高光譜圖像對(duì)灰葡萄孢霉、匍枝根霉、炭疽菌的生長(zhǎng)擬合及區(qū)分

孫 曄，顧欣哲，王振杰，胡鵬程，屠 康，潘磊慶*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

高光譜圖像對(duì)灰葡萄孢霉、匍枝根霉、炭疽菌的生長(zhǎng)擬合及區(qū)分

孫 曄，顧欣哲，王振杰，胡鵬程，屠 康，潘磊慶*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

利用高光譜成像系統(tǒng)獲取真菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂板上培養(yǎng)期間的高光譜圖像，采用400～1 000 nm全波段光譜響應(yīng)值，并計(jì)算全波段的平均值、波峰7 16 nm處的光譜值和全波段內(nèi)光譜值第1主成分的得分值，利用這3 種參數(shù)計(jì)算方法構(gòu)建真菌生長(zhǎng)模擬模型。結(jié)果表明，3 種方法建立的模型測(cè)試集的決定系數(shù)（R2）為0.722 3～0.991 4，均方誤差和均方根誤差分別為2.03×10－4～5.34×10－3、0.011～0.756。建立的生長(zhǎng)模型與傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)法建立的生長(zhǎng)模型之間的相關(guān)系數(shù)為0.887～0.957。另外，主成分分析和偏最小二乘法判別分析可以區(qū)分3 種不同菌種。其中，偏最小二乘法判別分析模型對(duì) 培養(yǎng)36 h的3 種真菌及對(duì)照組的區(qū)分準(zhǔn)確率為97.5%。 高光譜圖像技術(shù)能夠用來(lái)對(duì)真菌生長(zhǎng)進(jìn)行模擬和真菌的種類(lèi)區(qū)分。

腐敗真菌；高光譜圖像；生長(zhǎng)擬合；偏最小二乘法判別分析；區(qū)分

在水果的采后運(yùn)輸及貯藏過(guò)程中由腐敗真菌引起的腐爛會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且會(huì)危害消費(fèi)者的健康。由真菌引起的采后病害主要有：灰霉病、根霉病、炭疽病等。灰葡萄孢霉能損傷花和果實(shí)，在病害處長(zhǎng)出一層灰色菌斑，在個(gè)別果實(shí)發(fā)病后，會(huì)導(dǎo)致周?chē)暾麑?shí)發(fā)病[1-2]。匍枝根霉能在空氣、土壤和各種工具的表面存活，并極易感染受損傷的水果[3]，然后在水果上生長(zhǎng)成熟，并產(chǎn)生子囊孢子和孢子感染周?chē)恼ＫＬ烤揖鷷?huì)在病果表面形成棕色同心圓[4]。為了減少經(jīng)濟(jì)損失，提高水果的質(zhì)量和安全，水果中腐敗真菌的生長(zhǎng)檢測(cè)尤為重要。

