超聲波處理對北五味子多糖抗氧化活性的影響

汪艷群，孟憲軍

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

超聲波處理對北五味子多糖抗氧化活性的影響

汪艷群，孟憲軍

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

利用超聲波對北五味子多糖進行改性，從而提高其抗氧化活性。以羥自由基（·OH）及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為指標，考察了超聲波處理功率、超聲波處理時間對北五味子多糖抗氧化活性的影響。結果表明：超聲波處理功率、處理時間對北五味子多糖抗氧化活性有顯著影響。最佳超聲波處理功率為330 W、處理時間為20 min。經此條件處理后，·OH清除率由74.34%提高到87.05%，半抑制濃度（IC50）為10.7 mg/mL；DPPH自由基清除率由84.43%提高到95.05%，IC50＜2 mg/mL。適當的超聲波處理可以提高北五味子多糖的抗氧化活性。

北五味子；多糖；抗氧化；超聲波

五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.）又名五梅子、玄及、會及、山花椒等，木蘭科多年生落葉藤本。五味子為藥食兩用物質，其應用已有2 000多年的歷史，被列為新資源食品，可用于生產藥品、保健品、化妝美容品和多種飲品、食品添加劑等。20世紀90年代以來，許多學者從五味子水提液中分離得到了多糖，已經發現五味子多糖具有保肝、抗疲勞、增強免疫系統功能、清除氧自由基、抗衰老、降血糖、降血脂等生理活性[1-5]。近年來，多糖的生物活性和化學多樣性引起關注。多糖結構復雜，適當的結構改變能提高多糖的生物活性。多糖改性的方法有化學、物理和生物手段[6]。超聲波處理是近年來新興的一種改性方法，其通過超聲空化作用引起的機械效應、熱效應和水分子裂解產生的自由基效應對多糖的結構產生影響，從而改變多糖的生物活性[7]。與其他改性方法相比，超聲波處理具有節能省時，無化學試劑和有機溶劑污染等優點[8]。目前，針對北五味子多糖進行改性的研究報道較少。本研究將純化后的北五味子多糖用超聲波處理，對其進行改性，考察超聲波處理對其體外抗氧化活性的影響，為提高北五味子多糖生物活性提供理論依據和借鑒，為超聲波在多糖改性中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北五味子干果由遼寧遼陽五味子種植基地提供，沈陽藥科大學中藥學院天然藥化教研室鑒定為木蘭科植物五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.）的干燥果實。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；玻璃層析柱、HL-2恒流泵 上海青浦滬西儀器廠；透析袋（截留分子質量為14 000 u） 上海蓮冠生物化工有限公司；GDC-TQ/ZS/4中試型智能控制超聲波多功能提取機組 濟寧金百特生物機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 北五味子多糖的分離純化工藝流程

北五味子干果→破碎→40 目篩→水提→乙醇沉淀→乙醚、丙酮洗滌→脫蛋白→聚酰胺柱層析→透析→冷凍干燥→北五味子精多糖備用

稱取一定量五味子粉末按照料液比為1∶40（m/V）、提取時間為5 h、提取溫度為90 ℃進行提取。提取后用旋轉蒸發儀將濾液濃縮至原體積的約1/5，加4 倍于提取液體積的95%乙醇，攪拌均勻后4 ℃條件下靜置12 h。將靜置液抽濾，所得沉淀用乙醚、丙酮、無水乙醇依次洗滌，濾干。將上述粗多糖配成20%的粗多糖溶液，將三氯乙酸-正丁醇溶液（1∶10，V/V）與粗多糖溶液等體積混合，移入分液漏斗中振蕩10 min后靜置1 h，分液取下層溶液，再與三氯乙酸-正丁醇溶液等體積混合，如此重復4 次。脫蛋白后進行聚酰胺柱層析，上樣體積500 mL，多糖質量濃度為2 mg/mL，流速1.2 mL/min，蒸餾水洗脫，收集洗脫液。洗脫10 h后將收集的組分真空濃縮，凍干后再進行一次柱層析。之后進行透析，自來水流水透析3 d，蒸餾水透析2 d，每3～4 h換一次蒸餾水，透析后冷凍干燥得白色絮狀北五味子精多糖，備用。

