冷藏海鱸魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的篩選和鑒定

唐文靜，王楚文，柳云龍，寧喜斌*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

冷藏海鱸魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的篩選和鑒定

唐文靜，王楚文，柳云龍，寧喜斌*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

分離鑒定4 ℃冷藏條件下海鱸魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，通過(guò)選擇性培養(yǎng)基篩選獲得單一菌株，對(duì)各菌株進(jìn)行致腐能力的測(cè)定，確定冷藏海鱸魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。對(duì)冷藏海 鱸魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐 敗菌進(jìn)行菌落形態(tài)觀察及部分生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rDNA分子鑒定。結(jié)果表明，有4 株冷藏海鱸魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌，其中1 株為草莓假單胞菌（Pseu domonas fragi），1 株為腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens），其余2 株為假單胞菌（Pseudomonas sp.）。在4 ℃冷藏條件下，草莓假單胞菌的致腐能力最強(qiáng)，其次是腐敗希瓦氏菌和假單胞菌。

海鱸魚(yú)；冷藏；優(yōu)勢(shì)腐敗菌；分離；鑒定

魚(yú)類(lèi)在棲息、捕撈、貯運(yùn)、加工等過(guò)程中受到微生物的污染，腐敗微生物在魚(yú)體上生長(zhǎng)繁殖是引起魚(yú)肉腐敗變質(zhì)的主要原因，魚(yú)類(lèi)的貨架期受此影響而大大縮短[1]。為了抑制腐敗微生物的活動(dòng)，目前應(yīng)用較為廣泛的保鮮方法是冷藏。但是，魚(yú)類(lèi)在冷藏過(guò)程中依然深受優(yōu)勢(shì)腐敗菌（specifi c spoilage organism，SSO）的影響，魚(yú)體上SSO的生長(zhǎng)繁殖主導(dǎo)著魚(yú)肉腐敗變質(zhì)的程度[2]。因此，對(duì)冷藏魚(yú)肉中SSO的確定，并進(jìn)行靶向抑制對(duì)研究魚(yú)肉保鮮顯得尤為重要[3]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)類(lèi)的棲息環(huán)境和貯運(yùn)條件影響著魚(yú)體上SSO的組成和變化，在有氧冷藏條件下貯藏的鮮魚(yú)SSO主要為希瓦氏菌（Shewanella）和（或）假單胞菌（Pseudomonas spp.）[4]。

海鱸魚(yú)是我國(guó)沿海地區(qū)均產(chǎn)的一種重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)[5]，不僅肉質(zhì)細(xì)膩鮮美、少有魚(yú)骨，且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[6]。隨著海鱸魚(yú)產(chǎn)量的逐年提升，依靠活魚(yú)銷(xiāo)售的方式已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)市場(chǎng)的需求，因此海鱸魚(yú)在保鮮方面的研究顯得尤為重要，然而目前相關(guān)研究還尚少[7]，對(duì)冷藏海鱸魚(yú)中SSO的研究也鮮有報(bào)道。魚(yú)類(lèi)SSO的篩選及鑒定的傳統(tǒng)方法是使用各種選擇性培養(yǎng)基篩選和生理生化實(shí)驗(yàn)的鑒定，隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，研究人員開(kāi)始使用分子檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)鑒定魚(yú)類(lèi)的SSO。Lan Weiqing等[8]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCRDGGE）檢測(cè)了在4 ℃有氧包裝條件下帶魚(yú)的SSO；Macé等[9]利用時(shí)間溫度梯度凝膠電泳（temporal temperature gradient gel electrophesis，TTGE）檢測(cè)了在不同溫度條件下使用氣調(diào)包裝大馬哈魚(yú)的SSO；Wilson等[10]使用了PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）檢測(cè)了鱈魚(yú)在不同季節(jié)不同水域里的SSO。

本研究通過(guò)使用選擇性培養(yǎng)基和測(cè)定菌株的致腐能力確定冷藏海鱸魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，利用菌落形態(tài)觀察及部分生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rDNA分子鑒定對(duì)冷藏海鱸魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)可為冷藏海鱸魚(yú)的腐敗機(jī)理、抑制冷藏海鱸魚(yú)的腐敗、冷藏海鱸魚(yú)的保鮮研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

海鱸魚(yú)（0.6～0.8 kg/尾），購(gòu)于上海銅川路水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)。

假單胞菌選擇性CFC瓊脂培養(yǎng)基、鐵瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫膽鹽葡萄糖中性紅瓊脂（VRBGA）培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基 山東青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑與儀器