目前，已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了與食品安全相關(guān)的微生物統(tǒng)計(jì)模型。預(yù)測(cè)微生物學(xué)一般涉及數(shù)學(xué)、微生物學(xué)及化學(xué)工程學(xué)等相關(guān)學(xué)科，用以開(kāi)發(fā)出相關(guān)數(shù)學(xué)模型來(lái)預(yù)測(cè)特定環(huán)境下的微生物生長(zhǎng)[5]。微生物的生長(zhǎng)模型描述了微生物數(shù)量與生長(zhǎng)時(shí)間之間的數(shù)學(xué)公式或數(shù)學(xué)函數(shù)[6]。在特定的培養(yǎng)條件下，傳統(tǒng)的微生物初級(jí)模型主要描述微生物的總活菌數(shù)、毒數(shù)、代謝物等與生長(zhǎng)時(shí)間的關(guān)系，微生物的二級(jí)模型主要解決微生物的延滯期長(zhǎng)短、最大生長(zhǎng)速率等微生物生長(zhǎng)信息[7-8]。上述傳統(tǒng)的微生物建模技術(shù)需要檢測(cè)微生物總活菌數(shù)、毒素、代謝物等，檢測(cè)步驟繁瑣、耗時(shí)耗力，而且需要破壞樣本，因此亟需開(kāi)發(fā)一種快速無(wú)損的方法，為腐敗真菌的監(jiān)測(cè)和控制提供支持。高光譜圖像是新一代光電檢測(cè)技術(shù)，集成了光譜檢測(cè)和圖像檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，具有超多波段、光譜高分辨率和圖譜合一的特點(diǎn)，可以獲得系列波長(zhǎng)下的光譜和圖像信息[9-10]。目前已有少量研究利用光譜學(xué)等非破壞性技術(shù)實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快速的方法來(lái)檢測(cè)真菌和毒素污染的谷物[11]。微生物生長(zhǎng)過(guò)程中的顏色、形狀、培養(yǎng)基的化學(xué)成分等都會(huì)影響光譜吸收，因此，能通過(guò)光學(xué)技術(shù)檢測(cè)微生物生長(zhǎng)。Delwiche等[12]利用高光譜圖像技術(shù)檢測(cè)被污染的小麥，通過(guò)選取近紅外波長(zhǎng)處的兩個(gè)波段用來(lái)分離被鏈格孢霉污染的小麥粒。Gómez-Sanchis等[13]研究發(fā)現(xiàn)高光譜圖像技術(shù)能夠檢測(cè)由青霉引起的柑橘類(lèi)的損傷點(diǎn)。del Fiore等[11]利用高 光譜圖像技術(shù)檢測(cè)玉米黃曲霉毒素的早期污染。綜上所述，高光譜圖像技術(shù)能夠用于微生物的檢測(cè)。

目前，還沒(méi)有關(guān)于利用高光譜圖像技術(shù)模擬真菌生長(zhǎng)及類(lèi)型區(qū)分的報(bào)道。本研究選取了3種典型的果蔬采后腐敗真菌作為研究對(duì)象，即灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、炭疽菌（Colletotrichum acutatum），以期利用高光譜圖像建立3 種腐敗真菌的較佳生長(zhǎng)模型，并且利用光譜響應(yīng)構(gòu)建真菌類(lèi)型區(qū)分的模型。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、炭疽菌（Colletotrichum acutatum）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，組分為馬鈴薯浸粉5 g、葡萄糖20 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g、氯霉素0.1 g，水1 000 mL，pH 5.8～6.2。每個(gè)培養(yǎng)皿含有的培養(yǎng)基體積為（20±2） mL，培養(yǎng)基厚度為（2.5±0.5） mm。

將保藏的3 種菌分別接種到PDA培養(yǎng)基上，在28 ℃、75%相對(duì)濕度條件下活化7 d，重新接種進(jìn)行二次培養(yǎng)。1 周后，對(duì)二次培養(yǎng)的菌種用無(wú)菌水反復(fù)沖洗，制成菌懸浮液，將一滴菌液滴到血球計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)，進(jìn)行換算得出菌液濃度，并稀釋至濃度為4×104CFU/mL的菌懸液，然后進(jìn)行樣本制備。

1.2 儀器與設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)采用高光譜圖像系統(tǒng)裝置，包括ImSpector V10E型成像光譜儀 芬蘭Specim公司；Bobcat ICL-1620型CCD攝像機(jī)、EKE-ER型功率可調(diào)鹵鎢燈（0～150 W）、移動(dòng)平臺(tái)、圖像采集軟件 臺(tái)灣五鈴光學(xué)股份有限公司。

1.3 樣本制備與分組

共制備660 個(gè)培養(yǎng)基，對(duì)照組設(shè)150 個(gè)培養(yǎng)基樣本（CK）；匍枝根霉（R. stolonifer）、炭疽菌（C. cutatum）組各150 個(gè)；灰葡萄孢霉組（B. cinerea）210 個(gè)。其中，匍枝根霉和炭疽菌各培養(yǎng)48 h，而灰葡萄孢霉生長(zhǎng)較為緩慢，為得到其完整的菌落生長(zhǎng)曲線圖，培養(yǎng)時(shí)間為72 h。培養(yǎng)過(guò)程中，各組每12 h（0、12、24、36、48、60、72 h）取出30 個(gè)培養(yǎng)基樣本進(jìn)行高光譜檢測(cè)和菌落數(shù)計(jì)算。

