苯甲酸及其類似物與酪氨酸酶分子對接研究

李慕紫，王慶華*，王曉藝，何 云

（1.廣東藥學院中藥學院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥學院基礎學院，廣東 廣州 510006）

苯甲酸及其類似物與酪氨酸酶分子對接研究

李慕紫1，王慶華2,*，王曉藝1，何 云1

（1.廣東藥學院中藥學院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥學院基礎學院，廣東 廣州 510006）

以AutoDock 4.2和iGEMDOCK 2.1分子對接軟件對13 種苯甲酸類似物與酪氨酸酶進行模擬對接研究，探討苯甲酸類似物對接結合自由能與實驗測得的酶抑制活性的關系，并對分子對接結果進行分析。結果表明：AutoDock 4.2程序中Cu電荷數的設置對結合自由能有顯著影響，銅電荷數為2.0時，苯甲酸類似物結合自由能和pIC50（－lgIC50）線性相關系數可達0.803 6。iGEMDOCK 2.1預測苯甲酸類似物的結果線性較差，即AutoDock 4.2較iGEMDOCK 2.1預測酪氨酸酶抑制劑的可靠性更高。

酪氨酸酶；苯甲酸；抑制劑；分子對接

酪氨酸酶（EC 1.14.18.1）是結構復雜的多亞基含銅氧化還原酶，是人體黑色素合成的限速酶，通過抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素生成[1]，可預防和治療色素沉著、黑色素瘤等疾病，在化妝品領域也有廣泛應用，使得越來越多的酪氨酸酶抑制劑得到研究開發[2-3]。

隨著計算機輔助藥物設計的深入，分子對接的應用越來越廣，現已有多個分子對接軟件應用于藥物篩選。利用分子對接軟件對這些抑制劑與酪氨酸酶的相互作用進行預測，可以為了解這些化合物的酶活性抑制機理提供參考[4]。AutoDock是美國Scripps研究所的Olson實驗室開發與維護的一款分子對接模擬軟件，主要應用于配體-蛋白質分子對接[5]。iGEMDOCK軟件是臺灣國立交通大學藥物設計和系統生物學實驗室開發的分子對接軟件，是一種集分子對接、篩選、對接或篩選后分析及圖形可視化于一體的藥物輔助設計工具[6]，其對接過程簡單，選擇受體分子、導入配體后選擇合適的對接模式即可進行對接，且能同時對接多個配體，常用于快速對接和活性篩選。在具體研究中，不同的對接軟件得到的對接結果不盡相同，且與對接過程中各參數的選取密切相關。本研究利用AutoDock和iGEMDOCK軟件，模擬酪氨酸酶與13 種具有酪氨酸酶抑制活性的苯甲酸類似物的對接，分析小分子對酪氨酸酶的作用模式和機理，探討對接結合自由能與抑制活性的相關性，以及兩種對接軟件用于預測酪氨酸酶抑制劑強度的可靠性。

1 材料與方法

1.1 AutoDock 4.2軟件分子對接步驟及對接參數的設置

AutoDock Tools 1.5.4軟件從官網（http://autodock. scripps.edu/）下載，編號2y9x的酪氨酸酶晶體結構文件來自Protein Data Bank，2y9x為雙孢菇酪氨酸酶的X衍射三維晶體結構[7]，有8 個亞基A～H，對接位點選在A亞基活性中心小分子抑制劑環庚三烯酚酮（tropolone）所在區域。為充分暴露其活性中心，刪去其余亞基及配體tropolone，得到用于對接的受體三維結構，保存為pdb格式[8-9]。配體抑制劑結構在ZINC數據庫下載，其三維結構坐標文件由GlycoBioChem PRODRG2 Server（http://davapc1.bioch. dundee.ac.uk/prodrg）轉化。13 種苯甲酸類似物的結構式如圖1所示[10]。用AutoDock Tools 1.5.4軟件處理受體分子：去水加氫，計算Gasteiger電荷，合并非極性氫原子，保存為pdbqt格式。同樣，AutoDock Tools可對配體進行處理，其非極性氫原子被合并，Gasteiger電荷被加上，使能量最小化[11]。AutoDock Tools 1.5.4軟件中的Ligand子程序包可自動檢測可旋轉鍵的個數，在對接過程中，這些鍵可以靈活旋轉與受體分子對接。AutoDock 4.2可以進行柔性對接，但選取柔性基團的不確定因素較多，因此本實驗仍采用剛性對接形式。