營(yíng)養(yǎng)肉湯、MgO、硼酸、鹽酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

Kjeltec2300 凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落的分離和純化

將鮮活海鱸魚(yú)冰猝致死，放置于4 ℃條件下冷藏至腐敗，于無(wú)菌條件下稱(chēng)取25.0 g腐敗魚(yú)肉充分研磨，加入225 mL無(wú)菌生理鹽水中搖勻制成樣品菌懸液，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)x取適宜的稀釋度吸取0.1 mL于各選擇性培養(yǎng)基平板上均勻涂布，假單胞菌選擇性CFC瓊脂培養(yǎng)基平板、鐵瓊脂培養(yǎng)基平板和VRBGA培養(yǎng)基平板分別置于30、28、37 ℃條件下培養(yǎng)，MRS瓊脂培養(yǎng)基平板置于37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)，均培養(yǎng)24～48 h。挑選各典型菌落，反復(fù)進(jìn)行平板劃線，得到純化的單菌落后保存。

1.3.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的篩選

對(duì)各菌株進(jìn)行致腐能力的測(cè)定以確定冷藏海鱸魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，致腐能力的測(cè)定由感官評(píng)定和揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量的測(cè)定組成。

將保存的各菌株活化后分別制成菌懸液，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)涂平板確定菌濃度，調(diào)整菌濃度為105～106CFU/mL。將無(wú)菌海鱸魚(yú)塊浸入各菌株的菌懸液中10 s后取出，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，于4 ℃條件下冷藏，分別在0、2、4、6、8 d后進(jìn)行感官評(píng)定，確定疑似優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

將疑似優(yōu)勢(shì)腐敗菌活化后分別制成菌懸液，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)涂平板確定菌濃度，調(diào)整菌濃度為105～106CFU/mL。將無(wú)菌海鱸魚(yú)塊浸入各疑似優(yōu)勢(shì)腐敗菌株的菌懸液中10 s，取出置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，放于4 ℃條件下冷藏，在0、2、4、6、8 d時(shí)測(cè)定TVB-N含量，確定優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

1.3.3 無(wú)菌魚(yú)塊的制備

海鱸魚(yú)去鱗、去內(nèi)臟、清凈后，于無(wú)菌條件下，用無(wú)菌水沖洗，用75%酒精擦拭魚(yú)體，用無(wú)菌解剖刀切取背脊部?jī)?nèi)部無(wú)污染魚(yú)肉，保持魚(yú)塊大小厚度基本一致，每塊無(wú)菌魚(yú)塊為5 g左右[11-12]。

1.3.4 感官評(píng)定

選擇5 名經(jīng)培訓(xùn)的感官評(píng)定員，對(duì)魚(yú)塊的外觀和氣味進(jìn)行評(píng)價(jià)，感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[13-14]。

表1 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table1 Sensory analysis standards

1.3.5 TVB-N含量的測(cè)定

使用Kjeltec2300凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定，方法參考FOSS應(yīng)用子報(bào)[15]。以40 g/L硼酸為吸收液，0.1 mol/L鹽酸滴定，精確稱(chēng)取5 g左右碾碎樣品于到750 mL的蒸餾管中，加入1 g MgO和少許去離子水，連接到定氮儀進(jìn)行測(cè)定[16]。

1.3.6 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的形態(tài)特征和生理生化特征鑒定

對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的單菌落進(jìn)行形態(tài)特征觀察和生理生化特征鑒定。生理生化實(shí)驗(yàn)根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[17]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]選擇鑒定項(xiàng)目。具體生理生化實(shí)驗(yàn)方法參照《現(xiàn)代細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)基和生化試驗(yàn)手冊(cè)》[19]。

1.3.7 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分子生物學(xué)鑒定

將各優(yōu)勢(shì)腐敗菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，使用E z u p柱式基因組D N A抽提試劑盒提取各菌株的總DNA，作為16S rDNA序列擴(kuò)增反應(yīng)模板。PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA基因，PCR體系為引物27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、1492r（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）和模板各1 μL，2×Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，完成30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取5 μL 16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。使用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中的BLAST對(duì)各菌株序列分析比對(duì)，選取同源性在99%以上的菌株序列，利用MEGA 6.05軟件進(jìn)行多重序列對(duì)比，并構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[20-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離

樣品 通過(guò)稀釋涂布平板和平板劃線分離方法，在假單胞菌選擇性CFC瓊脂培養(yǎng)基平板上依據(jù)菌落形態(tài)不同分離出5 株菌，編號(hào)為P1～P5，鐵瓊脂培養(yǎng)基平板上依據(jù)菌落形態(tài)不同分離出1 株菌，編號(hào)為S1，結(jié)晶紫膽鹽葡萄糖中性紅瓊脂培養(yǎng)基平板上依據(jù)菌落形態(tài)不同分離出菌落形態(tài)各異的2 株菌，編號(hào)為V1、V2，MRS瓊脂培養(yǎng)基平板上依據(jù)菌落形態(tài)不同分離出菌落形態(tài)各異的2 株菌，編號(hào)為L(zhǎng)1、L2。