1.4 高光譜圖像采集

高光譜圖像檢測(cè)系統(tǒng)采用反射模式獲取各組真菌培養(yǎng)基高光譜圖像。為避免外界光線對(duì)光譜采集的影響，檢測(cè)裝置整體置于暗箱中，背景為黑色，不反光[14-15]。高光譜成像單元包括一個(gè)CCD攝像機(jī)，一個(gè)成像光譜儀（分辨率2.8 nm），有效波長(zhǎng)范圍為400～1 000 nm。實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：相機(jī)鏡頭和線光源距離樣本分別為30 cm和20.5 cm，光照強(qiáng)度為67.5 W，以45 °對(duì)準(zhǔn)樣本，曝光時(shí)間為4 ms、輸送速率為2.5 mm/s。

將培養(yǎng)基放置于移動(dòng)平臺(tái)上，運(yùn)行高光譜圖像系統(tǒng)采集樣本的高光譜圖像信息，分別采集到的是400～1 000 nm之間共420 個(gè)波長(zhǎng)處的圖像。當(dāng)次檢測(cè)完后，將用過(guò)的樣本丟棄。實(shí)驗(yàn)中共獲得660 個(gè)樣本的高光譜圖像數(shù)據(jù)。由于相機(jī)暗電流的存在和外界因素的影響，圖像含有一定噪聲，需要對(duì)獲得的高光譜圖像進(jìn)行校正。用黑色不透明的鏡頭蓋蓋在相機(jī)鏡頭上可以全黑的反射圖像，采集聚四氟乙烯白板（反射率99%）得到白色反射圖像[16-17]。根據(jù)如下公式計(jì)算出校正后的相對(duì)圖像Rc。校正后的圖像被用來(lái)提取光譜信息，選擇有效的波段，建立最佳的擬合模型和區(qū)分真菌的不同生長(zhǎng)階段。高光譜圖像校正公式為：

式中：R0為原始高光譜透射圖像；D為用黑色不透明的鏡頭蓋蓋在相機(jī)鏡頭上得到的全黑的標(biāo)定圖像；W為用聚四氟乙烯白板（反射率99%）得到的全白標(biāo)定圖像；Rc為標(biāo)定后高光譜透射圖像。

1.4 菌落計(jì)數(shù)

高光譜圖像采集后，立即對(duì)每個(gè)平板參照GB 4789.15—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 酵母和霉菌計(jì)數(shù)》方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[18]，取平均值。1.5 數(shù)據(jù)處理

將獲取的高光譜圖像信息利用ENVI 4.8系統(tǒng)軟件、MATLAB7.1統(tǒng)計(jì)工具箱和SPSS 18.0軟件處理，用于高光譜圖像對(duì)3 種真菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)及3 種菌的區(qū)分。

ENVI（The Environment for Visualizing Images）是由遙感領(lǐng)域的科學(xué)家開(kāi)發(fā)的一套功能強(qiáng)大的、完整的遙感圖像處理軟件。如今憑借其各種各樣的影像處理和信息提取工具，ENVI已經(jīng)是高光譜圖像處理的必備軟件，其中的波譜分析工具能夠快速準(zhǔn)確地從高光譜影像中提取各種目標(biāo)信息[19-20]。利用ENVI軟件，選擇培養(yǎng)基中菌落生長(zhǎng)的地方大小約1 000 個(gè)像素點(diǎn)的區(qū)域做感興趣區(qū)域；在早期階段，菌落沒(méi)有長(zhǎng)出時(shí)選取培養(yǎng)基中間部分。計(jì)算高光譜圖像ROI區(qū)域平均光譜值。光譜波段范圍為400～1 000 nm，共有420 個(gè)波段。實(shí)驗(yàn)中采用3 種方法提取高光譜圖像特征信息，方法Ⅰ為全波段400～1 000 nm光譜響應(yīng)的平均值；方法Ⅱ?yàn)椴ǚ逄幍墓庾V值；方法Ⅲ為400～1 000 nm波段內(nèi)光譜值第1主成分的得分值。