圖1 苯甲酸類化合物1～13的化學結構Fig.1 Chemical structures of benzoic acid and its analogues

在格點盒子（gridbox）中，格點間距為0.375 ?，大小為60 ?×60 ?×60 ?，格子的中心為默認受體活性中心，坐標值為（－7.397, －23.551, －32.508）。配體構象搜索過程使用半經驗打分函數與拉馬克遺傳算法[12]（Lamarckian genetic algorithm，LGA），算法對接的輪數（number of GA runs）設為100，對接次數越多，所耗時間會越長，但對接結果更可靠。在分子對接運行過程中，能量評估的最大數目（max number of evals）設為250萬，平移步驟大小（rate of crossover）為0.8，其他參數取默認值[13]。

酪氨酸酶為含Cu氧化還原酶，Cu電荷數的大小對其活性對接有影響，但Cu不是AutoDock 4.2的默認原子類型，需要在對接前自行添加Cu和設置電荷數，因此，Cu電荷數是需確定的重要參數之一[14]。實驗中分別設置受體坐標文件Cu電荷數為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，以苯甲酸為例，運行得到對接結合自由能，探討Cu電荷最佳參數。

1.2 iGEMDOCK 2.1軟件分子對接步驟及對接參數的設置

iGEMDOCK 2.1軟件在導入酪氨酸酶受體分子時，不必刪去多余的亞基，可自行將配體小分子tropolone所在區域作為活性位點[15]。直接導入配體分子進行對接。對接參數設置：通用進化方法中群體大小（population size）設為300，子代數目（generations）設為80，解的個數（number of solutions）設為10，運行docking。

2 結果與分析

2.1 對接準確性驗證

為驗證AutoDock 4.2參數設置與對接結果的準確性，將酪氨酸酶晶體活性中心中的小分子tropolone作為配體，與刪去配體的酪氨酸酶進行對接[16]。對接的最優構象與在Protein Data Bank下載帶有tropolone結構的酪氨酸酶三維X衍射圖進行對比，發現模擬對接的小分子tropolone與三維X衍射圖中的小分子結合在酪氨酸酶活性中心的相同部位，其構象大部分重合（圖2），可見本實驗中設置的對接參數合理，能較好地建立抑制劑與酶在活性中心的結合模型。

圖2 分子對接與三維X衍射結構對比Fig.2 Comparison between docking and three-dimensional X-ray structure

2.2 Cu電荷數改變對AutoDock對接結果的影響

圖3顯示了苯甲酸與酪氨酸酶對接結合自由能與所設置Cu電荷數大小的關系。Cu電荷數為0時，結果偏差大，Cu電荷數越大，對接結合自由能與Cu電荷數的線性關系越好。綜合考慮Cu的價態，本實驗中酪氨酸酶的Cu電荷數設為2.0。

圖3 對接結合自由能與Cu電荷數關系Fig.3 Relationship between binding free energy and Cu charge

2.3 AutoDock 4.2和iGEMDOCK 2.1軟件對接結果

本研究篩選了13 種苯甲酸類似物的酪氨酸酶抑制劑，由文獻[9,17-21]獲得其抑制常數和半抑制濃度（IC50），抑制劑的活性數據及兩種軟件預測的最低對接結合自由能見表1。

表1 苯甲酸類似物對酪氨酸酶的抑制作用及對接結合自由能Table1 Inhibitory effect and binding free energy of benzoic acid and its analogues against tyrosinase

