花生過敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表達

詹少德，邱昌將，朱 盼，吳志華,*，陳紅兵

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，中德聯合研究院，江西 南昌 330047；2.浙江紡織服裝職業技術學院，浙江 寧波 315200；3.廣東省疾病 預防控制中心，廣東 廣州 510300）

花生過敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表達

詹少德1，邱昌將2，朱 盼3，吳志華1,*，陳紅兵1

（1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，中德聯合研究院，江西 南昌 330047；2.浙江紡織服裝職業技術學院，浙江 寧波 315200；3.廣東省疾病 預防控制中心，廣東 廣州 510300）

本實驗首先從花生中提取總RNA，利用反轉錄聚合酶鏈式反應技術克隆了花生過敏原蛋白Ara h 6全cDNA，并以此為模板擴增出Ara h 6目的基因。將目的基因與pMD19-T Simple質粒進行重組后轉入BL21（DE3）宿主表達菌中，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導產物表達，并利用鎳離子親和層析純化表達產物。DNA測序結果顯示Ara h 6基因片段全長為438 bp，編碼145 個氨基酸，與已知該蛋白DNA序列 97%相同；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果顯示表達產物分子質量為24 kD，與融合組氨酸標簽的重組Ara h 6蛋白理論分子質量相符；質譜鑒定結果表明重組蛋白的一級結構與天然Ara h 6匹配度為100%；Western blotting結果顯示融合蛋白能夠為抗Ara h 6多克隆抗體所識別，具有免疫原性。

花生；過敏原；Ara h 6；基因克隆表達；質譜鑒定

食物過敏是人體對某些食物產生的變態反應，可導致多種臨床病癥，嚴重的會引起過敏性休克甚至死亡等[1-2]。據相關的流行病學研究表明，食物過敏影響約5%兒童及3%～4%成年人的健康，且呈增長趨勢[3]。90%食物過敏反應是由花生、魚、貝類、奶、蛋、大豆、堅果和小麥等八類高致敏性食物引起[4]。

花生作為食物配料的應用十分廣泛，其研究也一直都受到國內外的廣泛關注。目前已發現的花生13 種過敏蛋白中[5]，Ara h 6屬于2S白蛋白家族，約占花生蛋白總含量的4.5%[5]，其分子質量約為14.5 kD，生物信息學研究發現Ara h 6與花生另一種主要過敏原Ara h 2有59%的氨基酸序列同源性，存在交叉反應，可以協同增加致敏性[6]。Ara h 6結構包括由10 個半胱氨酸殘基構成的5 個二硫鍵[7]，Ara h 6的線性優勢區域集中在肽段AA10～15、45～48、53～60、116～118區域；Ara h 6的構象型表位優勢區有4 個，它們存在的區域為AA1～13、35～51、53～59、89～105，而在序列同源性、線性表位和構象型表位上，Ara h 6與Ara I 6、落花生conglutin、Ara d 6和落花生conglutin 8都有很高的相似性，它們之間發生交叉反應的概率高達100%[8-9]。

近年來，Ara h 6已經成為人們研究花生過敏領域的重要方面，而獲取高純度的過敏原是研究其結構和性質的材料基礎。當前以生花生為材料進行Ara h 6分離純化的研究工作較多，如Marsh[10]和羅春萍[11]等對花生種子進行研磨、粗提、柱層析等步驟純化出了高純度的Ara h 6。而作為制備食物過敏原的另一種重要的手段，重組過敏蛋白的研究也越來越受到重視。相比較天然Ara h 6進行規模化和標準化制備會受到材料來源的限制，如不同地區、不同種類花生品種中過敏蛋白含量的差別，重組花生Ara h 6的制備具有更為穩定的材料來源。此外，有大量文獻表明[12-14]，重組食物過敏原是天然過敏原的一種替代物，可以應用于食物過敏原的檢測以及食物過敏的診斷與治療等方面，因而重組過敏原Ara h 6的制備工作具有一定實際應用價值。

本實驗通過反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）獲得花生過敏原Ara h 6蛋白基因，原核表達帶有His標簽的Ara h 6蛋白，利用鎳離子親和層析（nickel affinity chromatography，Ni-NTA）進行純化獲得融合蛋白，實現了花生過敏原Ara h 6的生物制備。