將每種菌各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的30 個(gè)樣本隨機(jī)選取20 個(gè)作為訓(xùn)練集，取平均值進(jìn)行建模擬合，剩下10 個(gè)作為測(cè)試集。通過(guò)MATLAB7.1軟件建立腐敗真菌隨光譜值變化的生長(zhǎng)曲線[21-22]并利用Gompertz模型[23-24]以擬合3 種菌的生長(zhǎng)。通過(guò)模型的決定系數(shù)（R2）、均方誤差（sum of the squared errors，SSE）及均方根誤差（root mean square error，RMSE）來(lái)評(píng)判模型的擬合性能。高光譜參數(shù)建立的生長(zhǎng)模型與傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)法建立的生長(zhǎng)模型之間的相關(guān)系數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)模型準(zhǔn)確性。

由于高光譜圖像數(shù)據(jù)包含了大量的冗余信息，因此可以利用主成分分析（principal compenent analysis，PCA）將數(shù)據(jù)降維，以消除重疊信息。PCA將方差的大小作為衡量信息量多少的標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為方差越大提供的信息越多，反之提供的信息就越少。其基本思想是通過(guò)線形變換保留方差大、含信息多的分量，丟掉信息量少的方向，從而降低數(shù)據(jù)的維數(shù)。在光譜的判別分析中，偏最小二乘判別分析法（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）是常用的一種方法，PLS-DA法是基于PLS回歸的一種判別分析方法，在構(gòu)造因素時(shí)考慮到了輔助矩陣以代碼形式提供的類(lèi)成員信息[25]。本實(shí)驗(yàn)中，利用PCA的結(jié)果來(lái)區(qū)分不同真菌，PLS-DA建立判別模型，區(qū)分3 種真菌及對(duì)照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)階段腐敗真菌的高光譜圖像

圖1 不同菌種的高光譜圖像Fig.1 Typical reflectance hyperspectral images of different fungi

圖1是高光譜圖像技術(shù)采集的不同真菌RGB圖像，其中R為662 nm波長(zhǎng)處圖像，G為554.5 nm波長(zhǎng)處圖像，B為450 nm波長(zhǎng)處圖像。可以看出匍枝根霉生長(zhǎng)最快，在第24小時(shí)菌絲已遍布平板，在第36小時(shí)平板上已完全長(zhǎng)滿菌絲。灰葡萄孢霉生長(zhǎng)最慢，到36 h才能用肉眼觀察到菌絲。炭疽菌的菌落呈現(xiàn)光滑圓形，到24 h才能用肉眼觀察到菌落。3 種真菌在檢測(cè)期間菌絲呈現(xiàn)白色，屬于生長(zhǎng)早期，在生長(zhǎng)中后期，不同菌種會(huì)產(chǎn)生各自的特征顏色。

2.2 不同真菌的光譜特征

圖2 不同菌種的光譜特征Fig.2 Average original spectra of fungi

圖2為灰葡萄孢霉、炭疽菌、匍枝根霉在不同培養(yǎng)時(shí)間的典型反射光譜圖。在400～1 000 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，3 種菌的光譜值隨時(shí)間的延長(zhǎng)都是呈上升趨勢(shì)，最大反射光譜值出現(xiàn)在波長(zhǎng)為716 nm處的波峰。由于3 種真菌在生長(zhǎng)早期菌絲呈現(xiàn)白色，隨著時(shí)間的推移，白色菌絲更明顯，對(duì)光的反射也就更大，光譜值隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。如圖2A所示，灰葡萄孢霉的光譜響應(yīng)值從48～60 h有一個(gè)較大的升高，這是由于菌落在此階段達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)迅速。同樣，炭疽菌（圖2B）及匍枝根霉（圖2C）分別在24～36、12～24 h迅速升高。由此可看出光譜值的變化反映了真菌的生長(zhǎng)狀態(tài)。