2.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的腐敗特性

將上述10 株菌活化后制成菌懸液分別接種到無(wú)菌海鱸魚(yú)塊上，研究冷藏時(shí)間對(duì)接種各菌株的海鱸魚(yú)塊感官評(píng)定的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)組的感官評(píng)定分值均比對(duì)照組低，其中接種菌株P(guān)2、P3、P4、S1魚(yú)塊的感官評(píng)分均極顯著（P＜0.01）低于接種其他6 株菌的魚(yú)塊。冷藏第4天時(shí)，接種菌株P(guān)2、P3、P4和S1的魚(yú)塊的感官 評(píng)分均極顯著（P＜0.01）下降；冷藏第8天時(shí)，接種菌株P(guān)2、P3、P4和S1的魚(yú)塊的感官評(píng)分均極顯著（P＜0.01）低于其他接種菌株的魚(yú)塊，接種菌株P(guān)4的魚(yú)塊的感官評(píng)分最低，為0.72 分，其次是接種菌株S1的魚(yú)塊，為0.76 分。經(jīng)對(duì)比分析，確定菌株P(guān)2、P3、P4、S1為冷藏海鱸魚(yú)的疑似優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

圖1 冷藏時(shí)間對(duì)接種各菌株的海鱸魚(yú)塊感官評(píng)定的影響Fig.1 Effect of refrigeration time on sensory analysis of sea bass piece inoculated with various bacteria

將冷藏海鱸魚(yú)疑似優(yōu)勢(shì)腐敗菌P2、P3、P4、S1制成菌懸液接種于無(wú)菌海鱸魚(yú)塊上，研究冷藏時(shí)間對(duì)接種疑似優(yōu)勢(shì)腐敗菌的海鱸魚(yú)塊TVB-N含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。根據(jù)GB/T 18108—2008《鮮海水魚(yú)》[22]規(guī)定，鮮海水魚(yú)的TVB-N含量≤15 mg N/100 g為一級(jí)品，TVB-N含量≤20 mg N/100 g為二級(jí)品，TVB-N含量≤30 mg N/ 100 g為三級(jí)品。

圖2 冷藏時(shí)間對(duì)接種疑似優(yōu)勢(shì)腐敗菌的海鱸魚(yú)塊TVB-N含量的影響Fig.2 Effect of refrigeration time on TVB-N value of sea bass piece inoculated with suspected dominant spoilage bacteria

由圖2可知，冷藏第4天時(shí)，接種菌株P(guān)2、P3、P4、S1魚(yú)塊的TVB-N含量極顯著（P＜0.01）大于對(duì)照魚(yú)塊，分別為68.81、21.61、95.35、76.52 mg N/100 g；冷藏第6天時(shí)，接種菌株P(guān)3魚(yú)塊的TVB-N含量迅速上升，為121.19 mg N/100 g；冷藏第8天時(shí)，接種菌株P(guān)2、P3、P4、S1魚(yú)塊的TVB-N含量極顯著（P＜0.01）高于對(duì)照魚(yú)塊，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，且接種菌株P(guān)4魚(yú)塊的TVB-N含量最高，其次是接種菌株S1、P3、P2的魚(yú)塊。經(jīng)對(duì)比分析，確定菌株P(guān)2、P3、P4、S1為冷藏海鱸魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

2.3 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的鑒定

2.3.1 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的形態(tài)特征及生理生化鑒定觀察冷藏海鱸魚(yú)的4 株優(yōu)勢(shì)腐敗菌的形態(tài)特征，并進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[17]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]判定結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 冷藏海鱸魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌的形態(tài)特征及生理生化特征Table2 Morphological and physiological characteristics of dominant spoilage bacteria in chilled sea bass

2.3.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分子鑒定

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)4 株冷藏海鱸魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，均得到特異性條帶，片段大小為1 500 bp左右，電泳圖譜如圖3所示。

圖3 4 株冷藏海鱸魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的16S rDNA電泳圖譜Fig.3 Electropherogram of 16S rDNA genes from four dominant spoilage bacteria in chilled sea bass

