光敏化姜黃素的細胞毒理學檢驗

武 娟，劉一鳴，李 夏，王靜鳳,*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.山東省青島市第二中學，山東 青島 266061）

光敏化姜黃素的細胞毒理學檢驗

武 娟1，劉一鳴2，李 夏2，王靜鳳1,*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.山東省青島市第二中學，山東 青島 266061）

探究基于小鼠成纖維L929細胞的光敏化姜黃素的細胞毒理學。采用倒置顯微鏡觀察細胞形態；四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測L929細胞的相對增殖率，按通用標準評價細胞毒性；DNA片段化分析及Hoechst細胞核染色法檢測細胞凋亡狀況。結果表明：經不同濃度的光敏化姜黃素（5、10、20 μmol/L）處理后，L929細胞生長良好，呈梭形或不規則形狀，與對照組相比均無明顯差異；毒性級別為“0”或“1”，即無細胞毒性；在瓊脂糖凝膠電泳圖上未見“階梯狀”的條帶出現，細胞核染色后也呈現正常的藍色，即光敏化姜黃素不會引起L929細胞凋亡，對L929細胞沒有毒性。

光敏化姜黃素；細胞毒性；四甲基偶氮唑藍實驗；細胞凋亡

姜黃素是從姜科姜黃屬（Curcuma longa）植物姜黃、莪術、郁金等的根莖中提取的一種天然黃色酸性酚類物質，是姜黃發揮藥理作用的最主要的活性成分[1-3]。根據GB 2760—2011《食品添加劑使用標準》的規定，姜黃素是允許在食品中使用的9 種天然色素之一。近年來的研究發現，姜黃素是一種新型光敏劑[4-5]，其成本低、無污染、具有光活性，能夠起到殺菌和治療腫瘤的功效[6-7]。相關文獻報道發光二極管（light-emitting diode，LED）藍色光源波長為470 nm，可以激活姜黃素而發揮其光敏活性[8-9]。為了將該技術在日常生活中推廣應用，需要對光敏化姜黃素進行毒理學研究。

已有研究報道單純的姜黃素經大鼠和小鼠急性毒性實驗確認屬于實際無毒物質，未見潛在的致突變、致微核及致畸作用，無明顯亞慢性毒性損害作用[10-11]。但是光敏化姜黃素是否無毒需要進一步驗證。近年來，細胞培養技術被廣泛應用于毒理學研究，而整體動物的中毒表現都繼發于機體細胞中出現的改變，所以直接觀察受試物對細胞的作用應看作是對其毒理學本質的研究[12]。雖然離體培養細胞沒有完整機體所存在的神經-體液調節作用的影響，但卻有利于準確控制其外環境的理化因素，能夠在穩定的條件下觀察離體培養細胞對化學物質毒性作用的反應，可以在其他體外毒性評價實驗系統和整體動物系統之間起到填補差距的橋梁作用[12]。小鼠成纖維細胞L929細胞系是研究細胞毒理學的常用細胞系[13-17]。在此基礎上，本實驗將光敏化姜黃素作用于L929細胞系，初步評價其細胞毒理學，為探究光敏化姜黃素的食用安全性以及姜黃素介導的光動力非熱力殺菌技術在日常生活中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃素（食品級添加劑） 陜西慈緣生物技術有限公司；小鼠成纖維細胞L929細胞系由中國海洋大學海洋生命學院贈予。

DMEM高糖培養基、新生牛血清 美國HyClone公司；青霉素-硫酸鏈霉素雙抗混合液（100×） 江蘇恩莫阿賽生物技術有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine]ethanesulfonic acid，HEPES）緩沖液 德國Sigma公司；DNA Marker DL2000 日本TaKaRa生物工程有限公司；組織/細胞基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒 碧云天生物技術研究所；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）袋裝預混試劑 北京康為世紀生物科技有限公司；二甲基亞砜 上海偉進生物科技有限公司；瓊脂糖 美國Lonza Rockland公司；6 孔細胞培養板、96 孔細胞培養板 美國Corning公司；細胞培養基除菌過濾器 美國Millipore公司；其他生化試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；Milli-Q超純水系統 美國Millipore公司；Fluo ViewTM FV1000顯微鏡日本Olympus公司；細胞培養箱 美國NuAire公司；Tanon凝膠成像系統 上海天能科技有限公司；DYY-6B型穩壓穩流電泳儀 北京市六一儀器廠；激光共聚焦顯微鏡 中國科學院青島生物能源與過程研究所；LED新型光源系統（470 nm的藍色光源，光功率密度60 mW/cm2）香港中文大學中醫學院。