2.3 真菌生長(zhǎng)模型的擬合

2.3.1 基于菌落計(jì)數(shù)法對(duì)3 種真菌生長(zhǎng)模型的擬合

圖3 傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)法建立的生長(zhǎng)模型Fig.3 Growth curve of colony-forming unit versus culture time

由圖3A可知，通過(guò)國(guó)標(biāo)法檢測(cè)得到的灰葡萄孢霉7 個(gè)生長(zhǎng)階段的菌落數(shù)分別為：4.0×104、9.0×104、2.5×105、1.5×106、1.3×107、3.0×107、4.0×107CFU/mL；炭疽菌的菌落數(shù)分別為：4×104、5×105、3.5×107、8×108、1.5×109CFU/mL（圖3B）；匍枝根霉的菌落數(shù)分別為：4×104、4.5×106、9.5×107、3.3×108、7×108CFU/mL（圖3C）。3 個(gè)模型擬合的決定系數(shù)分別為：0.997 5、0.999 5、0.984 1，SSE分別為：2.268×10－2、8.62 ×10－3、0.191 1，RMSE分別為：0.106 5、0.061 2、0.288 2，由此可知模型與數(shù)據(jù)擬合較好。

2.3.2 高光譜圖像特征參數(shù)對(duì)3 種真菌生長(zhǎng)模型的擬合利用1.5節(jié)所述的3 種方法處理的高光譜圖像數(shù)據(jù)，將得到的3 種參數(shù)分別對(duì)3 種真菌建立生長(zhǎng)模型，所得生長(zhǎng)模型如圖4所示，模型相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1。

圖4 高光譜參數(shù)建立的生長(zhǎng)模型Fig.4 Growth curves of fungi established by Matlab

圖4ⅠA、4ⅡA、4ⅢA是灰葡萄孢霉的生長(zhǎng)擬合曲線及方程。圖4ⅠA是利用全波段光譜響應(yīng)平均值（方法Ⅰ）得到的擬合方程及生長(zhǎng)曲線，訓(xùn)練集與測(cè)試集R2、SSE、RMSE分別為0.995 9、0.99×10－4、0.007和0.722 3、53.40×10－4、0.023。圖4ⅡA是由716 nm波長(zhǎng)處的波峰光譜值（方法Ⅱ）建立生長(zhǎng)曲線及擬合方程，訓(xùn)練集的R2高達(dá)0.994 8，SSE、RMSE分別為3.79×10－4、0.011。測(cè)試集R2、SSE、RMSE分別為0.791 0、3.34×10－4、0.057。方法Ⅲ將400～1 000 nm波長(zhǎng)范圍的光譜響應(yīng)值進(jìn)行主成分分析，得到的前3 個(gè)主成分貢獻(xiàn)率分別為90.2%、6.9%、0.9%，選取主成分1（PC1）建模，各時(shí)間點(diǎn)得到的PC1得分為：－0.789、－0.598、－0.372、0.123、1.692、2.701、3.003，得到的擬合模型如圖4ⅢA所示，訓(xùn)練集的R2、SSE、RMSE分別為0.997 9、3.3 4×1 0－2、0.1 0 6，測(cè)試集分別為0.7 8 9 7、4.65×10－4、0.254。由表1中3 個(gè)模型測(cè)試組的R2及SSE可知，模型擬合效果均一般，其中方法Ⅱ利用波峰光譜值建模測(cè)試集的R2最高（R2＝0.791 0），因此方法Ⅱ模擬效果最好。3 種高光譜參數(shù)建立的生長(zhǎng)模型與傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)法建立的生長(zhǎng)模型之間的相關(guān)系數(shù)分別為：0.898、0.941、0.932，相關(guān)性均高于0.89，說(shuō)明以高光譜參數(shù)建立的生長(zhǎng)模型具有較高的準(zhǔn)確性，其中以方法Ⅱ建模的相關(guān)性最高。

