烤煙種質資源SSR核心引物的篩選及驗證

馬　冰，代帥帥，程亞增，蔣彩虹，任　民，程立銳，楊愛國

（中國農業科學院煙草研究所，煙草行業煙草基因資源利用重點實驗室，青島 266101）

烤煙種質資源SSR核心引物的篩選及驗證

馬冰，代帥帥，程亞增，蔣彩虹，任民，程立銳，楊愛國*

（中國農業科學院煙草研究所，煙草行業煙草基因資源利用重點實驗室，青島 266101）

為篩選到適合烤煙品種利用的核心引物，準確評價煙草種質資源遺傳多樣性和親緣關系，利用5份遺傳差異明顯的烤煙種質對分布于煙草24條連鎖群上的2317對SSR引物進行初步篩選，篩選出70對引物。再利用20份不同地理來源的烤煙種質對初篩引物進行復篩，最終確定24對核心引物。利用核心引物對20份烤煙種質進行遺傳多樣性分析，共得到85個多態性位點，平均PIC值為0.52，平均等位位點數為3.54。同時對這20份烤煙種質進行聚類分析和主坐標分析，驗證24對核心引物的有效性。結果顯示，兩種研究方法結論一致，與種質親緣關系吻合度較高。表明該SSR核心引物體系準確有效，可以適用于烤煙種質資源鑒定和遺傳多樣性分析。

烤煙；SSR核心引物；遺傳多樣性；聚類分析；主坐標分析

煙草是重要的經濟作物，在全世界120多個國家均有種植。其中我國主栽的是普通煙草種（Nicotiana tabacum L.）的烤煙類型。在長期的烤煙育種過程中，由于集中使用幾個主體親本[1]，從而導致目前煙草品種的遺傳基礎狹窄[2]。研究烤煙品種的遺傳多樣性，分析其親緣關系，對拓寬其種質資源的遺傳基礎，科學、合理地選配親本組合具有重要的理論意義。

利用分子標記分析種質資源遺傳多樣性和親緣關系已經在多種重要作物上廣泛開展[3-4]。普通煙草在植物分類上屬于茄科（Solanaceae）煙草屬（Nicotiana），其基因組大小約4.5 G，在目前已知的茄科植物中基因組較大，并且基因組中70%以上為重復序列[5]。煙草種質資源的遺傳多樣性研究一直落后于其他作物，之前，煙草種質遺傳分析主要采用ISSR和AFLP標記[6-7]，自Bindler等[8]公布了煙草高密度SSR標記遺傳圖譜后，SSR標記被廣泛應用于煙草種質資源遺傳多樣性分析[9]。與其他標記相比，SSR標記多態性高，專一性強[10]，適合多倍體物種的遺傳分析。叢鑫等[11]利用45對SSR引物將78份抗PVY的煙草種質按照遺傳多樣性劃分為3類。陳夏曄等[12]利用34對多態性SSR引物對73份煙草抗黑脛病種質進行遺傳多樣性分析，結果表明其遺傳多樣性較差。陳雅瓊等[13]和張雪廷等[14]利用SSR引物分別對烤煙、白肋煙及晾曬煙品種進行遺傳多樣性分析，證明了國內烤煙遺傳背景狹窄，而晾曬煙品種間遺傳差異性較大。尹國英[15]利用SSR引物對140份煙草種質進行分析，同樣證明了晾曬煙遺傳多樣性豐富的結論。