1.3 方法

1.3.1 L929細胞培養

本實驗選用細胞為小鼠成纖維細胞L929細胞系，用含10%新生牛血清的DMEM細胞培養基在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養并消化傳代。

1.3.2 光敏化姜黃素的樣品制備

將姜黃素樣品分成實驗組和對照組，實驗組為光敏化姜黃素實驗組（添加LED光照的姜黃素，L＋S＋組），對照組包括單純LED光照組（添加LED光照的溶劑，L＋S－組）、單純姜黃素處理組（添加不光照的姜黃素，L－S＋組）和空白對照組（不加姜黃素，不光照，L－S－組）。其中L＋S＋組的光敏化姜黃素設置為5、10、20 μmol/L 3 個濃度組[18]。姜黃素由食品級乙醇溶解，儲備液濃度為20 mmol/L。用基礎培養基稀釋后，于波長為470 nm的LED藍色光源下（光功率密度60 mW/cm2）光照1 min，即光能量密度為3.6 J/cm2。光動力處理之后，0.22 μm無菌濾膜過濾，待用。

1.3.3 樣品與細胞共培養

L929細胞復蘇傳代后，于對數生長期用0.25%胰酶消化后吹散，作細胞計數，用含10%新生牛血清的DMEM高糖培養基調整細胞濃度至0.2×105個/mL[19]。用微量移液器以100 μL/孔置于96 孔板中復種6 孔，L－S－組只加含10%新生牛血清的DMEM培養基，在5% CO2、37 ℃標準環境下貼壁生長24 h。添加光敏化姜黃素繼續培養細胞24、48、72、96 h，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3.4 四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）實驗及毒性評分

分別于24、48、72、96 h后各取出一塊培養板，吸棄細胞上清液，每孔加200 μL MTT溶液（MTT溶于DMEM（1∶8，m/V）），繼續培養4 h。棄上清液，每孔加入150 μL酸化異丙醇溶液，充分溶解細胞沉淀，用酶標儀在570 nm波長處測定吸光度。按照公式（1）計算L929細胞的相對增殖率（relative growth rate，RGR）[19]。

根據計算所得RGR值按表1所示的評分標準定出光敏化姜黃素的毒性級別。0 級和1 級被認為沒有細胞毒性，2 級為具有輕度細胞毒性或結合細胞形態綜合評價，3 級和4 級為具有中度細胞毒性，5 級為具有明顯的細胞毒性，3～5 級為不合格材料。

表1 細胞毒性評分標準Table1 Cytotoxicity grades and corresponding relative growth rates

1.3.5 細胞DNA的提取及片段化分析[20]

以光敏化姜黃素處理L929細胞，培養96 h后收集細胞，按照組織/細胞基因組DNA提取試劑盒提取DNA。提取出的DNA用含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠在100 V電泳1 h，紫外燈下拍照。

1.3.6 Hoechst細胞核染色

取潔凈蓋玻片在70%乙醇中浸泡5 min，用無菌的PBS洗滌3 遍，再用細胞培養液洗滌1 遍。將蓋玻片置于6 孔板內，L929細胞復蘇傳代后，于對數生長期用0.25%胰酶消化后吹散，作細胞計數，用含10%新生牛血清的DMEM高塘培養基調整細胞濃度至0.2×105個/mL[19]。以2 mL/孔置于6 孔板中復種6 孔，在5% CO2、37 ℃標準環境下貼壁生長24 h。以光敏化姜黃素處理L929細胞，培養96 h后吸盡培養液，加入0.5 mL固定液固定10 min。去固定液，用PBS于搖床上洗兩遍，每次3 min。吸盡液體，加入0.5 mL Hoechst染色液，于搖床上染色5 min。去染色液，用PBS于搖床上洗兩遍，每次3 min。吸盡液體，將貼有細胞的蓋玻片用鑷子夾出，于熒光顯微鏡下觀察拍照，激發波長350 nm左右，發射波長460 nm左右。凋亡的細胞經染色后，在熒光顯微鏡下觀察，細胞核呈致密濃染或碎塊狀致密濃染，顏色有些發白，而正常細胞的細胞核呈正常的藍色。每個樣品隨機計數4 個視野，按照公式（2）計算細胞凋亡率。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 光敏化姜黃素對L929細胞形態的影響

