乳酸片球菌素PA-1在大腸桿菌中的表達與純化

陳信全，都立輝，鞠興榮,,*，吳學友，袁 建，何 榮

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇 南京 210023；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

乳酸片球菌素PA-1在大腸桿菌中的表達與純化

陳信全1，都立輝1，鞠興榮1,2,*，吳學友2，袁 建1，何 榮1

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇 南京 210023；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

為了實現該細菌素的外源表達，本實驗首先利用聚合酶鏈式反應從乳酸片球菌PAF中擴增出乳酸片球菌素PA-1的結構和免疫基因，然后克隆到表達載體pGEX-6p-1，構建了N端含有GST-His-DDDDK標簽的重組質粒pGEX/ his-pedAB，然后轉化進入大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態細胞，經異丙基硫代半乳糖苷誘導，重組乳酸片球菌素PA-1在大腸桿菌胞內成功表達。表達的融合蛋白先經過鎳親合層析柱純化，然后注入谷胱甘肽S-轉移酶親和色譜柱用腸激酶處理，釋放出成熟的乳酸片球菌素PA-1。利用高效液相色譜和質譜技術檢測乳酸片球菌素PA-1純度。以單核細胞增生李斯特氏菌CMCC54004為指示菌，利用瓊脂擴散法檢驗乳酸片球菌素PA-1活性。結果表明，攜帶GST-His-DDDDK標簽的融合蛋白無活性，標簽切除后其抑菌活性恢復，且其純度達90%以上。

細菌素；乳酸片球菌素；原核表達；蛋白純化

乳酸菌細菌素是由乳酸菌代謝過程產生的一類具有抗菌活性的多肽或蛋白質[1]。它們可被人體生物降解和消化，對健康無害。大部分乳酸菌細菌素對熱穩定，具有高等電點和親水特性[2]。最近將乳酸菌細菌素分為三大類：Ⅰ類細菌素為含有修飾氨基酸的多肽；Ⅱ類細菌素為不含修飾氨基酸的多肽；Ⅲ類細菌素為大分子質量蛋白質[3]。Ⅱ類細菌素包括4 個亞類，其中Ⅱa類細菌素為目前成員最多、研究較為深入的一類細菌素[3-4]。這類細菌素普遍對單核細胞增生李斯特氏菌有強烈抑制作用。近年來世界范圍內發生多起由單核細胞增生李斯特氏菌引起的中毒事件，具有很大的危害性，使得預防和控制食品中的李斯特氏菌成為關注的熱點。

乳酸片球菌素PA-1是由乳酸片球菌產生的已被廣泛研究的一種典型Ⅱa類細菌素[5-7]，成熟的乳酸片球菌素PA-1是由44 個氨基酸殘基和2 個二硫鍵組成。其操縱子包含pedA、pedB、pedC、pedD 4 個基因，即結構基因、免疫基因、分泌基因、加工基因[8]。因其具有強烈的抗李斯特氏菌活性而獲得廣泛關注[9]。天然的細菌素資源有限、純化困難，不足以進行抑菌作用機制、構效關系及開發應用研究。化學合成的細菌素成本高、活性不穩定，難以滿足細菌素相關研究和實際應用的需求。因此通過基因重組表達得到大量細菌素是低成本、高效益的方法[10-11]。由于大腸桿菌（Escherichia coli）培養操作簡單、生長繁殖快、價格低廉，且表達外源基因產物的水平遠遠高于其他基因表達系統。因此E. coli是目前應用最廣泛的蛋白表達系統之一，采用E. coli表達系統獲得細菌素已成為研究者的首選[12]。另外，由于細菌素一般為小分子多肽，因此通常以融合蛋白的方式表達，這不僅可避免抗菌肽對宿主的毒性作用，也保護了抗菌肽免受蛋白酶降解[13]。融合蛋白形成以后通過酶解法或化學裂解方法切除標簽蛋白獲得成熟細菌素。早在1998年，Miller等[14]就利用PMAL-p2x載體在E. coli中分泌表達了麥芽糖結合蛋（maltose binding protein，MBP）-pediocin AcH，并發現該融合蛋白具有與天然乳酸片球菌素AcH相似的生物學活性。Moon等[15]將乳酸片球菌素PA-1成熟肽基因與帶有組氨酸標簽蛋白His-tag的倉鼠二氫葉酸還原基因序列融合，在E. coli細胞質內成功表達了無活性的His-tag-倉鼠二氫葉酸還原酶-乳酸片球菌素PA-1，純化后的融合細菌素經Xa因子蛋白酶酶切恢復乳酸片球菌素PA-1活性。韓燁等[16]將乳酸片球菌素Ped-A基因克隆到pET-28a中，經誘導在E. coli中表達，表達產物對單核細胞增多癥李氏桿菌有抗菌作用。