1 材料與方法

1.1 材料

花生（江西南昌，湘花品種） 市售。

1.2 兔抗Ara h 6血清的制備

本血清參考羅春萍等[12]方法自制并保存，效價約為1∶100 000。

1.3 質粒、菌株與試劑

質粒pMD19-T-Simple、大腸桿菌E. coli DH5α、表達菌株BL21（DE3）-RIPL、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4連接酶、DNA Marker（DL2000） 日本TaKaRa公司；RT-PCR cDNA第一鏈合成試劑盒 德國Qiagen公司；質粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒 美國Omega公司；Ni親和層析預裝柱（5 mL）、羊抗兔IgG酶標二抗 美國Sigma公司；硝酸纖維素膜 美國Millipore公司；氨芐青霉素、卡那霉素（kan）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG） 南昌精科生物工程有限公司。

1.4 方法

1.4.1 引物的設計合成

根據GenBank已報道的花生過敏原Ara h 6的基因序列，設計好一對擴增引物，為了便于克隆與表達，在上游引物5’端引入了BamHⅠ酶切位點，下游引物5’端引入了EcoRⅠ酶切位點。擴增的目的基因長度為438 bp，對應的蛋白質的理論分子質量約16.9 kD。為了使限制性內切酶能夠有效識別酶切位點，切斷DNA，分別在上游引物和下游引物的5’端加入CGC和CCG保護性堿基（酶切位點用下劃線表示）。上游引物：5’-CGCGGATCCATGGC CAAGTCCACCATCC-3’（BamHⅠ），下游引物：5’-CC GGAATTCTTAGCATCTGCCGCCACTC-3’（EcoRⅠ）。

1.4.2 花生種子總RNA的提取

參照胡純秋等[13]的方法進行RNA的提取。

1.4.3 花生Ara h 6基因的RT-PCR擴增

按照Skramo等[14]的擴增方法，首先進行cDNA的合成，反應體系：10×Reaction Buffer 2.0 ?L、MgCl2（25 mmol/L）4.0 ?L、dNTP（10 mmol/L）2.0 ?L、Oligo（dT）Primer（0.8 ?g/?L）引物2.0 ?L、RNase Inhibitor（50 U/?L） 1.0 ?L、AMV逆轉錄酶（≥2.5 U/?L）0.8 ?L、無RNase水5.2 ?L、總RNA樣品3.0 ?L。反應條件為：37 ℃孵育60 min，合成cDNA，然后99 ℃變性5 min，最后4 ℃放置5 min。再以此反轉錄產物為模板進行PCR擴增，擴增條件：95 ℃變性1 min；68.7 ℃退火1 min；73 ℃延伸1 min，共40 個循環，反應體系：10×Reaction Buffer 2.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL、上游引物（25 μmol/L）和下游引物（25 μmol/L）各2.0 μL，cDNA 2.0 μL、ddH2O 14.2 μL、Taq酶（5 U/μL）0.3 μL。最后以DNA回收試劑盒純化PCR產物，并1%凝膠電泳對產物進行鑒定。

1.4.4 Ara h 6基因的克隆和測序[15]

將純化的PCR產物經瓊脂糖電泳鑒定純度后，與pMD19-T Simple載體連接，并轉入經CaCl2處理的E. coli DH5α感受態細胞，構建克隆載體pMD19-T-Ara h 6，之后再通過含氨芐青霉素的平板過夜培養，篩選陽性克隆子。克隆載體采用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，對酶切產物和重組質粒進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4.5 Ara h 6基因pET-28a表達載體的構建

根據Morris等[16]的方法，將測序正確的克隆載體及表達載體pET-28a，分別用EcoRⅠ和BamHⅠ 雙酶切，之后通過凝膠電泳的方法回收小片段及酶切后的載體。同時使用T4連接酶對兩個回收片段進行相互連接，并轉入E. coli DH5α感受態細胞后，構建重組表達質粒，通過含卡那霉素的LB平板進行篩選，挑菌擴大培養，提取陽性質粒，進行雙酶切鑒定，并將陽性克隆質粒，送交生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA測序，使用DNAMan軟件（版本號6.0.3.99）對結果進行序列對比分析。