以不同濃度（5、10、20 μmol/L）的光敏化姜黃素處理L929細胞，經過24、48、72、96 h孵育之后，于倒置顯微鏡下觀察細胞的形態變化。由圖1可知，在不同濃度的光敏化姜黃素處理下，L929細胞生長良好，呈梭形或不規則形狀，與3 個對照組相比均無明顯差異。參照形態分析標準，初步證實濃度低于20 μmol/L的光敏化姜黃素是沒有細胞毒性的。

圖1 倒置顯微鏡下L929細胞的形態觀察（×1100）Fig.1 Morphology of L929 cells under inverted microscope (× 10)

2.2 光敏化姜黃素對L929細胞增殖的影響及毒性評分

20 μmol/L以下的光敏化姜黃素對L929細胞形態沒有顯著影響，進而以5、10、20 μmol/L光敏化姜黃素處理L929細胞一段時間（24、48、72、96 h）之后，評價其對L929細胞相對增殖率的影響及毒性評分。

圖2 MTT檢測光敏化姜黃素對L929細胞增殖率的影響Fig.2 Effect of photoactivated curcumin on L929 cell proliferation rate by MTT detection

由圖2可知，經MTT實驗檢測發現，L＋S＋組的A570nm與3 個對照組相比均沒有顯著差異（孵育相同時間組內相比）；由表2可知，L929細胞的相對增殖率雖有所降低，但與3 個對照組相比均無顯著差異，均屬RGR分級標準的“0”級或“1”級，再次證實了低于20 μmol/L的光敏化姜黃素無細胞毒性。

表2 L929細胞的相對增殖率及姜黃素毒性評分Table2 Relative growth rates of L929 cells and corresponding toxicity scoorreess

2.3 光敏化姜黃素對L929細胞凋亡的影響

細胞凋亡時，細胞核內的內切核酸酶被活化，將DNA鏈在核小體連接區域切斷，形成若干（180～200 bp）n寡聚核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈現階梯狀圖譜，這被作為判斷細胞凋亡是否發生的客觀依據之一[20]。如圖3所示，以不同濃度（5、10、20 μmol/L）的光敏化姜黃素處理L929細胞96 h之后，沒有發現DNA的典型梯狀條帶出現，以上結果提示濃度低于20 μmol/L的光敏化姜黃素不會引起L929細胞凋亡。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳分析L929細胞DNA片段化Fig.3 DNA fragmentation analysis of L929 cells by agarose gel electrophoresis

Hoechst細胞核染料是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低。它是一種特異性DNA染料，在活細胞中DNA聚A-T序列富集區域的小溝處與DNA結合。當細胞發生凋亡時，染色質會固縮。細胞經染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細胞的細胞核呈正常的藍色，而凋亡細胞的細胞核或細胞質內可見致密濃染的顆粒塊狀熒光[21-22]。如圖4所示，以不同濃度（5、10、20 μmol/L）的光敏化姜黃素作用L929細胞96 h之后，經細胞核染色發現光敏化姜黃素實驗組的細胞核染色狀況與3 個對照組相比沒有明顯的變化。每個樣品隨機計數4 個視野的細胞凋亡率，統計結果如圖5所示，空白對照組的細胞在培養96 h后存在一定凋亡，不同濃度的光敏化姜黃素實驗組的細胞凋亡率與空白對照組相比沒有顯著差異，再次驗證了濃度低于20 μmol/L的光敏化姜黃素不會引起L929細胞凋亡。

圖4 激光共聚焦顯微鏡觀察L929細胞核染色Fig.4 L929 nuclear staining observed under CLSM

圖5 L929細胞凋亡率Fig.5 Apoptotic rate of L929 cells

3 討 論

大量研究表明，姜黃素具有廣譜的生理以及藥理作用，具有較強的抗炎、抗氧化和抗癌效應，而且對正常細胞的殺傷作用不敏感。由于姜黃素具有抗癌譜廣、毒副作用小的優點，已成為目前抗癌藥物的研究熱點。