圖4ⅠB、4ⅡB、4ⅢB是炭疽菌的生長(zhǎng)擬合曲線及方程。方法Ⅰ利用5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)全波段的光譜平均值建立了生長(zhǎng)模型，訓(xùn)練集與測(cè)試集的參數(shù)R2、SSE、RMSE分別為0.990 3、1.67×10－4、0.025和0.936 7、8.77×10－4、0.756。方法Ⅱ選取716 nm波長(zhǎng)處的波峰光譜值建模，訓(xùn)練集的R2高達(dá)0.993 9，SSE、RMSE為1.48×10－4、0.014，模型擬合效果好，測(cè)試組的R2、SSE、RMSE分別為0.936 8、7.74×10－4、0.044，由此可知該模型能較好地模擬炭疽菌的生長(zhǎng)。方法Ⅲ將400～1 000 nm處的光譜響應(yīng)值進(jìn)行主成分分析，得到的前3 個(gè)主成分貢獻(xiàn)率分別為97.8%、1.1%、0.4%，選取PC1建模，各時(shí)間點(diǎn)得到的PC1得分為：－0.877、－0.856、－0.602、0.569、1.207，得到的擬合模型如圖4ⅢB所示，訓(xùn)練集的R2、SSE、RMSE分別為0.981 3、6.82×10－2、0.261，測(cè)試集分別為0.868 7、1.48×10－3、0.504。如表1所示，炭疽菌3 種模型測(cè)試組的R2及SSE可知，模型擬合效果均較好，其中方法Ⅱ利用波峰光譜值建模的測(cè)試集R2最大（R2＝0.936 8），SSE及RMSE最小，說(shuō)明利用波峰建模模擬效果最好。另外，3 種高光譜參數(shù)建立的生長(zhǎng)模型與傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)法建立的生長(zhǎng)模型之間的相關(guān)系數(shù)分別為：0.899、0.900、0.887，方法Ⅱ的相關(guān)系數(shù)為3 種方法中最大，說(shuō)明方法Ⅱ利用波峰光譜值建模具有較高的準(zhǔn)確性。

圖4ⅠC、4ⅡC、4ⅢC是匍枝根霉的生長(zhǎng)擬合曲線及方程。圖4ⅠC是利用全波段光譜響應(yīng)平均值（方法Ⅰ）得到匍枝根霉的擬合方程及生長(zhǎng)曲線，訓(xùn)練集與測(cè)試集的R2、SSE、RMSE分別為0.999 6、1.23×10－4、0.013和0.981 5、3.76×10－4、0.019。圖4ⅡC是選取716 nm波長(zhǎng)處的波峰光譜值（方法Ⅱ）建立的生長(zhǎng)曲線及擬合方程，訓(xùn)練集的R2高達(dá)0.996 0，SSE、RMSE分別為2.48×10－4和0.016，測(cè)試集的R2、SSE、RMSE為0.991 4、2.03×10－4、0.011。方法Ⅲ將400～1 000 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光譜響應(yīng)值進(jìn)行主成分分析，得到的前3 個(gè)主成分貢獻(xiàn)率分別為99.7%、0.2%、0.05%，選取PC1建模，各時(shí)間點(diǎn)得到的PC1得分為：－1.406、－0.979、0.476、0.894、0.989。得到的擬合模型如圖4ⅢC所示，訓(xùn)練集的R2、SSE、RMSE分別為0.999 6、1.82×10－3、0.043，測(cè)試集分別為0.990 6、3.32×10－4、0.129。由表1可知，匍枝根霉3 個(gè)模型測(cè)試組的R2均在0.98以上，SSE及RMSE都較小，可知模型擬合效果很好，其中方法Ⅱ利用波峰建模得到的測(cè)試集R2最大（R2＝0.991 4），SSE和RMSE最小（SSE＝2.03×10－4，RMSE＝0.011），可知方法Ⅱ模擬效果最好。3 種高光譜參數(shù)建立的生長(zhǎng)模型與傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)法建立的生長(zhǎng)模型之間的相關(guān)系數(shù)分別為：0.954、0.957、0.955，3 種方法的相關(guān)性均高于0.95，說(shuō)明以高光譜參數(shù)建立的生長(zhǎng)模型具有很高的準(zhǔn)確性，其中以方法Ⅱ波峰建模的相關(guān)性最高。