1.4.6 表達載體在E. coli BL21（DE3）中的表達及檢測

表達過程參考Guo等[17]的方法，具體操作為：將表達載體轉入E. coli BL21（DE3）中，轉化成功后挑取抗卡那霉素陽性菌落于4 mL LB培養基中，37 ℃振蕩過夜培養。第2天取1.5 mL的過夜培養菌液接種于75 mL新鮮培養基中，并繼續37 ℃振蕩培養，于600 nm波長處測定光密度（OD）值為0.6～0.7，取1 mL菌液作為誘導前的對照，然后加入0、0.05、0.1 mmol/L的IPTG進行誘導。離心分別收集培養2、3、4、9 h的菌體，經磷酸鹽緩沖液洗滌3 次后，再用該緩沖液溶解和等體積十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）懸浮，100 ℃水浴5 min，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測。

1.4.7 重組產物的純化

將誘導表達后的重組質粒菌液進行超聲波破碎細胞，并在4 ℃、10 000 r/min離心30 min，取上清，選擇Ni-NTA純化目的蛋白，利用親和柱中鎳離子對組氨酸特異親和作用結合上樣蛋白液中的目的蛋白，然后使用咪唑洗脫緩沖液（300 mmol/L）洗脫親和柱，收集洗脫液，具體方法按照Amersham公司操作手冊進行，分別收取洗脫峰液，SDS-PAGE檢測純化結果。

1.4.8 質譜檢測重組產物

采用串聯質譜對融合蛋白氨基酸序列[18-19]與天然Ara h 6氨基酸序列進行對比分析。將純化的重組蛋白進行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍染色，將目的條帶割下，加入滅菌蒸餾水，密封，冷凍保存，并送至暨南大學生命與健康工程研究院功能蛋白質中心進行基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of fl ight mass spectrometry，MALDI-TO F/MS）鑒定。

1.4.9 重組產物的Western blotting檢測

采用Western blotting將融合蛋白轉移到膜上[20]，然后使用抗Ara h 6抗體進行檢測，獲得融合蛋白與Ara h 6抗體的結合能力，反映出其免疫原性[21-22]。參考Wang Hua等[22]的方法，將純化產物經SDS-PAGE分析后，進行轉移電轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，條件為：恒流40 mA，1 h；然后將膜取出，用5%的脫脂乳封阻，37 ℃溫育1 h；用TBST洗滌3 次，每次洗滌10 min，加入1∶3 000稀釋的兔抗Ara h 6血清將膜浸沒，37 ℃溫育1 h；洗滌；加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標羊抗兔IgG二抗，37 ℃溫育1 h；洗滌；最后加入4-氯-1-萘酚顯色5 min。

2 結果與分析

2.1 Ara h 6基因PCR擴增產物、克隆載體、表達載體的鑒定

采用1.0%瓊脂糖電泳檢測Ara h 6基因的RT-PCR的擴增情況，結果如圖1A所示，分子質量在500 bp左右出現了一條較為明亮的條帶，為目的產物條帶，其大小與預計Ara h 6基因大小相符合，初步確定為Ara h 6的cDNA片段，且純度很高。對構建的pMD19-T-Ara h 6載體進行EcoRⅠ和BamHⅠ酶切鑒定（圖1B），結果發現酶切所得的小片段條帶與圖1A中RT-PCR目的電泳條帶一致，分子質量接近500 bp，片段大小正確，另一片段載體大小約為3 000 bp，采用DNAMan軟件對送檢陽性克隆質粒的基因測序結果進行序列對比分析，結果顯示序列與已公布的Ara h 6基因序列相似度為97%，由此可證明基本克隆到正確的Ara h 6基因，進一步證明實驗中重組質粒構建成功。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定Ara h 6a h 6基因表達體系Fig.1 Agarose gel electrophoresis for identification of the expression system for Ara h 6 gene

