2種胃膜素制備方法比較

楊先炯

(貴州醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng) 550004)

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2種胃膜素制備方法比較

楊先炯

(貴州醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng) 550004)

[目的]比較分析制備胃膜素的2種方法，優(yōu)化制備方法，為工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)提供試驗(yàn)依據(jù)。[方法]以豬胃黏膜為材料，采用單產(chǎn)工藝和聯(lián)產(chǎn)工藝提取胃膜素，比較分析2種制備方法所得胃膜素的性狀、得率、總氮含量和還原性物質(zhì)含量的差異。[結(jié)果] 2種方法提取的胃膜素在黏度、酸度、干燥失重和熾灼殘?jiān)确矫娌町惒淮螅偟亢瓦€原性物質(zhì)含量也無(wú)明顯差異，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。單產(chǎn)工藝胃膜素得率較高，平均達(dá)3.5%，聯(lián)產(chǎn)工藝得率偏低，僅有1.7%，但聯(lián)產(chǎn)工藝可以得到副產(chǎn)品胃蛋白酶。[結(jié)論]單產(chǎn)工藝的得率高于聯(lián)產(chǎn)工藝，聯(lián)產(chǎn)工藝可以同時(shí)得到副產(chǎn)品。

胃膜素；制備方法；單產(chǎn)工藝；聯(lián)產(chǎn)工藝

黏蛋白是一類主要由黏多糖組成的高分子量糖蛋白，屬于成分、結(jié)構(gòu)均比較復(fù)雜的結(jié)合蛋白質(zhì)，主要分布于消化道、呼吸道、泌尿生殖道等機(jī)體管腔內(nèi)表面，特別是胃腸道中。胃腸道中的黏蛋白種類很多，從胃黏液中分離出來(lái)的黏蛋白相對(duì)分子質(zhì)量高達(dá)2×106D。研究證實(shí)，黏蛋白對(duì)上皮細(xì)胞起重要的保護(hù)和潤(rùn)滑作用，黏蛋白還能參與上皮細(xì)胞的分化、更新，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，甚至與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及演進(jìn)、愈后的關(guān)系密切，在各種生理、病理過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[1]。因此，黏蛋白的研究及應(yīng)用越來(lái)越受到人們的重視。

胃膜素又稱胃黏膜素，是從豬胃黏膜中提取的一種以黏蛋白為主要成分的生化藥物，有抗胃蛋白酶分解和弱抗酸作用，能在胃內(nèi)形成保護(hù)膜，覆蓋潰瘍面，減少胃酸的刺激，有利于潰瘍面的愈合，在胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等多種胃腸道疾病的治療方面有顯著的療效[2]。目前，常用的胃膜素制備方法有2種：一種是乙醇沉淀法即單產(chǎn)工藝，得到的產(chǎn)品只有胃膜素；另一種是丙酮分級(jí)沉淀法即聯(lián)產(chǎn)工藝，除得到胃膜素外，可同時(shí)獲得附屬產(chǎn)品胃蛋白酶。該研究利用生物化學(xué)試驗(yàn)技術(shù)，以豬胃黏膜為材料，分別采用單產(chǎn)工藝和聯(lián)產(chǎn)工藝提取胃膜素，計(jì)算2種方法提取胃膜素的得率，然后對(duì)胃膜素的總氮含量和還原性物質(zhì)含量進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)2種制備方法所得胃膜素進(jìn)行比較分析，為胃膜素的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供試驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料新鮮豬胃，重慶靖康生物技術(shù)有限公司。鹽酸、乙醇、丙酮、氯仿等常規(guī)無(wú)機(jī)化學(xué)試劑，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司。電熱干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；電子天平，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；組織搗碎機(jī)，金壇市醫(yī)療儀器廠；全自動(dòng)血液流變快測(cè)儀，重慶維多生物科技有限公司；KDN-04CⅡ定氮儀，上海精隆科學(xué)儀器有限公司；其他常規(guī)玻璃器皿及耗材，購(gòu)于重慶化玻公司。

1.2方法

1.2.1材料處理。取新鮮豬胃，洗凈、剝離胃黏膜，用組織搗碎機(jī)將其搗碎。

1.2.2單產(chǎn)工藝流程(乙醇沉淀法)。取搗碎的胃黏膜漿50 g 于燒杯中，用2 mol/L鹽酸調(diào)pH至3.0～3.5，加入少量氯仿。用保鮮膜密封燒杯口，于45 ℃水浴中消化4 h，雙層紗布過(guò)濾，除去未消化雜質(zhì)。用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)消化液pH至4.0～5.0，在攪拌下加入無(wú)水乙醇，使其含量為70%，放入4 ℃冰箱中靜置12 h。取出、過(guò)濾，收集沉淀并盡量壓干，按所得沉淀重量的2倍加入70%乙醇，充分混勻、洗滌2次，壓干沉淀，在70 ℃干燥箱中烘干，得到胃膜素粗品。再用乙醚脫脂，于50 ℃干燥箱中烘干，研碎，即得胃膜素成品。其簡(jiǎn)要流程如圖1。

