摩爾水解焓

3.2溫度對ACE催化HHL反應動力學參數的影響

不同溫度ACE催化HHL水解反應的等溫滴定曲線如圖1，由式（3）可知，熱功率的變化反映了催化反應速率的變化。

在每一次底物剛滴入量熱池中時，由于此時底物濃度最大，反應速率達到最大值，且反應速率會隨著底物的消耗而下降。為了測定酶的動力學常數，需要對底物濃度進行累積。隨著底物濃度趨于飽和，反應速率的增加量逐漸變小。

BIANCONI［5］報道了該方法測定脲酶水解尿素的動力學參數，其熱流曲線呈臺階式增長（例如圖1中298.15K時的熱量曲線圖），即每一滴產生的熱流曲線中有一段時間熱功率值基本保持不變，這一階段被認為是勻速反應。本文作者認為，在底物濃度較低時，反應速率都會受底物濃度影響，這一階段反應速率也會因為底物被不斷消耗從而降低，圖中呈臺階式的原因是因為這一階段底物消耗的量相對于這一滴底物增加的量是非常小的，所以在熱流曲線圖中表現不明顯。從而可以得知，傳統的初始速率法對于一些反應速率較快的酶的動力學參數的測量是存在較大誤差的。

圖1　不同溫度下ACE催化HHL水解反應的等溫滴定量熱曲線

根據式（3）計算v，根據式（4）計算S，作出S與v的關系圖，并通過origin8進行雙曲線擬合，結果見圖2，得到的催化常數kcat與米氏常數Km的值如表2。

由表2可知，Km的值隨著溫度的升高而變小，升高溫度有利于增加底物與ACE分子碰撞概率，底物更容易進入ACE內部并與活性中心結合，表現出底物與ACE更好的親和力。表2中kcat在298.15～303.15 K時變化非常明顯，隨溫度升高而急劇增大，在303.15～313.15K時變化緩慢且有下降的趨勢，下降的原因是因為溫度過高會使部分酶失活，而Km與酶濃度無關，所以Km在這一溫度范圍內不會下降。

圖2　不同溫度下ACE酶促反應動力學曲線

表2　不同溫度下Km、kcat的值

3.3初始速率法與ITC法比較

初始速率法中采用高效液相測定不同HHL濃度下反應液中馬尿酸對應的峰面積，根據馬尿酸標準曲線［8］計算出v。以S為橫坐標，v為縱坐標繪制ACE酶促反應動力學曲線，如圖3所示。

圖4為兩種不同方法在308.15K下的Lineweaver-Buck雙倒數圖，擬合直線在橫軸上的截距為-1/Km，可以看出初始速率法測得的Km要比等溫滴定量熱法大，計算得到308.15K時初始速率法測定Km為1.8mmol/L，而等溫滴定量熱法則為0.712 mmol/L。

圖3　ACE酶促反應動力學曲線

圖4　兩種不同方法的動力學曲線

造成初始速率法測出的米氏常數偏大的原因是測定的速率為反應過程5min的平均速率，在底物不飽和時，反應速率是隨著底物濃度變化而變化的，所以測得的速率與實際初速率相比是偏小的，隨著底物濃度的增加，這種偏差越來越小，這樣勢必造成結果的偏差，即Km值偏大。而等溫滴定量熱法反應速率可以實時的反映在熱功率的變化上，每滴熱功率極值即為在該濃度下的最大反應速率，相比5min的平均速率法，該方法較大的提高了實驗結果的精確度。

Km作為酶的特征常數，可以一定程度上用于酶的定性，劉宏等［10］與吳瓊英等［11］報道了Km范圍為0.174～3.168mmol/L，均是使用初始速率法測得，且酶活反應溫度在308.15～313.15K之間，從量熱曲線中可以看出，這一溫度范圍內反應速率隨底物消耗波動較大。由于ACE來源及提取工藝的不同，與底物的親和力會有所差異，但對于同一實驗得到的ACE來說，ITC法測得的Km會更接近真實值。所以ITC法與初始速率法相比，操作簡單，測量精確，是值得被廣泛運用，并可以通過進一步完善來提高精確度的生物檢測手段。