以抑制劑pIC50（－lgIC50）為橫坐標，對接結合自由能（取各對接構象中的最低對接結合自由能）為縱坐標，得到AutoDock 4.2軟件對接的苯甲酸類似物與對接結合自由能相關性圖。Cu電荷數設置為2.0時，其回歸方程為y＝－0.798 5x－6.950 7（r＝0.803 6）；Cu電荷數設置為0時，其回歸方程為y＝0.107 1x－3.705 4（r＝0.203 2）。

苯甲酸及其類似物與酪氨酸酶iGEMDOCK 2.1的對接結合自由能見表1，其pIC50與對接結合自由能的回歸方程為y＝－0.981 3x－88.674（r＝0.112 2）。

2.4 酪氨酸酶對接的成鍵作用與活性中心分析

通過13 種抑制劑與酪氨酸酶的相互作用分析，發現與抑制劑作用的氨基酸殘基主要有：His85、His263、His259、His296、His61、Phe292、Val283、Ala286、Gly281、Ser283等。選取苯甲酸預測所得對接結合自由能最低的構象作為最佳構象進行分析。苯甲酸與酪氨酸酶關鍵殘基的作用機理如圖4所示。由苯甲酸與受體的結合模型可推測其他抑制劑作為底物占據酶活性中心的作用機理。

圖4 苯甲酸與酪氨酸酶活性中心結合構象Fig.4 Conformation of benzoic acid combined with active sites of tyrosinase

3 討 論

在酪氨酸酶對接研究中，Cu電荷數的設置對苯甲酸類抑制劑自由能的影響很大。Cu是穩定酶活性中心和進行催化反應的重要輔助因子，設置較大的Cu電荷數，能夠提高抑制劑與受體的親和力，使對接結合自由能更小，根據Cu離子的氧化價態為＋2，將對接的Cu電荷數設為2.0，并獲得了較好的對接結果。13 種苯甲酸類似物對接結合自由能與抑制劑實驗測定的抑制活性具有較好的線性相關性，基本能夠反映抑制劑與酶結合力越大，對酶活性抑制作用越強。對接研究中曾以多種酪氨酸酶抑制劑與2y9x結構對接，發現若不按抑制劑的結構類似性分類研究，對接結合自由能與pIC50無統計學上的相關性。苯甲酸類化合物的羧基具有絡合作用，可能與酪氨酸酶的銅離子形成絡合物，抑制酶的活性[22]。抑制劑與酶對接結合自由能越小，結合能力越強，抑制效果更明顯，則實驗測得的IC50越大。

AutoDock 4.2軟件在進行構象搜索時使用的是半經驗打分函數，對接結合自由能考慮因素有范德華力、氫鍵、靜電作用力、去溶劑化和扭轉作用能。肉桂酸是苯丙烯酸類化合物，其結構與苯甲酸相似，因苯環上的碳鏈延長，可旋轉的鍵增多，與酶的親和力更強，對接結合自由能較苯甲酸要小，相應IC50也較小。而3,4-二羥基肉桂酸與酪氨酸酶的天然底物L-多巴（3,4-二羥基苯丙氨酸）結構非常類似，其IC50在13 種苯甲酸類似物中最小，表現出非常強的酶活性抑制作用，而通過AutoDock 4.2對接得到的結合自由能亦是最小。酪氨酸酶非競爭性抑制劑4-氟苯甲酸、4-氯苯甲酸、4-溴苯甲酸的結合自由能與pIC50相關性很好，鹵素原子的電負性越小，IC50越低，結合自由能值越小，其機理可能是酶催化時在底物與氧之間形成氫氧橋，鹵素原子能影響氫氧橋的形成[23]，且鹵素原子的電負性越小，鹵代烴的活性越強，抑制效果越好，與AutoDock 4.2的對接結果一致。

iGEMDOCK 2.1軟件打分時考慮范德華力、氫鍵和靜電作用力，苯甲酸及其類似物與酪氨酸酶的對接結果顯示范德華力約占對接總能量的60%。但iGEMDOCK 2.1對接結合自由能與pIC50的線性相關性不高。