圖1　單產(chǎn)工藝流程Fig.1　Process flow of single production method

1.2.3聯(lián)產(chǎn)工藝流程(丙酮沉淀法)。稱取一定量的胃黏膜漿于燒杯中，加入2 mol/L鹽酸調(diào)pH至2.5～3.0，于45 ℃水浴中攪拌消化3～4 h，雙層紗布過(guò)濾，消化液于5.0 ℃以下靜置過(guò)夜，次日攪拌下緩慢加入冷至5.0 ℃的丙酮，使液體相對(duì)密度達(dá)0.94～0.96，析出沉淀，雙層紗布過(guò)濾(收集濾液備用)，得胃膜素粗品。再用70%乙醇洗滌，70 ℃干燥，乙醚脫脂2次，烘干，研碎，即得胃膜素成品。取沉淀胃膜素后的母液在攪拌下補(bǔ)加冷至5 ℃的丙酮，使液體相對(duì)密度達(dá)0.89～0.91，靜置沉淀4 h，收集沉淀，于真空干燥器中70 ℃以下干燥，磨碎，得胃蛋白酶成品。簡(jiǎn)要流程如圖2。

圖2　聯(lián)產(chǎn)工藝流程Fig.2　Process flow of joint production method

1.2.4產(chǎn)品得率計(jì)算。產(chǎn)品得率是指所取的胃黏膜漿經(jīng)提取得到的胃膜素成品占胃黏膜漿標(biāo)準(zhǔn)重量的百分比，其計(jì)算公式為產(chǎn)品得率=胃膜素成品重量/胃黏膜漿 ×100%。

1.2.5粘度、酸度、干燥失重和熾灼殘?jiān)治觥Ｈ∷梦改に貥悠罚执渭铀⒀袆颍瞥?0 mg/mL的供試溶液，采用全自動(dòng)血液流變快測(cè)儀測(cè)量其黏度。在酸度分析中，取胃膜素樣品0.5 g，加水溶解定容至50 mL，測(cè)定其pH。在干燥失重分析中，取一定量的供試品，干燥至恒重，從減失的重量和取樣量計(jì)算供試品的干燥失重。在熾灼殘?jiān)治鲋校∫欢康墓┰嚻分糜谝褵胱浦梁阒氐嫩釄逯校?005 版《中華人民共和國(guó)藥典》(第二部)[3]進(jìn)行熾灼殘?jiān)治觯慈缦鹿接?jì)算樣品的熾灼殘?jiān)浚簾胱茪堅(jiān)?(殘?jiān)佰釄逯?空坩堝重)/(供試品重)×100%。

1.2.6總氮含量測(cè)定。精確稱取一定量樣品，按照2005 版《中華人民共和國(guó)藥典》(第二部)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)[3]，參照文獻(xiàn)[4]的方法，采用KDN-04CⅡ型定氮儀測(cè)定樣品總氮含量。

1.2.7還原性物質(zhì)分析。按照2005 版《中華人民共和國(guó)藥典》(第二部)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)[3]，精確稱取一定量樣品，參照文獻(xiàn)[5]的方法，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硫代硫酸鈉滴定法測(cè)定樣品還原性糖的含量，以表征樣品中還原性物質(zhì)含量。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Student’s t-test 分析兩組數(shù)據(jù)之間的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1胃膜素成品得率單產(chǎn)和聯(lián)產(chǎn)工藝2種方法提取的胃膜素均為黃褐色粉末，具有蛋白胨樣肉臭味。單產(chǎn)工藝胃膜素的平均得率達(dá)3.5%，聯(lián)產(chǎn)工藝的平均得率僅有1.7%，明顯低于單產(chǎn)工藝(P<0.05)，但聯(lián)產(chǎn)工藝可以同時(shí)得到附屬產(chǎn)品胃蛋白酶。

2.2胃膜素質(zhì)量指標(biāo)測(cè)定2種工藝得到的胃膜素的黏度、酸度、干燥失重和熾灼殘?jiān)l(fā)現(xiàn)，單產(chǎn)工藝胃膜素的黏度為3.2，酸度為4.3，干燥失重和熾灼殘?jiān)謩e為4.3%和4.8%；聯(lián)產(chǎn)工藝所得胃膜素的黏度為3.4，酸度為4.5，干燥失重和熾灼殘?jiān)謩e為4.2%和4.5%。可見，2種工藝提取的胃膜素的質(zhì)量指標(biāo)沒(méi)有明顯差異，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