將冷藏海鱸魚(yú)的4 株優(yōu)勢(shì)腐敗菌未純化16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物送檢測(cè)序后，使用NCBI的BLAST分析，選取同源性在99%以上的菌株序列，利用MEGA 6.05軟件進(jìn)行多重序列對(duì)比、構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖4。菌株P(guān)2、P3與Pseudomonas sp.親緣關(guān)系最近，菌株P(guān)4與Pseudomonas fragi親緣關(guān)系最近，菌株S1與Shewanella sp.親緣關(guān)系最近。

圖4 基于16S rDNA序列同源性的4 株優(yōu)勢(shì)腐敗細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of four dominant spoilage bacteria based on 16S rDNA sequences

結(jié)合4 株優(yōu)勢(shì)腐敗菌的菌落形態(tài)及部分生理生化實(shí)驗(yàn)和分子鑒定，可判定菌株P(guān)2、P3、P4為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），其中菌株P(guān)4為草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi），菌株S1為腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）。故4 株優(yōu)勢(shì)腐敗菌分別為Pseudomonas P2、Pseudomonas P3、Pseudomonas fragi P4、Shewanella putrefaciens S1。

3 結(jié)論與討論

本研究得出冷藏海鱸魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌主要為假單胞菌和腐敗希瓦氏菌，與其他相關(guān)研究結(jié)果相似。藍(lán)蔚青等[23]對(duì)冷藏鯧魚(yú)貯藏期間的細(xì)菌種群變化進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌與腐敗希瓦氏菌為鯧魚(yú)冷藏期間的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。崔正翠等[24]研究了冷藏大菱鲆細(xì)菌組成變化和優(yōu)勢(shì)腐敗菌，結(jié)果表明在0～10 ℃冷藏過(guò)程中大菱鲆的優(yōu)勢(shì)腐敗菌是腐敗希瓦氏菌，其次是假單胞菌。郭全友等[25]對(duì)冷藏羅非魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行了鑒定，確定了假單胞菌為0～10 ℃貯藏羅非魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。本課題組將對(duì)冷藏海鱸魚(yú)分離出的優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行深入研究，探索各優(yōu)勢(shì)腐敗菌的特征及抑制生長(zhǎng)方法，為冷藏海鱸魚(yú)的保鮮作參考。

本研究從腐敗冷藏海鱸魚(yú)肉中獲得10 株形態(tài)各異的菌株，經(jīng)過(guò)菌株致腐能力測(cè)定確定菌株P(guān)2、P3、P4、S1為冷藏海鱸魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。在4 ℃冷藏條件下，優(yōu)勢(shì)腐敗菌P4的致腐能力最強(qiáng)，其次是優(yōu)勢(shì)腐敗菌S1、P3，優(yōu)勢(shì)腐敗菌P2的致腐能力最弱。對(duì)冷藏海鱸魚(yú)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌P2、P3、P4、S1進(jìn)行16S rDNA分子鑒定、菌落形態(tài)觀察及部分生理生化實(shí)驗(yàn)鑒別，得到4 株優(yōu)勢(shì)腐敗菌，分別為2 株假單胞菌、1 株草莓假單胞菌和1 株腐敗希瓦氏菌。

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Isolation and Identification of Specific Spoilage Organisms in Chilled Sea Bass

TANG Wenjing, WANG Chuwen, LIU Yunlong, NING Xibin*
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing and Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 20 1306, China)

The specifi c spoilage organisms (SSOs) were isolated and identifi ed from chilled sea bass under 4 ℃ refrigerated condition. These SSOs were individually isolated using selective medium and their spoilage ability was analyzed. These isolates were identifi ed based on morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analyses. The results showed there were 4 SSOs present in chilled sea bass, including one Pseudomonas fragi, one Shewanella putrefaciens, and two Pseudomonas sp.. In refrigerated condition at 4 ℃, the spoilage ability of Pseudomonas fragi was the highest, followed by Shewanella putrefaciens and Pseudomonas sp..

sea bass; chilled; specifi c spoilage organism; isolation; identifi cation

10.7506/spkx1002-6630-201603031

TS254.4

A

1002-6630（2016）03-0170-05

唐文靜, 王楚文, 柳云龍, 等. 冷藏海鱸魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的篩選和鑒定[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 170-174. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603031. http://www.spkx.net.cn

TANG Wenjing, WANG Chuwen, LIU Yunlong, et al. Isolation and identification of specific spoilage organisms in chilled sea bass[J]. Food Science, 2016, 37(3): 170-174. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603031. http://www.spkx.net.cn

2015-03-11

上海市科委工程中心建設(shè)項(xiàng)目（11DZ2280300）

唐文靜（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩-mail：wenjing_24@163.com

*通信作者：寧喜斌（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩⑹称钒踩-mail：xbning@shou.edu.cn