本研究采用AutoDock 4.2軟件，通過添加Cu并調整其電荷數，成功將苯甲酸及其類似物等13 種抑制劑與酪氨酸酶進行分子對接，發現對接結合自由能與抑制劑實驗測定的抑制活性具有較好的線性相關性，可用于結構相似的同類化合物中活性預測和相互作用分析。相比而言，iGEMDOCK 2.1軟件在本研究所采用的13 種抑制劑中的對接結果與實驗測定活性的相關性不如AutoDock 4.2。因此，在虛擬分子對接中應根據具體的體系和需要，選擇適宜的對接軟件。

[1] 李娜, 魯曉翔. 酪氨酸酶抑制劑的研究進展[J]. 食品工業科技, 2010, 31(7): 406-409.

[2] 鄭宗平, 蘭山, 秦川, 等. 天然酪氨酸酶抑制劑研究進展: 種類及其構效關系[J]. 食品工業科技, 2014, 35(8): 374-378.

[3] 畢云楓, 宋鳳瑞, 劉志強. 天然酪氨酸酶抑制劑的種類及其對酪氨酸酶抑制作用的研究進展[J]. 吉林大學學報(醫學版), 2014, 40(2): 454-459. DOI:10.13481/j.1671-587x.20140247.

[4] KHAN M T H. Molecular design of tyrosinase inhibitors: a critical review of promising novel inhibitors from synthetic origins[J]. Pure and Applied Chemistry, 2007, 79(12): 2277-2295. DOI:10.1351/ pac200779122277.

[5] KANADE S R, SUHAS V L, CHANDRA N, et al. Functional interaction of diphenols with polyphenol oxidase[J]. FEBS Journal, 2007, 274(16): 4177-4187. DOI:10.1111/j.1742-4658.2007.05944.x.

[6] YANG J M, CHEN C C. GEMDOCK: a generic evolutionary method for molecular docking[J]. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 2004, 55(2): 288-304. DOI:10.1002/prot.20035.

[7] ISMAYA W T, ROZEBOOM H J, WEIJN A, et al. Crystal structure of Agaricus bisporus mushroom tyrosinase: identity of the tetramer subunits and interaction with tropolone[J]. Biochemistry, 2011, 50(24): 5477-5486. DOI:10.1021/bi200395t.

[8] 朱杰華, 宋勝玉, 谷萬港. 基于結構的HIV-1整合酶抑制劑的虛擬篩選[J]. 中國生物制品學雜志, 2014, 27(1): 78-81.

[9] 張海玲, 光翠娥, 江波, 等. 皂苷類似物與腎素的分子對接和結合能分析[J]. 食品與生物技術學報, 2014, 33(10): 1056-1062. DOI:10.3969/j.issn.1673-1689.2014.10.008.

[10] 陳清西, 林建峰, 宋康康. 酪氨酸酶抑制劑的研究進展[J]. 廈門大學學報(自然科學版), 2007, 46(2): 274-282. DOI:10.3321/ j.issn:0438-0479.

[11] YIN S J, SI Y X, CHEN Y F, et al. Mixed-type inhibition of tyrosinase from agaricus bisporus by terephthalic acid: computational simulations and kinetics[J]. Protein Journal, 2011, 30(4): 273-280. DOI:10.1007/ s10930-011-9329-x.

[12] KHATIB S, NERYA O, MUSA R, et al. Enhanced substituted resorcinol hydrophobicity augments tyrosinase inhibition potency[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2007, 50(11): 2676-2681. DOI:10.1021/jm061361d.

[13] 李偉. 蛋白質配體結合位點柔性的系統分析及分子柔性對接方法的發展和應用[D]. 北京: 北京協和醫學院, 2012: 78-107.

[14] SENDOVSKI M, KANTEEV M, BEN-YOSEF V S, et al. First structures of an active bacterial tyrosinase reveal copper plasticity[J]. Journal of Molecular Biology, 2011, 405(1): 227-237. DOI:10.1016/ j.jmb.2010.10.048.