表1 灰葡萄孢霉、炭疽菌、匍枝根霉生長(zhǎng)模型模擬結(jié)果Table1 Results of exponential models for the growth of B. cineerreeaa,, C. acutatum

2.3.3 3 種建模方法比較

圖4所示的基于高光譜圖像特征參數(shù)對(duì)3 種真菌的生長(zhǎng)擬合曲線均呈現(xiàn)“S”型，與圖3所示的基于菌落計(jì)數(shù)法對(duì)3 種真菌的生長(zhǎng)擬合模型基本相似，都包含了延滯期、指數(shù)期和穩(wěn)定期。由表1可知，擬合模型的訓(xùn)練集和測(cè)試集的R2分別為0.981 3～0.999 6和0.722 3～0.991 4，SSE和RMSE均接近于0，由此可知模型對(duì)數(shù)據(jù)的擬合較好，其中方法Ⅱ的R2最大，SSE、RMSE最小。對(duì)比高光譜參數(shù)建立的生長(zhǎng)模型與傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)法建立的生長(zhǎng)模型之間的相關(guān)系數(shù)，可知方法Ⅱ與傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)法相關(guān)性更高，建立的生長(zhǎng)模型更可靠。另外，方法Ⅱ選取波峰光譜值相對(duì)于其他兩種方法更易獲取，因此選取波峰建立生長(zhǎng)模型更為合理。

2.4 3 種真菌高光譜響應(yīng)值主成分分析

圖5 基于不同菌種高光譜全波段響應(yīng)值的主成分分析Fig.5 PCA for different fungi at the same culture times

在全波段范圍內(nèi)，由于光的色散現(xiàn)象導(dǎo)致真菌的光譜值隨菌落的生長(zhǎng)而增大，光的色散隨著菌絲的生長(zhǎng)而產(chǎn)生，不同菌絲間色散程度會(huì)存在差異[26-27]，因此通過(guò)光學(xué)方法可以區(qū)分不同菌種。如圖5所示，對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的全波段（400～1 000 nm）光譜值進(jìn)行PCA分析，以區(qū)分不同菌種和對(duì)照組。結(jié)果顯示，匍枝根霉與其他3 組區(qū)分最為顯著，這是因?yàn)橘橹Ω股L(zhǎng)最快，與其他組區(qū)分最明顯。灰葡萄孢霉和炭疽菌僅能在36 h區(qū)分開(kāi)，這是由于兩種菌生長(zhǎng)速率緩慢，并且表面顏色相近。灰葡萄孢霉和炭疽菌在12 h（圖5A）、24 h（圖5B）、48 h（圖5D）相互重疊，而4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組在36 h區(qū)分最為明顯（圖5C），因此可以利用光譜響應(yīng)值來(lái)區(qū)分培養(yǎng)36 h的3 種菌及對(duì)照組。

2.5 PLS-DA區(qū)分不同菌種

根據(jù)PCA分析的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選取培養(yǎng)36 h的菌種加以建模區(qū)分，PLS-DA模型區(qū)分結(jié)果如表2所示。灰葡萄孢霉、炭疽菌、匍枝根霉和對(duì)照組測(cè)試集的區(qū)分準(zhǔn)確率分別為100%、100%、100%和90%，對(duì)照組與3 種菌之間的平均區(qū)分準(zhǔn)確率達(dá)97.5%。上述結(jié)果與2.4節(jié)中PCA結(jié)果一致。匍枝根霉訓(xùn)練集與測(cè)試集區(qū)分準(zhǔn)確率最高，這是由于匍枝根霉生長(zhǎng)速率明顯高于其他幾組，與其他幾組區(qū)分明顯。上述結(jié)果表明，高光譜圖像技術(shù)能夠區(qū)分3 種不同真菌。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，可以找出區(qū)分3 種真菌的特征波長(zhǎng)以獲得更高的區(qū)分準(zhǔn)確率；進(jìn)一步利用高光譜參數(shù)建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌種生長(zhǎng)模型庫(kù)，未知菌種通過(guò)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)模型得以區(qū)分鑒定。