本研究采用基因工程技術，將乳酸片球菌素PA-1成熟肽基因，與表達載體pGEX-6p-1中的谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）基因的核苷酸序列融合，在E. coli細胞質內成功表達了可溶性的融合蛋白GST-His-DDDDK-Pediocin PA-1，通過兩步親和色譜從細胞破碎液中分離獲得重組乳酸片球菌素PA-1，最后用腸激酶處理除去重組乳酸片球菌素PA-1上的標簽蛋白，獲得具有抗李斯特氏菌活性的乳酸片球菌素PA-1，以期獲得片球菌素的高效表達，對片球菌素的深入研究和廣泛應用有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒與載體

乳酸片球菌PAF、E. coli DH5α菌株、表達菌株E. coli Rosetta（DE3）和表達質粒pGEX-6p-1 南京財經大學食品科學與工程學院實驗室保存；單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）CMCC54004江蘇省疾病預防控制中心饋贈；pEASY-Blunt載體北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 培養基

LB（Luria-Bertani）培養基、腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養基 北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.3 試劑

透析袋 北京索萊寶科技有限公司；限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ、HSTMMix、DNA Ligation Kit、感受態細胞制備試劑盒 日本TaKaRa公司；DSTM5000 DNA Marker 廣州東盛生物科技有限公司；多功能DNA純化回收試劑盒、高純質粒小量制備試劑盒（離心柱型） 北京百泰克生物技術有限公司；氨芐青霉素美國Ameresco公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷 美國BioBasic公司；寬范圍彩色預染蛋白質Marker 天根生化科技（北京）有限公司；HisTrap HP、GSTrap 4B親和色譜柱 美國GE公司；腸激酶、磷酸氫二鈉、咪唑生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

梯度PCR儀 美國Applied Biosystems公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；THZ-D型恒溫振蕩器 江蘇太倉市強樂實驗設備有限公司；高速離心機 上海安亭科學儀器廠；JY92-II超聲波細胞破碎機 寧波新藝超聲設備有限公司；?KTA蛋白純化系統 美國GE公司；恒溫金屬浴 美國Torrey Pines Scientific公司；瞬時低速離心機 美國Cubee GeneReach公司；微型臺式冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

常規生物學操作參照《分子克隆手冊進行》[17]方法進行。

1.3.1 乳酸片球菌素PA-1基因克隆

根據GenBank數據庫中乳酸片球菌素PA-1基因的序列（HQ876214.1），設計引物P1：5’-AT G G C C A ATAT C AT T G G T G G TA A ATAC TAC G GTAATGGGG-3’和引物P2：5’-CCGCTCGAGT TACCACGTATTGGTAGTATCTAGC-3’，該引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以乳酸片球菌PAF新鮮過夜培養菌液為模板，從乳酸片球菌PAF中聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增PA-1的基因片段[18]，該片段由結構基因和免疫基因（pedAB）組成。PCR反應體系如下：HSTMMix 25 μL；引物P1、P2各1 μL（終濃度1 μmol/L）；乳酸片球菌PAF新鮮菌液2 μL；加雙蒸水至50 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性15 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸40 s，共30 個循環；72 ℃延伸7 min。反應結束后，取5 μL PCR反應液進行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對目的片段進行膠回收純化后與pEASY-Blunt載體連接，構建克隆載體pEASY/pedAB。將pEASY/pedAB轉化到E. coli DH5α感受態細胞中，挑選陽性克隆，接種在LB液體培養基（含50 μg/mL的氨芐青霉素）過夜培養后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。提取測序正確質粒pEASY/pedAB做二次PCR模板。