目前，利用SSR標記進行煙草種質遺傳分析時，如何選擇有代表性的標記是研究者面臨的一個問題。本研究利用煙草育種上常用的5份烤煙種質對已公布的2317對SSR標記進行初步篩選，再利用20份烤煙種質對初篩獲得的引物進行復篩和驗證，以便尋找出適合煙草種質遺傳分析的代表性標記，為煙草種質分析奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為我國烤煙育種過程中常用且表型性狀差異較大的5份煙草種質，包括3份國內種質凈葉黃、小黃金1025、革新3號和2份美國引進種質NC82、Speight G-140。20份不同地理來源的烤煙種質見表1。所有材料均由中國農業科學院煙草研究所國家煙草種質資源中期庫提供。材料均在中國農業科學院煙草研究所試驗基地溫室種植，種植時間為2014年2月至2014年8月。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取 在5片真葉期每份材料隨機選取10株混合取樣，采用CTAB法[16]提取DNA，統一稀釋到50 ng/μL后，-20 ℃保存備用。

1.2.2PCR擴增及電泳檢測 擴增體系為10 μL，含50 ng/μL模板DNA 1 μL、10 mol/L–1dNTPs 0.2 μL、50 ng/μL引物1 μL、5 U Taq Polymerase 0.2 μL、10×buffer 1 μL。使用Gene Amp PCR System 9700進行擴增，反應條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃（根據引物退火溫度調整）退火30 s，72℃ 1 min，共35次循環；72 ℃延伸7 min，12 ℃保存。使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析擴增產物，銀染觀察并記錄數據。所用試劑均購于賽尚科貿（青島）有限公司。

1.2.3核心引物的篩選 利用5份烤煙育種常用種質對已公布的2317對SSR引物進行初步篩選，隨后利用20份不同地理來源的烤煙種質對初篩出來的引物進一步篩選，以穩定性好、條帶清晰、易于統計、多態性信息量（PIC）較高并均勻分布在24條連鎖群上為標準，確定核心引物。引物由六合華大（北京）基因科技有限公司合成。

1.2.4核心引物的驗證 利用軟件NTSYS-pc 2.11[17]，采用類平均法（UPGMA），利用篩選出的SSR核心引物對20份烤煙主要親本進行聚類分析和主坐標（PCoA）分析[18]，驗證核心引物的有效性。

1.2.5數據處理與統計分析 以0、1、9統計SSR引物擴增帶型，在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“9”，并建立相應的數據庫。利用DataFormater軟件[19]將原始數據轉換。利用軟件PowerMarker 3.25進行遺傳多樣性分析[20]。其中Simpson’s多樣性指數也稱位點多態性信息量（PIC），其計算方法為PIC=1-Σ Pi2[21]；基因型多樣性H′= -Σ Pi ln Pi[22]，Pi為第i個等位基因變異出現的頻率。

表1　20份供試煙草種質及其地理來源Table1　Geographical origins of twenty tested germplasms

2　結 果

2.1SSR核心引物的篩選

用5份表型和遺傳差異較大的主要烤煙親本對2317對核心引物進行初步篩選，從中篩選到70對多態性較好、帶型清晰的引物，占引物總數的3.02%。隨后，采用20份不同地理來源的烤煙種質對70對初篩得到的引物進行復篩，最終確定24對SSR核心引物，占復篩引物的34.29%，占總引物的1.04%。

2.2SSR引物的多態性信息

24對SSR標記在20份烤煙種質中共檢測出85個等位變異，平均每個引物等位位點數為3.54。基因型多樣性分析顯示不同引物的變幅為0.19～0.77，平均為0.58；引物多態性信量（PIC）為0.18～0.73，平均為0.52，說明引物總體上鑒別能力尚可。其中引物PT53936的PIC值最高，表明其有極高的鑒別能力，可以將絕大多數材料鑒別出來（表2）。

表2　核心引物在參試種質中的多態性信息Table2　Polymorphism information of core primers in tested germplasms