表2 PLS-DA模型區(qū)分培養(yǎng)36 h菌落的判別結(jié)果Table2 PLS-DA models for fungi cultured for 36 h

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)一種新的方法模擬果蔬上幾種常見(jiàn)腐敗真菌（如灰葡萄孢霉、炭疽菌和匍枝根霉）的生長(zhǎng)模型，并加以區(qū)分。結(jié)果顯示，利用高光譜參數(shù)建立的生長(zhǎng)模型測(cè)試組的R2范圍為0.722 3～0.991 4，與傳統(tǒng)菌落計(jì)數(shù)法建立的生長(zhǎng)模型的相關(guān)系數(shù)范圍為0.887～0.957。另外，利用高光譜反射光譜的全波段信息做PCA分析能區(qū)分不同菌種，而PLS-DA模型對(duì)培養(yǎng)36 h的3 種菌的區(qū)分準(zhǔn)確率達(dá)100%。上述結(jié)果表明高光譜圖像技術(shù)能夠作為模擬微生物生長(zhǎng)及區(qū)分不同菌種的一項(xiàng)技術(shù)。

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Growth Simulation and Discrimination of Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer and Colletotrichum acutatum by Using Hyperspectral Reflectance Imaging Technique

SUN Ye, GU Xinzhe, WANG Zhenjie, HU Pengcheng, TU Kang, PAN Leiqing*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

This study used a hyperspectral imaging system (HIS) to measure the spectral response of fungi inoculated on potato dextrose agar plates. In this work, three methods for calculating HIS parameters, including the mean of whole spectral response values covering the range of 400–1 000 nm, the spectral response value of the wave peak at 716 nm, and the score of the firs t principal component in the whole spectral range of 400–1 000 nm using principal component analysis (PCA), were used to simulate the growth of fungi. The results showed that the coefficients of determination (R2) of the simulation models for test datasets of three fungi, Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer and Colletotrichum acutatum, were 0.722 3–0.991 4, and the sum square error (SSE) and root mean square error (RMSE) were in a range of 2.03 × 10-4–5.34 × 10-3and 0.011–0.756, respectively, based on the three methods. The correlation coefficients between HIS parameters and colony forming units of fungi were high ranging from 0.887 to 0.957. In addition, fungal species can be discriminated by PCA and partial least squares-discrimination analysis (PLS-DA) based on the spectral information in the full wavelength range. The classification accuracy of the test dataset by PLS-DA models for fungi cultured for 36 h was 97.5% among Botrytis cinerea,Rhizopus stolonifer, Colletotrichum acutatum, and the control. This paper offers a new technique and useful information for further study into modeling the growth of fungi and detecting fruit spoilage caused by fungi based on HIS.

spoilage fungi; hyperspectral imaging; growth simulation; partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA); discrimination

10.7506/spkx1002-6630-201603026

TS201.3

A

1002-6630（2016）03-0137-08

孫曄, 顧欣哲, 王振杰, 等. 高光譜圖像對(duì)灰葡萄孢霉、匍枝根霉、炭疽菌的生長(zhǎng)擬合及區(qū)分[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 137-144. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603026. http://www.spkx.net.cn

SUN Ye, GU Xinzhe, WANG Zhenjie, et al. Growth simulation and discrimination of Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer and Colletotrichum acutatum by using hyperspectral reflectance imaging technique[J]. Food Science, 2016, 37(3): 137-144. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603026. http://www.spkx.net.cn

2015-03-24

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201313002-01）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD19B03）

孫曄（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品無(wú)損檢測(cè)。E-mail：2013108067@njau.edu.cn

*通信作者：潘磊慶（1980—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品無(wú)損檢測(cè)。E-mail：pan_leiqing@njau.edu.cn