1.3.2 表達載體pGEX/his-pedAB的構建

根據pGEX-6p-1質粒多克隆區的酶切位點和GenBank數據庫中乳酸片球菌素PA-1成熟肽基因及免疫基因序列（HQ876214.1）設計引物：P3：5’-GCTGGATCC CACCATCATCATCATCATGACGACGAC GA CAAGAAATACTACGGTAATGGGGTTACTTG TG-3’；P4：5’-CCGCTCGAGTTACCACGTATT GGTAGTATCTAGCATGTTAA-3’，下劃線分別表示引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，粗體字表示His標簽和腸激酶酶切位點。融合蛋白順序為：GST-His×6-DDDDKPediocin PA-1。以測序正確pEASY/pedAB為模板，P3、P4為引物進行PCR擴增，產物回收、純化后進行Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產物連接到同樣雙酶切的pGEX-6p-1載體，構建表達載體pGEX-6p-1/pedAB。轉化E. coli DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，并進行PCR鑒定和酶切鑒定，將鑒定正確的重組質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。將基因測序正確的重組質粒pGEX-6p-1/pedAB轉化表達宿主E. coli Rosetta（DE3）。1.3.3 重組乳酸片球菌素PA-1的誘導表達與分離純化

將含陽性質粒pGEX-6p-1/pedAB的重組菌單菌落，接種于裝有LB液體培養基（含終質量濃度為50 μg/mL的氨芐青霉素）的三角瓶中，37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養，直至OD600nm值為0.6～0.8。向三角瓶中加入終濃度為1 mol/L的異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）進行誘導，繼續培養5 h，采集1 mL菌體懸浮液離心后取菌體進行細菌總蛋白組分的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測[19]，剩下菌液在8 000×g條件下離心5 min收集菌體，用生理鹽水清洗菌體2 次。用發酵液初始體積1%的結合緩沖液（含有500 mol/L NaCl、20 mol/L Na3PO4和20 mol/L 咪唑的水溶液，pH 7.4）懸浮菌體，置于冰水混合物中超聲破碎菌體細胞，直至菌體溶液澄清，得到菌體裂解液。將菌體裂解液離心（15 000×g，4 ℃，30 min），取上清，用0.22 μm的濾膜過濾，得到重組乳酸片球菌素PA-1粗提液，對粗提液蛋白進行SDS-PAGE分析。

粗提液上樣于His Trap HP 親和層析凝膠柱，10 mL結合緩沖液（500 mol/L NaCl、20 mol/L Na3PO4、20 mol/L咪唑，pH 7.4）清洗柱子，用5～10 倍體積的洗脫緩沖液（500 mol/L NaCl、20 mol/L Na3PO4、500 mol/L咪唑，pH 7.4）洗脫，收集洗脫峰部分的洗脫液進行第二步純化。取100 ?L進行SDS-PAGE分析及活性檢驗。將剩余洗脫緩沖液注入預先處理過的截留分子質量為7 000 D的透析袋中，用大量的GSTtrap 4B結合緩沖液（140 mol/L NaCl、2.7 mol/L KCl、10 mol/L Na2HPO4、1.8 mol/L KH2PO4，pH 7.4）對其進行透析過夜。透析后樣品經12 000×g離心 20 min后取上清液，注入已用結合緩沖液平衡好的GSTtrap 4B親和色譜柱。用約10 mL GSTtrap結合緩沖液洗到基線穩定，最后用約10 mL的腸激酶酶切緩沖液（25 mol/L Tris-HCl、50 mol/L NaCl、2 mol/L CaCl2、pH 7.6）平衡柱子。將1 mL腸激酶mix（160 U腸激酶溶解在920 ?L 4 ℃腸激酶酶切緩沖液里）注入GSTtrap 4B親和色譜柱，然后將上下堵頭擰上，置于25 ℃水浴16 h。將親和色譜柱重新接上?KTA蛋白純化系統，用5 mL酶切緩沖液洗脫被切下來的游離細菌素，收集到樣品送到交蘇州普泰生物技術有限公司，采用Nano液相色譜-電噴霧電離串聯質譜（liquid chromatography electrospray ionization tandam mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）進行鑒定。

1.3.4 細菌素活性鑒定和純度測定

以單核細胞增生李斯特氏菌為指示劑，采用瓊脂擴散法檢測表達片球菌素的活性[20]。取10 ?L樣品（經0.22 ?m濾膜過濾除菌）注入接種有體積分數為0.5%的新鮮過夜單核細胞增生李斯特菌菌液（37 ℃條件下培養16 h）的BHI固體平板上的瓊脂孔（約3 mm）中，在超凈工作臺上靜止1 h后，倒置于37 ℃培養箱培養10 h，觀察抑菌圈。以純化融合乳酸片球菌素PA-1為對照，檢驗酶切分離的乳酸片球菌素PA-1活性。