近年來，人們發現光敏化姜黃素能更加有效地殺滅惡性腫瘤細胞。例如，曾霞波等[8]研究證實，光敏化姜黃素能有效殺傷和抑制人乳腺癌MCF-7細胞的生長。王杜娟等[23]證實光敏化姜黃素可顯著誘導人肝癌HepG2細胞凋亡。田斌強等[24]研究表明，姜黃素能明顯抑制膀胱癌細胞系UMUC2的生長并誘導其凋亡。近些年，研究者們又逐漸將光敏化姜黃素應用于殺滅致病性微生物[25-27]。本課題組前期的研究證實，濃度為5、10、20 μmol/L的光敏化姜黃素對食品中的微生物有較好的滅活效果[28]。為了將光敏化姜黃素在日常生活中推廣應用，需驗證其具有食用安全性。然而，迄今為止，光敏化姜黃素的毒理學評價尚未見報道。

細胞毒理學是研究外源性物質對細胞損傷作用規律及其機制的毒理學分支學科，它可以用于食品安全毒理學的評價、食品中有害物質的毒作用機理研究、食品加工生產中有毒有害物質的檢測、功能性食品中功效成分的活性研究等[29-30]。細胞毒理學的研究方法有多種，包括對細胞的活 性影響和遺傳學影響、造成細胞形態學變化以及細胞凋亡檢測。目前在食品領域應用較廣泛的細胞毒理學方法有MTT比色實驗、細胞DNA合成測定法、Western blotting法、流式細胞術測定法等[29]。Pi oletti等[31]認為，當受試物與細胞共培養時，一旦受試物有毒，細胞的增殖情況和形態就 會發生改變。本研究結果表明，以濃度為5、10、20 μmol/L的光敏化姜黃素孵育L92 9細胞一段時間后，細胞生長狀態良好，與對照組相比無明顯差異，即光敏化姜黃素無細胞毒性。上述結果將為開展光敏化姜黃素在食品、餐具和桌面等消毒中的應用提供了依據。但本研究只是對光敏化姜黃素的細胞毒性進行了初探，其食用安全性尚有待于通過開展動物及人體毒理學實驗進一步驗證。

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Cytotoxicological Test of Photoactivated Curcumin

WU Juan1, LIU Yiming2, LI Xia2, WANG Jingfeng1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Qingdao No.2 Middle School of Shandong Province, Qingdao 266061, China)

The main purpose of this research was to explore the cytotoxicity of photoactivated curcumin based on fibroblast cell line L929. The cell morphology was examined by an inverted microscope, relative growth rate (RGR, %) was detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method, cytotoxicity was evaluated according to the general standard, and cell apoptosis was detected by DNA ladder analysis and Hoechst nuclear staining, respectively. Results showed that photoactivated curcumin did not affect cell morphology, which was fusiform or irregular in shape and had no significant difference when compared with the control group. It had no cytotoxicity with the toxicity grade “0” or “1”, and did not cause apoptosis according to DNA ladder analysis and Hoechst nuclear staining. This study confirmed that photoactivated curcumin had no toxicity to L929 cells at the concentrations of 5, 10 and 20 μmol/L. These results will lay a foundation for exploring the safety of consumption of photoactivated curcumin and provide the theory basis for the popularization and application of curcumin-mediated photodynamic non-thermal sterilization technology in daily life.

photoactivated curcumin; cytotoxicity; methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay; apoptosis

10.7506/spkx1002-6630-201603037

TS201.6

A

1002-6630（2016）03-0205-06

武娟, 劉一鳴, 李夏, 等. 光敏化姜黃素的細胞毒理學檢驗[J]. 食品科學, 2016, 37(3): 205-210. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603037. http://www.spkx.net.cn

WU Juan, LIU Yiming, LI Xia, et al. Cytotoxicological test of photoactivated curcumin[J]. Food Science, 2016, 37(3): 205-210. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603037. http://www.spkx.net.cn

2015-04-24

海洋公益性行業科研專項（201105029）

武娟（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與營養。E-mail：932837429@qq.com

*通信作者：王靜鳳（1964—），女，教授，博士，研究方向為海洋食品功效成分的分子營養學。E-mail：jfwang@ouc.edu.cn