2.3 核心引物的有效性驗證

2.3.1核心引物聚類分析 根據遺傳相似系數，利用UPGMA方法對20份烤煙種質（編號1～20）進行聚類分析（圖1）。當聚類閥值在0.52時，可將20份種質明顯分為2個類群，一類為美國種質和中國臺灣種質（編號1～10），另一類為中國大陸種質（編號11～20）。第1類群又可分為3個亞群，第1亞群包括Coker319（1）和3份中國臺灣煙種質T.T.8（8）、T.T.9（10）、T.T.10（9），從本研究來看，可初步確定中國臺灣種質與美國種質有較近的親緣關系；第2亞群包括FC8（2）、K326（3）、RG8（6）和Speight G-28（7）4份種質，都是由Hicks直接或間接育成；NC89（4）和NC567（5）為第3類群，2份種質都與NC2326相關，類群劃分符合種質系譜關系。第2類群也可分為3個亞群，第1亞群為單育2號（12）、金星6007（13）、中煙14（17）和中煙15（18）等4份種質，它們都直接或間接來源于地方種質滕縣金星；第2亞群有CF-90-NF（11）和中煙86（19），這兩份種質的遺傳背景中有兩個共同的親本凈葉黃和Speight G-28；第3亞群的凈葉黃（14）、潘圓黃（15）、長脖黃（16）和中煙98（20）4份種質都具有長脖黃的背景。

2.3.2主坐標分析（PCoA） 前兩個主坐標可以解釋的方差貢獻率為46.06%，其中第一個可以解釋的方差貢獻率為34.59%。如圖2所示，20份種質可以明顯的分為2類。第1類群有7份美國種質（1～7）和3份中國臺灣種質（8～10）；第2類群為10份中國大陸種質（11～20）。主坐標分析結果與聚類分析結果相一致，說明該套核心引物適用于烤煙種質的遺傳多樣性分析。

圖1　基于核心引物驗證材料的聚類分析Fig. 1　Cluster dendrogram of the tested accessions based on verification with core primers

圖2　核心引物對驗證材料進行主坐標分析的散點圖Fig. 2　The scatter plot of the principal coordinates analysis on the tested accessions based on verification with core primers

3　討 論

國內外利用SSR標記對煙草種質資源篩選以及驗證工作日趨完善，楊柳等[23]運用102對SSR引物對25份普通煙草種質資源進行了遺傳分析，發現97個等位基因片段，平均的等位基因片段數6.9個，PIC均值0.694，找到14個鑒定性較好的引物。陳雅瓊等[13]利用SSR標記與熒光技術相結合的新方法，通過36對引物對63份烤煙和8份白肋煙進行遺傳分析，進一步證實了國內栽培品種遺傳基礎狹窄，豐富度低的結論[24]。而張雪廷等[14]則通過30對SSR引物對38份晾曬煙進行多樣性分析，平均等位基因數為5.77個，其研究表明晾曬煙有著極好的遺傳豐富性。Fricano等[25]利用49對SSR標記對烤煙、深色曬晾煙、白肋煙等6類312份煙草種質進行了遺傳多樣性分析，結果表明，312份煙草材料相同種質間烤煙和白肋煙差異相對較少，而晾曬煙差異較大。

本研究對Bindler等[8]公布的24條煙草連鎖群的2317對SSR標記進行逐一篩選，最終確定了一套（24對）適合烤煙品種遺傳多樣性和親緣關系分析的核心SSR標記，該組SSR標記具有以下特征和優點：第一，該組引物擴增產物穩定，易于操作，多態性高。利用5份種質對2317對SSR標記進行了統一擴增，最大程度保證了篩選出的SSR標記擴增穩定、條帶清晰單一，操作方便。第二，適合烤煙種質間的遺傳多樣性分析。雖然研究中供試種質遺傳基礎相對狹窄，親緣關系相對簡單，但聚類分析和主坐標分析結果證實，20份供試種質的類群劃分真實反映了供試材料的群體結構、地理來源和親緣關系，說明所選的24對核心引物可以清楚的檢測出供試品種的遺傳多樣性，充分說明了該組引物高效可靠。