通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測分離的乳酸片球菌素PA-1純度。HPLC的檢測條件為：色譜柱：Gemini-NX交換柱；流動相：三氟醋酸-乙腈（1∶1 000，V/V）；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；檢測器：示差折光檢測器。

2 結果與分析

2.1 乳酸片球菌素PA-1基因的克隆和表達載體構建

圖1 乳酸片球菌素PPAA--11結構基因和免疫基因的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification products of structural and immunity genes of pediocin PA-1

由圖1可知，擴增產物瓊脂糖電泳分析表明約500 bp處有明顯的擴增條帶，同預期目的片段（532 bp）大小相符。回收目的片段克隆至平端載體pEASY-Blunt，產生重組質粒pEASY/pedAB，轉化E. coli DH5α，挑單克隆菌過夜培養送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序鑒定。測序結果用DNAMAN軟件與GenBank數據庫比對分析，結果顯示序列100%匹配，說明成功從乳酸片球菌中擴增出乳酸片球菌素PA-1結構基因及免疫基因。

圖2 表達載體pGEX-6p-1/pedAB的構建過程Fig.2 Construction of the expression vector pGEX-6p-1/pedAB

利用克隆質粒pEASY/pedAB作為模板，進行二次PCR擴增乳酸片球菌素PA-1成熟結構基因及免疫基因且在其上下游分別引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點。擴增片段經雙酶切后連接入載體pGEX-6p-1構建表達載體pGEX-6p-1/pedAB（圖2）。轉化E. coli DH5α挑陽性單克隆菌過夜培養后提取質粒進行BamHⅠ、XhoⅠ單、雙酶切鑒定，結果如圖3所示：單酶切得到5 513 bp片段（泳道2和3）；雙酶切產生4 870 bp和550 bp兩條條帶（泳道4），分別對應線性表達載體pGEX-6p-1和插入目的基因大小，說明融合基因his-pedAB成功插入表達載體pGEX-6p-1。且該陽性克隆質粒經測序鑒定序列正確、無突變現象，表明乳酸片球菌素PA-1的表達載體成功構建。

圖3 重組質粒pGEX/His-pedAB的酶切鑒定結果Fig.3 Results of double enzyme digestion of recombinant plasmid pGEX/His-pedAB

2.2 重組乳酸片球菌素PA-1的誘導表達與分離純化

圖4 融合片球菌素PA-1表達產物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant pediocin PA-1

對發酵液及其超聲破碎上清液進行SDS-PAGE分析，結果如圖4所示，泳道1和2在34 kD處有明顯的表達蛋白條帶，與預測的融合片球菌素大小相當，發酵液中檢測出同樣的蛋白條帶說明表達可溶。對表達菌體的破碎上清液采用HisTrap親和色譜柱分離純化結果如圖5所示，洗脫過程產生單一洗脫峰，說明重組菌表達了大量含His標簽的融合蛋白。分離純化后融合蛋白用SDS-PAGE分析結果如圖4的泳道3，同樣出現與泳道1、2大小相同的目的蛋白條帶，表明融合片球菌素在E. coli成功表達。隨后利用GSTtrap 4B色譜柱對HisTrap柱純化蛋白進行第二步純化，且對結合蛋白進行腸激酶酶處理從而分離出乳酸片球菌素PA-1。取純化后的乳酸片球菌素PA-1樣品送往蘇州普泰生物技術有限公司進行Nano LCESI-MS/MS 鑒定，鑒定結果經GenBank數據庫搜索比對，證實與乳酸片球菌素PA-1序列完全一致。

圖5 融合片球菌素的PA-1 HisTrap HP柱分離色譜Fig.5 Saparation chromatogram of recombinant pediocin PA-1 by HisTrap HP affinity column

2.3 表達細菌素活性鑒定和純度

以單核細胞增生李斯特氏菌為指示菌，利用瓊脂擴散法鑒定表達融合片球菌素PA-1和酶切分離后的完整細菌素活性。結果如圖6所示，融合片球菌素并無明顯抑制李斯特氏菌活性，而酶切去除標簽蛋白后的片球菌素恢復抑菌活性。高效液相色譜測定經兩步色譜純化后的片球菌素純度達到90%以上（圖7）。