1.3.2 超聲波處理對北五味子多糖抗氧化活性的影響

1.3.2.1 超聲波處理功率對北五味子多糖抗氧化活性的影響

超聲波頻率為28.5 kHz，處理時間為20 min，北五味子多糖質量濃度為10 mg/mL。采用功率為0、220、330、440、550、660 W的超聲波分別處理20 min，測定其清除羥自由基（·OH）的能力。

超聲波處理功率對北五味子多糖清除DPPH自由基活性影響實驗：設定北五味子多糖質量濃度為2 mg/mL，其他處理條件相同。實驗重復3 次。

1.3.2.2 超聲波處理時間對北五味子多糖抗氧化活性的影響

超聲波頻率為28.5 kHz，功率為330 W，北五味子多糖質量濃度為10 mg/mL。超聲波分別處理0、2.5、5、10、20、40 min，測定其清除·OH的能力。

超聲波處理時間對北五味子多糖清除DPPH自由基活性影響實驗：設定北五味子多糖質量濃度為2 mg/mL，其他處理條件相同。實驗重復3 次。

1.3.2.3 超聲波最佳條件處理后北五味子多糖抗氧化活性的測定

超聲波頻率為28.5 kHz，功率為330 W，處理時間為20 min。北五味子多糖溶液質量濃度分別為2.5、5、10、15、20 mg/mL，處理后測定其清除·OH的能力。

設定北五味子多糖溶液質量濃度分別為2、4、6、8、10 mg/mL，其他處理條件相同，對清除DPPH自由基的能力進行測定。對照為未經超聲波處理的北五味子多糖。實驗重復3 次。

1.3.3 抗氧化活性的測定[9]

1.3.3.1 ·OH清除能力的測定

取1.5 mmol/L鄰二氮菲溶液1.0 mL，加0.2 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL，充分混勻后，加1.5 mmol/L硫酸亞鐵溶液1.0 mL，加入樣品溶液1.0 mL，每加一管立即混勻，加質量分數為0.01% H2O2溶液1.0 mL。整個反應體系體積共6 mL。反應在37 ℃條件下恒溫水浴鍋中進行，準確反應1 h后，在536 nm波長處測定吸光度，記為AX。損傷組中用1.0 mL去離子水代替樣品溶液；未損傷組中用2.0 mL去離子水代替樣品溶液和H2O2溶液。以VC作為參照物。按式（1）計算樣品對·OH的清除率。

式中：AX為樣品組吸光度；A0為未損傷組吸光度；A1為損傷組吸光度。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力的測定

在2 mL 2×10－4mol/L的DPPH乙醇溶液中加入2 mL樣品溶液，混勻后避光反應30 min，在517 nm波長處測定吸光度AX。對照組A1中用2 mL去離子水代替樣品溶液，對照組A2中用2 mL無水乙醇代替2 mL DPPH乙醇溶液。以VC為參照物。按式（2）計算樣品對DPPH自由基的清除率。

1.4 數據統計分析

采用Excel 2013處理軟件，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 超聲波處理對北五味子多糖抗氧化活性的影響

2.1.1 超聲波處理功率對北五味子多糖抗氧化活性的影響

圖2 超聲波處理功率對北五味子多糖清除DPPH自由基活性的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from Schisandra chinensis