圖2 2 Ara h 6a h 6基因表達質粒的構建Fig.2 Construction of plasmid pET-28a(+)-Ara h 6

使用限制性內切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切重組表達載體pET-28a（＋）-Ara h 6，構建簡圖見圖2。產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定（圖1C），切出的兩條帶中有分子質量接近500 bp大小的酶切片段，與目的基因片段大小相符，另一片段為表達載體大小，可以認為Ara h 6的編碼基因正確的融合到表達載體上，無其他的基因插入，表明表達載體構建成功。

2.2 Ara h 6基因的誘導表達及產物純化

將培養在IPTG 37 ℃、220 r/min誘導表達2、3、4、9 h的菌液進行破碎，并進行SDS-PAGE分析，結果如圖3A所示。與未經誘導的對照樣相比，含IPTG誘導的樣品，在約26 kD處有明顯的表達蛋白條帶，由于該基因誘導表達的產物連接有pET-28a（＋）上的His-Tag，去掉pET-28a（+）載體的N端含有的硫氧環蛋白和His標簽，近似為Ara h 6蛋白大小16 kD，與理論值相符。另外，也可以看出使用IPTG誘導時間不同，其表達量也有所不同。通過QuantityOne凝膠成像軟件分析結果，顯示使用IPTG誘導2 h有明顯目的蛋白表達；在誘導4 h后隨著時間增加，目的蛋白含量無明顯變化。因此可以認為使用0.1 mmol/L IPTG對表達菌進行誘導4 h可以獲得較多表達產物。

基于誘導表達的重組Ara h 6蛋白為帶有His標簽的融合蛋白，利用親和柱中鎳離子對組氨酸特異親和作用結合上樣蛋白液中的目的蛋白，取各洗脫液進行SDS-PAGE分析，結果如圖3B所示。使用QuantityOne軟件進行灰度掃描分析顯示了獲得的重組目的蛋白純度在80%左右。

圖3 重組Ara h 6 SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE of recombinant Ara h 6

2.3 Ara h 6基因重組產物的鑒定

對融合蛋白樣品進行了MALDI-TOF/MS分析，結果見圖4。通過對質譜數據進行分析和在數據庫中進行檢索比對，結果發現本實驗純化所得的蛋白與花生過敏原Ara h 6相匹配，重組蛋白的一級結構與Ara h 6匹配度為100%。

圖4 重組蛋白Ara h 6質譜鑒定Fig.4 MALDI-TOF/MS spectrum of recombinant Ara h 6

圖5 重組Ara h 6蛋白Western blotting分析Fig.5 Western blotting analysis of recombinant Ara h 6

親和層析純化的融合蛋白經過轉膜之后與兔抗天然Ara h 6血清反應，在目標蛋白處有明顯特異性印跡，而與兔陰性血清反應無任何印跡出現（圖5），該結果表明該重組蛋白具有免疫原性，保持生物活性。

3 討 論

花生過敏反應是人體對花生過敏原產生的由IgE介導的Ⅰ型超敏反應，對于過敏患者具有終身過敏的特點[17]。鑒于融合花生過敏蛋白可以作為天然過敏原的一種替代物，特別是用于過敏蛋白標準物的制備，因此研究中獲得結構和性質與天然產物高度一致的融合過敏蛋白Ara h 6具有重要的意義。

大腸桿菌表達系統是開發最早、技術最成熟的外源蛋白原核表達系統[20]。pET系列質粒因其克隆表達融合蛋白的高效性以及帶有多種可選擇的融合標簽，是目前應用最廣泛的原核表達載體系統[23]。pET-28a作為其中一種質粒其效果穩定、靈敏度高尤其表達產物的量多，因此本實驗中采用該質粒作為表達載體。本實驗利用瓊脂糖凝膠電泳分別對RT-PCR擴增的基因產物、克隆載體pMD19-T-Ara h 6以及表達載體pET-28a（＋）-Ara h 6進行鑒定（圖1），皆可見低于500 bp大小的特異性擴增條帶，與目的基因大小符合，表明成功獲得Ara h 6基因、Ara h 6克隆載體以及Ara h 6表達載體。基因序列對比進一步確定得到的克隆載體具有正確的Ara h 6基因序列，表明成功構建Ara h 6基因表達體系，為融合Ara h 6蛋白的表達純化奠定了基礎。