Lewis等[26]認為，在烤煙育種過程中集中利用少數親本是導致遺傳多樣性降低的主要原因。因此，在烤煙育種過程中，利用合適的分子標記對種質資源進行遺傳多樣性和親緣關系分析，選擇遺傳差異大的種質作為親本，有助于擴大雙親的遺傳基礎，提高煙草育種的效率。

4　結 論

本研究通過不同來源的煙草種質資源篩選出適合烤煙品種使用的24對核心引物，通過聚類分析和主坐標分析驗證，證明核心引物可以區分煙草品種間的差異，準確評價煙草種質資源遺傳多樣性和親緣關系，也可用于烤煙種質資源篩選、遺傳多樣性分析，烤煙核心種質構建，以及相關育種研究工作。結果中引物PT53936的PIC值較高，是核心引物中鑒定性最好的引物，對煙草種質的篩選有重要的作用。

[1] Moon H S, Nicholson J S, Lewis R S. Use of transferable Nicotiana tabacum L. microsatellite markers for investigating genetic diversity in the genus Nicotiana[J]. Genome, 2008, 51(8): 547-559.

[2] 常愛霞，賈興華，羅成剛，等. 我國主要烤煙品種的親源系譜分析及育種工作建議[J]. 中國煙草科學，2013， 34（1）：1-6.

[3] 趙慶友，張亞東，王才林，等. 30個粳稻品種SSR標記遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學報，2010，11（2）：218-223.

[4] 程春明，楊存義，年海，等. 江西野生大豆遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學報，2011，12（6）：928-933.

[5] Arumuganathan K, Earle E D. Nuclear DNA content of some important plant species[J]. Plant Mol Biol Rep, 1991, 9: 208-218.

[6] 祁建民，梁景霞，陳美霞，等. 應用ISSR與SRAP分析煙草種質資源遺傳多樣性及遺傳演化關系[J]. 作物學報，2012，38（8）：1425-1434.

[7] 李鳳霞，王衛峰，孫玉合，等. 煙草屬植物遺傳多樣性和親緣進化關系的熒光AFLP分析[J]. 中國農業科學，2010，43（12）：2418-2427.

[8] Bindler G, Plieske J, Bakaher N, et al. A high density genetic map of tobacco (Nicotiana tabacum L.) obtained from large scale microsatellite marker development[J]. Theor Appl Genet, 2011, 123(2): 219-230.

[9] 葉蘭欽，辛明明，杜金昆，等. SSR標記應用于煙草品種遺傳多樣性研究[J]. 中國農學通報，2009（1）：56-62.

[10] 尹國英，楊小燕，何其波，等. 鑒定煙草種質資源SSR核心引物篩選和驗證[J]. 植物遺傳資源學報，2013，15（5）：960-965.

[11] 叢鑫，劉艷華，戴培剛，等. 抗PVY煙草種質的遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學報，2014，15（3）：679-684.

[12] 陳夏曄，劉艷華，張興偉，等. 抗黑脛病煙草種質的遺傳多樣性分析[J]. 中國農學通報，2014，30（7）：58-63.

[13] 陳雅瓊，王衛峰，丁安明，等. 基于SSR熒光標記分析我國主要審（認）定烤煙及白肋煙品種遺傳多樣性[J]. 中國煙草學報，2013（2）：98-105.

[14] 張雪廷，童治軍，焦芳嬋，等. 38份晾曬煙種質資源遺傳關系的SSR分析[J]. 植物遺傳資源學報，2013（4）：653-658，678.

[15] 尹國英. 煙草種質資源遺傳多樣性和應用潛力分析以及核心SSR引物篩選[D]. 重慶：西南大學，2013.

[16] Bindler G, van der Hoeven R, Gunduz I, et al. A microsatellite marker based linkage map of tobacco[J]. Theor Appl Genet, 2007, 114: 341-349.

[17] Rohlf F J. NTSYS-pc version 2.2 Numerical taxonomy and multivariate analysis system[M]. New York: Exeter Software, 2000.