由圖1可知，超聲波處理顯著增強了北五味子多糖清除·OH的活性，超聲波功率在330 W時，多糖的·OH清除率最高，達到48.63%，功率超過330 W后，·OH清除率緩慢下降，趨于平穩。由圖2可知，超聲波功率在330 W時對DPPH自由基的清除率最大，隨后緩慢下降，直至趨于平穩，并且超聲波處理對北五味子多糖清除DPPH自由基活性的增強作用更顯著，功率為220 W時，清除率就達到71.70%，未經超聲波處理的多糖，其清除率為63.03%。這可能是由于適宜功率的超聲波處理有利于北五味子多糖的適度降解和溶解度的提高[10]，增強DPPH自由基清除能力；功率太大又可能引起多糖分子交聯，使其抗氧化活性降低[11]。超聲波對聚合物的降解作用與超聲聲強、處理時間、溫度等有關，一般來說，超聲波功率越大超聲聲強越高，通常超聲聲強越高，降解作用越強，但達到一定程度后，進一步增強聲強，降解作用增強不明顯，這在Zhong Kui等[12]對裂褶菌胞外多糖，Zhang Lifen[13]和Sun Yujing[14]等對蘋果果膠、全反式-β-胡蘿卜素的超聲波降解研究中均有報道。因此，選擇超聲波處理功率為330 W，對提高五味子多糖的抗氧化活性較為適宜。

2.1.2 超聲波處理時間對北五味子多糖抗氧化活性的影響

圖3 超聲波處理時間對北五味子多糖清除·OH活性的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on hydroxyl radical scavenging activity of polysaccharides from Schisandra chinensis

圖4 超聲波處理時間對北五味子多糖清除DPPH自由基活性的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from Schisandra chinensis

由圖3、4可知，當超聲波處理時間在20 min內時，隨超聲波處理時間的延長，北五味子多糖對·OH的清除率提高，0～20 min時，·OH清除率從42.91%上升到48.30%，DPPH自由基清除率從63.03%上升到72.15%；之后，隨超聲波處理時間的延長，自由基清除率趨于穩定。超聲波處理可以使多糖降解，分子質量和黏度降低，一般單糖組成和糖苷鍵類型不發生變化[15]，也沒有支鏈反應的發生[16]，還有報道超聲波處理使多糖α-螺旋數量增多[15]，這些變化可能與改性后的多糖抗氧化活性、抑制腫瘤細胞增殖活性提高有關[15,17-18]。也有研究表明，多糖鏈的降解存在最低降解分子質量（Mmin，即超聲波不能對其進行降解的低多糖分子質量）[19]。因此，推測在固定超聲波功率為330 W的情況下，20 min的處理時間已使多糖長鏈能發生的斷裂基本完成，分子質量的降低有助于自由基清除率的提高；進一步延長處理時間，已經斷裂的多糖鏈不再變化，故而清除率趨于穩定。合理控制超聲波處理時間，在一定程度上可以提高五味子多糖清除自由基的活性。

2.1.3 超聲波最佳條件處理后北五味子多糖的抗氧化活性

圖5 北五味子多糖質量濃度對其清除·OH活性的影響Fig.5 Effect of polysaccharide concentration on hydroxyl radical scavenging activity of polysaccharides from Schisandra chinensis

由圖5可知，在實驗質量濃度范圍內，所有的北五味子多糖溶液都表現出明顯的自由基清除能力，并且隨北五味子多糖質量濃度的上升，·OH的清除率隨之提高，表現出了明顯的劑量依賴性。經超聲波處理后的北五味子多糖其·OH清除能力較未經超聲波處理的多糖顯著提高（P＜0.05），且二者的·OH清除率均高于VC對照組。經超聲波處理后的北五味子多糖其·OH清除率最高為87.05%，IC50為10.7 mg/mL；未經超聲波處理的五味子多糖其·OH清除率最高為74.34%，IC50為13.2 mg/mL。