3.4依那普利拉抑制類型

在ACE與HHL反應的體系中加入依那普利拉，ITC結果見圖5，隨著底物濃度不斷增加，依那普利拉實驗組的熱功率值越來越趨近于空白組的熱功率值，說明隨著底物濃度的增加依那普利拉抑制效果變弱，而競爭性抑制劑的特點就是底物與抑制劑共同競爭活性位點，濃度的高低決定競爭力的強弱，所以可判斷依那普利拉為競爭性抑制劑，與ANDUJAR-SANCHEZ等［12］報道的相符。即ITC可應用于抑制劑類型的判斷。

根據式（3）計算v，根據式（4）計算S，做出L-B雙倒數圖，有/無依那普利拉的兩條擬合直線相交于縱軸的正半軸，符合典型的競爭性抑制劑雙倒數圖特點［13］。根據式（8）計算得到抑制常數KI=12.1nmol/L，根據Cheng-Prusoff方程［14］KI=IC50/（1+I/Km），I為抑制劑的濃度，其值遠小于Km值，所以IC50≈KI，在CECONI等［15］報道的2～36nmol/L范圍之內。

圖5　有/無依那普利拉時ACE催化HHL水解反應的等溫滴定量熱曲線

圖6　ITC法依那普利拉對ACE的L-B雙倒數圖

3.5RY-5抑制類型

用初始速率法測定RY-5的抑制類型，根據3.3節的方法計算出S與v，作RY-5濃度分別為0、0.86μmol/L、1.72μmol/L時對ACE的抑制動力學L-B雙倒數圖，如圖7，不同濃度的抑制劑擬合直線相交于橫軸的負半軸，說明RY-5是非競爭性抑制劑。

將ITC法應用于活性多肽抑制類型的判斷，即在ACE與HHL反應體系中加入RY-5，ITC結果見圖8，RY-5實驗組的熱流曲線趨近平緩后與空白組的熱功率差值基本保持不變，說明RY-5的抑制效果與底物濃度無關，這符合非競爭性抑制劑的特點。

按照3.4節的方法處理數據，做出L-B雙倒數圖，見圖9。RY-5與無抑制劑的擬合直線相交于橫軸的負半軸，符合典型的非競爭性抑制劑雙倒數圖特點［13］。計算得到RY-5的抑制常數KI為1.0μmol/L。RY-5的IC50為0.7μmol/L［16］，實驗結果與之接近，且與3.3節中初始速率法得到的抑制劑類型一致，而目前發現的大多數活性多肽類ACE抑制劑均屬于非競爭性抑制劑，說明等溫滴定量熱法能夠用于這類抑制劑類型的判斷，是一種開發ACE抑制劑的新方法。