本實驗選擇大腸桿菌BL21（DE3）作為工程菌，并探索IPTG誘導時間對融合蛋白的表達的影響，結果顯示0.1 mmol/L IPTG于37 ℃誘導4 h，培養的工程菌可以獲得較高量的融合蛋白的表達。表達的融合蛋白因其上攜帶His的標簽，本研究采用Ni-NTA進行親和純化，提純目的蛋白，SDS-PAGE結果顯示純化后的目的蛋白的純度可達到80%。為進一步確定表達出的融合產物的蛋白的結構，可以選擇質譜進行蛋白質結構的檢測[24]。Wu Zhihua等[25]在融合花生Ara h 1的研究中運用此技術，將表達的融合蛋白與Ara h 1一級結構進行比對，進一步確定表達出融合花生Ara h 1蛋白。本實驗中利用質譜對純化的融合蛋白進行檢測，通過與數據庫中Ara h 6結構進行比較，結果發現融合蛋白的一級結構與Ara h 6匹配度為100%，這表明研究成功合成融合Ara h 6蛋白。另一方面，Western blotting可以檢測抗原抗體之間的特異性結合能力[26]。選擇相應的抗體用來確定過敏原蛋白與之結合能力的強弱，用來反映獲得的目的蛋白的生物活性和免疫原性。本實驗中以抗Ara h 6兔血清為抗體，檢測純化的融合蛋白與其特異性結合能力，結果發現該融合和蛋白與抗Ara h 6兔血清有很強的結合能力，表明表達的融合蛋白具有非常好的免疫原性。

因此，本研究成功表達出了花生Ara h 6融合蛋白，該融合蛋白與兔抗Ara h 6有較好的特異性結合能力。研究成果對利用融合蛋白進行免疫檢測、食物過敏的診斷以及過敏原標準物質的制備有積極的意義。

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Gene Cloning and Prokaryotic Expression of Peanut Allergen Ara h 6

ZHAN Shaode1, QIU Changjiang2, ZHU Pan3, WU Zhihua1,*, CHEN Hongbing1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. Zhejiang Fashion Institute of Technology, Ningbo 315200, China; 3. Center for Disease Control and Prevention of Guangdong Province, Guangzhou 510300, China)

Ara h 6 is one of the major peanut allergens. Ara h 6 cDNA was synthesized from total RNA using Oligo primers by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) in order to provide a template for the PCR amplifi cation of Ara h 6 gene. The target gene was cloned into pMD19-T vector to construct a recombinant vector. Then the recombinant vector was transferred into the bacterial expression host BL21 (DE3). IPTG was used t o induce protein expression, and the expressed product was purifi ed by Ni affi nity chromatography. DNA sequence analysis showed that the full-length gene fragment of Ara h 6 was 438 bp and encoded 145 amino acids, which was 97% identical to the known DNA sequence. Sodium dodecyl sulfate-polyacryl amide gel electrophoresis (SDS-PAGE) results showed that the molecular weight of the expressed fragment was 24 kD, which matched with the theoretical value of the His-tagged fusion recombinant protein Ara h 6. Mass spectrometric results showed that the matching degree of structure was 100% between the recombinant protein and natural Ara h 6. Western blotting indicated that the protein could be recognized by anti-Ara h 6 polyclonal antibody, and has strong immunogenicity.

peanut; allergen; Ara h 6; recombinant expression; mass spectrometry

10.7506/spkx1002-6630-201603024

TS207.2

A

1002-6630（2016）03-0125-06

詹少德, 邱昌將, 朱盼, 等. 花生過敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表達[J]. 食品科學, 2016, 37(3): 125-130. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603024. http://www.spkx.net.cn

ZHAN Shaode, QIU Changjiang, ZHU Pan, et al. Gene cloning and prokaryotic expression of peanut allergen Ara h 6[J]. Food Science, 2016, 37(3): 125-130. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6 630-201603024. http://www.spkx.net.cn

2015-03-26

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAK10B03）；國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2013AA102205）；江西省科技支撐計劃項目（20133BBF60004）

詹少德（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全。E-mail：universitync@163.com

*通信作者：吳志華（1976—），男，教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：wuzhihua@ncu.edu.cn