DPPH自由基是一種很穩定的以氮為中心的自由基，廣泛用于各種抗氧化劑清除自由基能力的研究中。抗氧化劑通過轉移傳遞電子或氫原子給DPPH來中和其自由基。因此，對DPPH自由基的清除效果可以反映抗氧化劑的供氫能力[20]。由圖6可知，北五味子多糖具有很強的DPPH自由基清除能力，未經超聲波處理的北五味子多糖，和超聲波處理后的多糖在質量濃度為2 mg/mL條件下其DPPH自由基清除率即可達到63.03%和72.72%，這提示北五味子多糖可能具有較強的供氫能力，但二者的清除能力均不如VC對照組。當質量濃度為10 mg/mL時，超聲波處理可以顯著提高北五味子多糖清除DPPH自由基能力，DPPH自由基清除率由84.43%提高到95.05%。

圖6 北五味子多糖質量濃度對其清除DPPH自由基活性的影響Fig.6 Effect of polysaccharide concentration on DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from Schisandra chinensis

超聲波處理能提高多糖的抗氧化活性，這與王振斌等[11]對無花果多糖，Zhang Henan等[18]對桑黃菌絲體多糖，李岱等[21]對柴胡多糖，Yang Bao等[22]對龍眼果皮多糖，涂宗財等[23]對荷葉多糖，嚴碧歌等[24]對麥冬多糖的研究結果均一致。超聲波處理能提高北五味子多糖的自由基清除能力，推測與多糖內能引起抗氧化活性的分子內氫鍵有關。據報道，高分子質量的殼聚糖結構致密，導致能引起羥基和氨基活性的分子內氫鍵的作用變弱；而低分子質量的殼聚糖結構松散，對分子內氫鍵的影響就相對溫和[25]。超聲波處理使五味子多糖發生降解，將高分子質量的多糖變為分子質量低一些的大小適宜的碎片，使其對氫鍵的影響減小，從而表現出更顯著的抗氧化活性。

3 結 論

適當的超聲波處理可以顯著提高北五味子多糖的抗氧化活性。超聲波處理功率、處理時間對多糖抗氧化活性有顯著影響（P＜0.05）。在實驗參數范圍內，最佳超聲波處理功率為330 W，處理時間為20 min。經此條件處理后，·OH清除率最高，為87.05%，IC50為10.7 mg/mL；DPPH自由基清除率最大，可達到95.05%，IC50＜2 mg/mL。

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Effect of Ultrasonic Treatment on Antioxidant Activity of Polysaccharides from Mature Fruits of Schisandra chinensis

WANG Yanqun, MENG Xianjun
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Ultrasonic treatment was employed to improve the antioxidant activity of polysaccharides from the mature fruits of Schisandra chinensis. Based on hydroxyl and DPPH radical scavenging activity, the effects of ultrasonic power and treatment time on antioxidant activity of polysaccharides were studied. The results showed that both ultrasonic power and treatment time had significant effects on the antioxidant activity of polysaccharides. The optimal conditions of ultrasonic treatment were 330 W of ultrasonic power, 20 min of treatment time. Under these conditions, the scavenging rates of hydroxyl and DPPH radicals were increased from 74.34% to 87.05%, and from 84.43% to 95.05%, respectively. The IC50of the treated polysaccharides for scavenging of hydroxyl and DPPH radicals were 10.7 and less than 2 mg/mL, respectively. In conclusion, appropriate ultrasonic treatment can improve the antioxidant activity of polysaccharides from Schisandra chinensis fruits.

Schisandra chinensis; polysaccharides; antioxidant activity; ultrasonic treatment

10.7506/spkx1002-6630-201603013

TS201

A

1002-6630（2016）03-0066-05

汪艷群, 孟憲軍. 超聲波處理對北五味子多糖抗氧化活性的影響[J]. 食品科學, 2016, 37(3): 66-70. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201603013. http://www.spkx.net.cn

WANG Yanqun, MENG Xianjun. Effect of ultrasonic treatment on antioxidant activity of polysaccharides from mature fruits of Schisandra chinensis[J]. Food Science, 2016, 37(3): 66-70. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603013. http://www.spkx.net.cn

2015-08-24

沈陽農業大學青年教師科研基金項目（20121005）

汪艷群（1980—），女，講師，博士，研究方向為小漿果加工及植物活性成分。E-mail：syauwyq@163.com