圖7　初始速率法RY-5對ACE的L-B雙倒數圖

圖8　有/無抑制劑時ACE催化HHL水解反應的等溫滴定量熱曲線

圖9　ITC法RY-5對ACE的L-B雙倒數圖

4　結 論

采用ITC研究血管緊張素轉化酶（ACE）催化其模擬體外底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL）生成馬尿酸與二肽HL的過程，測定不同溫度下的摩爾水解焓ΔHhydr、米氏常數Km與催化常數kcat，同時采用傳統的初始速率法與該方法進行比較。結果表明，這一過程為吸熱過程，ΔHhydr的數值隨溫度升高而增大，等壓熱容cp為0.2126kJ/（mol·K）；Km在測定范圍內隨溫度升高而減小；催化常數kcat在溫度較低時，隨溫度升高而增大，溫度過高會使酶變性從而下降；傳統的初始速率法由于采用平均速率來代替初速率使得相同溫度測得的Km偏大，因此在酶學性質的研究中ITC法明顯優于傳統法。通過底物對酶與依那普利拉的混合溶液進行滴定，從熱量曲線中即可直觀的判斷依那普利拉為競爭性抑制劑，與文獻結果一致，即ITC法可用于ACE抑制劑的開發。經計算得到依那普利拉抑制常數KI值為12.1nmol/L，將這一方法應用于小肽ACE抑制劑Arg-Tyr-Leu -Gly-Tyr（RY-5）的抑制類型測定，結果顯示RY-5為非競爭性抑制劑且與初始速率法測得的結果一致，KI值為1.0μmol/L。實驗結果說明等溫滴定量熱法用于酶及其抑制劑的相關研究較為精確、簡單和快捷。

符 號 說 明

cp—— 等壓比熱容，kJ/（mol·K）

［E］ —— 酶的濃度，mol/L

ΔHhydr—— 摩爾水解焓，J/mol

［I］ —— 抑制劑濃度，mol/L

kcat—— 催化效率，s-1

KI—— 抑制常數，mol/L

Km—— 米氏常數，mol/L

n —— 底物的物質的量

P —— 熱功率，J/s

Q —— 熱量值，J

［S］ —— 底物濃度，mol/L

［S0］ —— 底物初始濃度，mol/L

T —— 熱力學溫度，K

t —— 時間，s

V —— 反應池體積，L

v —— 反應速率，mol/（s·L）

α——表觀系數

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Thermodynamics and kinetics of an enzyme-catalyzed reaction determined by isothermal titration calorimetry

PENG Shang，SUN Lixia，XIONG Zhen'ai，ZHOU Liqin，LAN Xiongdiao，SUN Jianhua，TONG Zhangfa，LIAO Dankui
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of New Technology and Application in Resource Chemical Engineering，Nanning 530004，Guangxi，China）

Thermodynamic and kinetic parameters of angiotensin converting enzyme（ACE）catalyzed hydrolysis of simulating substrate Hippuryl-Histidyl-Leucine（HHL）in vitro were determined by isothermal titration calorimetry（ITC）. The effect of temperature on kinetic parameters was investigated；the results showed that the ACE-catalyzed reaction was endothermic with a small constant pressure specific heat capacity ［cp=0.2126kJ/（mol·K）］. The value of molar hydrolysis enthalpy ΔHhydrwas positive and increased as temperature rose. The reaction mechanism was in accordance with the Michaelis-Menten model in the temperature range （298.15—313.15K）；the effect of temperature on the Michaelis constant（Km）was negative，while catalytic constant（kcat）first increased then decreased with the increase of temperature，reaching the maximum value of 2.534s-1at 308.15K. Initial rate method was also used in order to compare with ITC method. The Kmmeasured by the initial rate method was relatively large because of the limitation in itself. The inhibitory type of the drug enalapril，known as ACE inhibitor，was determined by ITC and enzymatic kinetics analysis. The results show thatthe inhibitor was a competitive inhibitor with inhibition constant KI=12.1nmol/L. The ITC method is applicable for determining the inhibitor type in comparison with literature. It is a new approach for the development of ACE inhibitors. We determined that the active peptides Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr （RY-5）were noncompetitive inhibitors with KIof 1.0μmol/L by using this method..

isothermal titration calorimetry；reaction kinetics；angiotensin converting enzyme；thermodynamic；biocatalysis

O 642.3

A

1000-6613（2016）11-3459-06

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.11.011

2016-04-27；修改稿日期：2016-07-04。

國家自然科學基金面上項目（51372043）、廣西教育廳科研項目（KY2016YB035）、廣西大學博士啟動項目（XBZ160130）及廣西博士后專項資助項目。

彭尚（1988—），男，碩士研究生，從事化學工藝方面的研究。聯系人：廖丹葵，教授，博士生導師。E-mail liaodk@gxu.edu.cn。