2.3胃膜素總氮含量測(cè)定2種工藝得到的胃膜素的總氮含量發(fā)現(xiàn)，單產(chǎn)工藝和聯(lián)產(chǎn)工藝所得胃膜素的總氮含量平均值分別為8.13%和8.10%，兩者比較沒(méi)有明顯差異，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

2.4胃膜素還原物質(zhì)含量測(cè)定2種工藝得到的胃膜素的還原物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，單產(chǎn)工藝和聯(lián)產(chǎn)工藝所得胃膜素的還原糖含量平均值分別為26.75%和27.90%，兩者比較沒(méi)有明顯差異，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

3　討論與結(jié)論

由于胃膜素對(duì)胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等胃腸道疾病有顯著的療效，近年來(lái)，胃膜素的研究開發(fā)及臨床應(yīng)用越來(lái)越受到人們的重視。目前，從豬胃黏膜中提取仍然是胃膜素的主要來(lái)源，人們對(duì)從豬胃黏膜中提取胃膜素的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，采用乙醇沉淀法可以較好地從豬胃黏膜中得到胃膜素。除了胃膜素外，豬胃黏膜中還含有胃蛋白酶等蛋白水解酶，可分別采取2個(gè)單產(chǎn)工藝從豬胃黏膜中提取胃膜素和胃蛋白酶。為了提高提取效率、降低成本，人們將2個(gè)單產(chǎn)工藝整合成采用丙酮沉淀的聯(lián)產(chǎn)工藝，可同時(shí)得到胃膜素和胃蛋白酶[6]，但2種工藝所得胃膜素的差異還不太清楚。

該研究對(duì)單產(chǎn)和聯(lián)產(chǎn)2種工藝提取胃膜素的得率進(jìn)行了比較分析，并對(duì)所得胃膜素進(jìn)行了定性和相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種工藝所得胃膜素的性狀無(wú)明顯差異，在黏度、酸度、干燥失重和熾灼殘?jiān)确矫娌町惒淮螅_(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。2種工藝所得胃膜素的總氮含量均小于10.0%，還原物質(zhì)含量均大于20.0%，2組產(chǎn)品比較沒(méi)有明顯差異，均符合《化藥部頒標(biāo)準(zhǔn)》中的標(biāo)準(zhǔn)，表明2種工藝條件對(duì)從豬胃黏膜中提取胃膜素是可行的。在產(chǎn)品得率方面，2種工藝顯示出較大差異，單產(chǎn)工藝胃膜素的得率明顯高于聯(lián)產(chǎn)工藝，但聯(lián)產(chǎn)工藝同時(shí)得到了另一種產(chǎn)品胃蛋白酶。與其他研究報(bào)道的得率比較[7]，該研究單產(chǎn)工藝的得率稍低，可能與該研究沒(méi)有對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化有關(guān)。

綜上所述，在從豬胃黏膜中提取胃膜素的研究開發(fā)中，聯(lián)產(chǎn)工藝可同時(shí)得到胃膜素和胃酶，應(yīng)該是工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的主要發(fā)展方向，但目前該工藝胃膜素的得率不高。因此，如何優(yōu)化聯(lián)產(chǎn)工藝條件以提高胃膜素得率，將是胃膜素分離提取研究的重要環(huán)節(jié)。

[1] 彭志紅，汪榮泉.粘蛋白研究進(jìn)展[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2010，19(10)：952-955.

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Comparative Study of Two Methods for Gastric Mucin Preparation

YANG Xian-jiong

(Department of Chemistry, Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou 550004)

[Objective] To compare the two methods for gastric mucin preparation, to optimize preparation method, and to provide

in gastric mucin industrialization-scale production. [Method] With porcine gastric as the research materials, gastric mucin was extracted by single production method and joint production method. Differences in the gastric mucin characters and yield, total nitrogen content and reducing matter content were compared by the two methods. [Result]There were no significant differences in the viscosity, acidity, drying loss and residue on ignition between the two methods. However, there were no significant differences in total nitrogen content and reducing substance content, which all met the national standard. The yield of gastric mucin by single production method was higher than that of joint production method, which were 3.5% and 1.7%, respectively. However, the two production methods could get by-products of pepsin. [Conclusion] The yield rate of single production method is higher than that of joint production method, while joint production method achieves by-products simultaneously.Key wordsGastric mucin; Preparation method; Single production method; Joint production method

楊先炯(1979- )，女，貴州貴陽(yáng)人，副教授，碩士，從事生物化學(xué)研究。

2016-07-27

Q 513

A

0517-6611(2016)27-0142-02