七葉一枝花種子萌發(fā)和組織培養(yǎng)

黃宗華

(廣東培正學(xué)院，廣東廣州 510830)

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七葉一枝花種子萌發(fā)和組織培養(yǎng)

黃宗華

(廣東培正學(xué)院，廣東廣州 510830)

[目的]研究七葉一枝花種子萌發(fā)的最適赤霉素(GA3)濃度和組織培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。[方法]采用不同濃度GA3處理種子，研究促進種子快速萌發(fā)且萌發(fā)率高的GA3濃度，再將胚根3～4 cm長的種子播于土壤中，分別在光照培養(yǎng)箱和自然條件下生長并觀察第一片葉的長勢。采用不同濃度的6-BA誘導(dǎo)愈傷組織，研究愈傷組織誘導(dǎo)的適宜6-BA濃度。[結(jié)果]150 mg/L GA3處理種子的萌發(fā)率最高，種子外植體最合適的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加0.1 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的 1/2MS基本培養(yǎng)基。[結(jié)論]七葉一枝花種子的快速萌發(fā)方法是可行的。

七葉一枝花；種子；萌發(fā)率；愈傷組織

七葉一枝花(Parispolyphylla)為百合科重樓屬多年生草本植物，別名重樓、草河車、七葉蓮等，主要分布于江西、浙江、廣東、四川、貴州等省。七葉一枝花以根莖入藥，具有清熱解毒、消腫止痛等功效，多用于治療無名腫毒和毒蛇咬傷，以及流行性腮腺炎、扁桃體炎、咽喉腫痛等。七葉一枝花種子具有明顯的后熟特點，胚需要休眠完成后熟才能萌發(fā)，在自然條件下經(jīng)過2個冬天才能出土成苗，且成苗率較低[1]。七葉一枝花種子繁殖的關(guān)鍵是打破其休眠，促進生理后熟，使其快速出苗。層積、低溫、赤霉素(GA3)和聚乙二醇(PEG)均能提高種子的萌發(fā)率，打破種子的休眠期，縮短種子出苗時間。

獲得良好的胚性愈傷組織是七葉一枝花組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素。影響七葉一枝花愈傷組織誘導(dǎo)和培養(yǎng)條件的因素主要包括外植體的選擇及預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件及植物激素等。雖然國外學(xué)者對延齡草屬植物的組織培養(yǎng)獲得了成功，誘導(dǎo)出小根莖，但在培養(yǎng)過程中無法誘導(dǎo)出愈傷組織[2]。筆者研究七葉一枝花種子萌發(fā)和組織培養(yǎng)，以期為其大規(guī)模生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1試驗材料供試七葉一枝花成熟種子采集于云南大理，經(jīng)中南民族大學(xué)劉學(xué)群教授鑒定后置于冰箱的密封塑料袋內(nèi)使其腐爛，用水流強的自來水洗去穎殼，用手搓揉種子外種皮并用細孔篩篩去紅色漿果的外種皮，余下白色種子，晾干后人工除殘留物，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2種子萌發(fā)試驗

1.2.1浸種處理。用不同濃度赤霉素(GA3)浸泡七葉一枝花種子24 h，以蒸餾水作為對照，置于20 ℃培養(yǎng)箱。24 h后倒掉溶液，用自來水沖洗種子，直至洗凈殘留液體為止，再用蒸餾水沖洗，無菌條件下處理種子。

1.2.2無菌處理。在超凈工作臺內(nèi)，用無菌水沖洗種子3～5次，然后使用75%乙醇消毒30 s(乙醇回收利用)，無菌水沖洗3～5次，再用0.1%HgCl2浸泡10～15 min(乙醇回收，集中處理)，無菌水沖洗3～5次，最后置于無菌的150 mm帶濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3培養(yǎng)條件。將種子按一定比例埋藏于基質(zhì)濕沙中，然后將其置于4 ℃下處理60 d，再將溫度調(diào)至18～20 ℃放置90 d，再調(diào)至低溫(6～8 ℃)放置60 d，后置于20～22 ℃處理60 d，然后播種在土壤中萌發(fā)，留一個缽子的種子繼續(xù)濕沙層積。種子萌發(fā)的標(biāo)志以胚根剛突破種皮作為標(biāo)準(zhǔn)，萌發(fā)率=萌發(fā)的種子數(shù)/種子總數(shù)×100%[3]。