圖6 表達細菌素抗單核細胞增生李斯特氏菌活性Fig.6 Anti-Listeria activity of the expressed pediocin PA-1

圖7 片球菌素PA-1的高效液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of pediocin PA-1

3 結論與討論

E. coli是目前應用最廣泛的蛋白表達系統之一，采用E. coli表達系統獲得細菌素已成為研究者的首選[12]。本實驗探索了一種將GST與細菌素相融合來高效表達乳酸片球菌PA-1的新方法。GST作為融合蛋白表達載體，有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解，提高其穩定性、可溶性，并可作為標簽，通過親和層析純化表達產物。通過在GST和目的蛋白間引入His標簽以實現表達融合蛋白的兩步純化，使所表達片球菌素純度達90%以上，為片球菌的結構及作用機理深入研究奠定了基礎。

GST融合的片球菌素無活性，經酶切去除標簽蛋白后的片球菌素恢復抑菌活性。這可能由于GST包含的半胱氨酸干擾片球菌中自身半胱氨酸間的二硫鍵形成，從而改變了片球菌素的原來結構。乳酸片球菌素PA-1氨基酸序列含有4 個半胱氨酸，分別在N端與C端形成一個二硫鍵[21]。而研究表明二硫鍵對Ⅱa類細菌素的結構和活性非常關鍵[6,22]。同樣的現象被Gibbs[23]、Moon[15]、趙愛珍[24]等揭示。

本研究在原核表達系統E. coli中成功實現了乳酸片球菌素PA-1的可溶性表達，為Ⅱa類細菌素的表達與純化研究提供有力的數據支撐。

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Expression and Purification of Pediocin PA-1 in Escherichia coli

CHEN Xinquan1, DU Lihui1, JU Xingrong1,2,*, WU Xueyou2, YUAN Jian1, HE Rong1
(1. Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing of Jiangsu Higher Education Institutions, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China; 2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Pediocin PA-1 is a representative class IIa bacteriocin produced by Pediococci with the potential to serve as a food-grade preservative for controlling Listeria contamination. To obtain its soluble expression, Pediocin PA-1 structural and immunity gene pedAB was amplified by polymerase chain reaction (PCR) from Pediococcus acidilactici PAF, and cloned into the vector pGEX-6p-1 to construct the pGEX/his-pedAB encoding the recombinant pediocin PA-1 with GST-His-DDDDK in the N-terminal of pediocin PA-1. The plasmid pGEX/his-pedAB was then transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3). After induction with isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, the recombinant pediocin PA-1 was successfully expressed in E. coli cytoplasm. The expressed fusion protein was purified by Ni-NTA metal affinity chromatography, subsequently loaded to GST affinity column and treated with recombinant bovine enterokinase. Mature pediocin PA-1 was liberated from the recombinant protein. The purity of pediocin PA-1 was detected by high-performance liquid chromatography and mass spectrometry. The antibacterial activity of pediocin PA-1 was determined by agar diffusion method using Listeria monocytogenes CMCC54004 as an indicator. The results showed that fusion pediocin PA-1 did not have bactericidal activity against Listeria monocytogenes, but when the GST-His-DDDDK in the N-terminal was removed, the cleaved pediocin PA-1 restored its bactericidal activity. The purified pediocin PA-1 had a purity above 90%.

bacteriocin; pediocin; prokaryotic expression; protein purification

10.7506/spkx1002-6630-201603019

TS201.2

A

1002-6630（2016）03-0097-06

陳信全, 都立輝, 鞠興榮, 等. 乳酸片球菌素PA-1在大腸桿菌中的表達與純化[J]. 食品科學, 2016, 37(3): 97-102. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603019. http://www.spkx.net.cn

CHEN Xinquan, DU Lihui, JU Xingrong, et al. Expression and purification of pediocin PA-1 in Escherichia coli[J]. Food Science, 2016, 37(3): 97-102. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603019. http://www.spkx.net.cn

2015-04-24

國家自然科學基金面上項目（31271930）；江蘇省研究生培養創新工程項目（KYLX_1167）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（PAPD）；江蘇省普通高校研究生科研創新計劃項目（CXZZ13_0636）

陳信全（1988—），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：sincher-chen@foxmail.com

*通信作者：鞠興榮（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品營養、功能食品及農產品精深加工。E-mail：xingrongju@163.com