[18] Sneath P H A, Sokal R R. Numerical taxonomy[M]. San Francisco: Freeman, 1973.

[19] 樊文強，蓋紅梅，孫鑫，等. SSR數據格式轉換軟件Data Formater[J]. 分子植物育種，2016（1）：265-270.

[20] Liu K, Muse S V. PowerMarker: An integrated analysis environment for genetic marker analysis[J]. Bioinformatics, 2005, 21: 2128-2129.

[21] Elston R C. Polymorphism information content. Encyclopedia of Biostatistics[M]. New York: John Wiley and Sons, 2005.

[22] 潘兆娥，孫君靈，王西文，等. 基于棉花參比種質的SSR多態性核心引物篩選[J]. 生物多樣性，2008，16（6）：555-561.

[23] 楊柳，汪斌，童治軍，等. 25份普通煙草種質資源遺傳多樣性的SSR標記分析[J]. 福建農林大學學報：自然科學版，2013（2）：171-175.

[24] 肖炳光，楊本超. 利用ISSR標記分析煙草種質的遺傳多樣性[J]. 中國農業科學，2007（10）：2153-2161.

[25] Fricano A N, Bakaher M, Del Corvo P, et al. Molecular diversity, population structure, and linkage disequilibrium in a worldwide collection of tobacco (Nicotiana tabacum L.) germplasm[J]. BMC Genet, 2012, 13: 18.

[26] Lewis R S, Nicholson J S. Aspects of the evolution of Nicotiana tabacum L. and the status of the United States Nicotiana germplasm collection[J]. Genet Resour Crop Ev, 2007, 54: 727-740.

Screen and Identification of SSR Core Primers for Flue-cured Tobacco Germplasm

MA Bing, DAI Shuaishuai, CHENG Yazeng, JIANG Caihong, REN Min, CHENG Lirui, YANG Aiguo*
(Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tobacco Gene Resources, Qingdao 266101, China)

The purpose of our study is screening out suitable SSR core primers which can accurately evaluate germplasm genetic diversity and genetic relationship of flue-cured tobacco. In this study, 2317 pairs of SSR primers distributed in 24 chromosomes were initially screened on 5 flue-cured tobacco cultivars with distant genetic relationship, and 70 pairs of primers were screened out. Then 20 flue-cured tobacco cultivars with different geographical origins were chosen to screen the initial selected primers. Finally, a total of 24 pairs of SSR core primers were identified. The genetic diversity of 20 flue-cured tobacco cultivars was nalyzed using these core markers. As a result, 85 polymorphism bands were acquired. The average PIC (Polymorphism information content) value is 0.52 and the mean number of alleles detected for each locus was 3.54. These 20 tobacco cultivars were conducted on both genetic diversity analysis and PCoA (Principal Coordinate Analysis) to demonstrate the effectiveness of this 24 core primers. These two methods exhibited similar phylogenesis among the tested cultivars and the results of molecular clustering largely agreed with the pedigree relationship. The results showed that the core primers were effective and accurate, and could be applied to flue-cured germplasm identification and genetic diversity study in tobacco.

flue-cured tobacco; SSR core primers; genetic diversity; cluster analysis; PCoA

S572.03

1007-5119（2016）05-0001-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.05.001

中國煙草總公司煙草基因組計劃重大專項“煙草抗CMV和赤星病連鎖分子標記開發及NC82、K326品種抗性改良”（110201301009）、“煙草重要性狀基因發掘及功能標記開發”（110201301008）；中國煙草總公司重點科技項目“煙草抗主要病毒病（TMV、CMV、PVY）基礎材料創制及育種利用”（110201402006）

馬 冰（1992-），男，在讀碩士。研究方向：煙草遺傳育種。E-mail：jiuzhongma@163.com。*通信作者，E-mail：yangaiguo@caas.cn

2016-03-15

2016-05-22