[15] 劉文, 蔣世云, 李強, 等. 酚類抑制劑抗5-脂氧合酶的分子對接研究[J]. 生物技術通訊, 2012, 23(4): 527-531. DOI:10.3969/ j.issn.1009-0002.

[16] 偉堯, 朱琛, 張卓, 等. 硝基咪唑類似物作為尿素酶抑制劑的分子對接研究[J]. 揚州大學學報(農業與生命科學版), 2010(2): 6-9; 95.

[17] 張麗娟. 苯甲酸類似物對酪氨酸酶的效應及其抑菌作用[D]. 廈門:廈門大學, 2006: 52-76.

[18] 林建成, 邱凌, 張麗娟, 等. 茴香醛與茴香酸對蘑菇酪氨酸酶單酚酶的抑制作用[J]. 廈門大學學報(自然科學版), 2007(2): 254-257. DOI:10.3321/j.issn:0438-0479.

[19] 張春樂. 抑制劑對蘑菇氨酸的抑制效應及抗菌活性[D]. 廈門: 廈門大學, 2007: 30-48.

[20] 龔盛昭, 楊卓如, 程江. 肉桂酸抑制酪氨酸酶催化反應的動力學研究[J]. 高校化學工程學報, 2007, 21(2): 345-349. DOI:10.3321/ j.issn:1003-9015.

[21] 閆軍, 李昌生, 陳聲利, 等. 咖啡酸, 阿魏酸和香草酸對酪氨酸酶活性的影響[J]. 中國臨床藥理學與治療學, 2004, 9(3): 337-339. DOI:10.3969/j.issn.1009-2501.

[22] 鄒先偉, 蔣志勝. 植物源酪氨酸酶抑制劑研究進展[J]. 中草藥, 2004, 35(6): 702-705. DOI:10.3321/j.issn:0253-2670.

[23] WANG Q, SHI Y, SONG K K, et al. Inhibitory effects of 4-halobenzoic acids on the diphenolase and monophenolase activity of mushroom tyrosinase[J]. Protein Journal, 2004, 23(5): 303-308. DOI:10.1023/ B:JOPC.0000032649.60933.58.

Molecular Docking of Benzoic Acid and Its Analogues with Tyrosinase

LI Muzi1, WANG Qinghua2,*, WANG Xiaoyi1, HE Yun1
(1. School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China; 2. School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

Benzoic acid and its 12 analogues were docked with tyrosinase by using AutoDock 4.2 and iGEMDOCK 2.1 software, respectively. The linear correlation between docking binding free energy and experimental inhibitory activity of benzoic acid analogues was studied. The results from AutoDock 4.2 showed that the change in Cu charge had a significant effect on binding free energy, and the linear correlation coefficient between binding free energy and pIC50was up to 0.803 6 when Cu charge was 2.0, but the linear correlation coefficient from iGEMDOCK 2.1 was poor. The prediction capacity of AutoDock 4.2 was more reliable than that of iGEMDOCK 2.1.

tyrosinase; benzoic acid; inhibitors; molecular docking

10.7506/spkx1002-6630-201603017

Q74

A

1002-6630（2016）03-0087-04

李慕紫, 王慶華, 王曉藝, 等. 苯甲酸及其類似物與酪氨酸酶分子對接研究[J]. 食品科學, 2016, 37(3): 87-90. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603017. http://www.spkx.net.cn

LI Muzi, WANG Qinghua, WANG Xiaoyi, et al. Molecular docking of benzoic acid and its analogues with tyrosinase[J]. Food Science, 2016, 37(3): 87-90. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603017. http://www.spkx.net.cn

2015-04-20

李慕紫（1992—），女，碩士研究生，主要從事中藥活性成分研究與新藥開發。E-mail：muzilee_12@163.com

*通信作者：王慶華（1969—），男，教授，碩士，主要從事生物化學與分子生物學研究。E-mail：wqhwj@163.com