1.2.4試驗設(shè)計。GA3濃度為100、150和600 mg/L，對照為相同體積的雙蒸水。采用單因素設(shè)計，3次重復(fù)，每次取100粒種子。

1.3種子的組織培養(yǎng)

1.3.1培養(yǎng)基的準(zhǔn)備。基本培養(yǎng)基為1/2MS，添加不同濃度的6-BA(0.1、0.5、0.7、1.0、1.4和2.0 mg/L)和0.5 mg/L NAA，之后分裝在500 mL三角瓶內(nèi)，每瓶裝300 mL，于121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至不燙手時分裝于50 mL已滅菌的三角瓶內(nèi)，每瓶倒30 mL，備用。

1.3.2種子的消毒與接種。在超凈工作臺上用無菌水清洗種子外植體3～5次，然后放入盛有75%乙醇的燒杯中浸泡30 s并輕輕搖晃，后用無菌水清洗3～5次，再用0.1%HgCl2浸泡種子外植體10～15 min(不斷搖晃燒杯，保證所有外植體均勻接觸溶液)，無菌水洗3～5次，最后用無菌濾紙吸干種子表面的水分，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基[4-5]。

1.3.3培養(yǎng)條件。溫度(18±2)℃，濕度70%，光照條件1 000 μmol/(m2·s)，光照時間12 h/d。

2　結(jié)果與分析

2.1濕沙基質(zhì)中種子的萌發(fā)情況濕沙基質(zhì)層積240 d后，將種子播于土壤中萌發(fā)，結(jié)果100 mg/L GA3溶液浸泡48 h種子的萌發(fā)率為95.35%(圖1 a)；150 mg/L GA3溶液浸泡種子48 h的萌發(fā)率為98.51%(圖1 b)；600 mg/L GA3溶液浸泡種子48 h的萌發(fā)率僅為55.81%(圖1 c)，剩余種子均干死，無法得到充足的水分。

濕沙基質(zhì)層積240 d后，將種子留在濕沙基質(zhì)中，繼續(xù)恒溫18 ℃培養(yǎng)，120 d后，種子的胚根已經(jīng)木質(zhì)化發(fā)育成主根，且有3株種子的種殼已經(jīng)脫落，露出包裹的子葉，在每個根莖部位均分化出側(cè)芽；360 d后，胚乳的營養(yǎng)已被逐漸耗盡，種皮漸變成黑色，直至干枯自然脫落，子葉明顯可見(圖1 d)。

注：a.100 mg /L GA3處理,b.150 mg /L GA3處理,c.600 mg /L GA3處理,d.100 mg /L GA3處理后360 d。Note: a.100 mg /L GA3 treatment, b. 150 mg /L GA3 treatment, c. 600 mg /L GA3 treatment, d. 100 mg/L GA3 for 360 days. 圖1　濕沙基質(zhì)的種子胚根Fig. 1　The seeds radicle in wet sand substrate

濕沙基質(zhì)試驗過程中發(fā)現(xiàn)，僅高溫或低溫并不能打破種子休眠，而是需要高低溫的交替；采用不同濃度的GA3浸泡種子，然后進行低溫層積和18 ℃培養(yǎng)箱層積，結(jié)果低溫層積種子未發(fā)芽，原因可能是七葉一枝花種子的胚發(fā)育不完全。

2.2長出胚根的種子在土壤中的萌發(fā)情況將胚根長至3～4 cm的種子于春季栽種在缽子里，其上覆蓋一層2 cm左右的土，第一次澆透定根水，之后每隔3～5 d澆水，放于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度為(18±2) ℃，濕度為70%，弱光照條件下觀察生長情況。另一部分于相同時間種在小缽子內(nèi)，在湖北省恩施土家族苗族自治州的自然條件下，挖土一定的深度放入缽子與地面相平，溫度、光照時間和濕度均在不斷檢測中。

光照培養(yǎng)箱和自然條件栽種的種子均能長成心形幼苗，說明各種處理方法均能獲得大量種苗，此方法是可行的。光照培養(yǎng)箱七葉一枝花的種子在其外面還殘留部分鱗莖，阻礙子葉展開，而自然條件下七葉一枝花的種子已經(jīng)長成心形幼苗，比光照培養(yǎng)箱內(nèi)長得快且長勢良好。其原因是光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件較恒定，通風(fēng)狀況較差，若水澆多，會在其上出現(xiàn)一層白膜，而自然條件下不僅通風(fēng)良好且不會存積水分，自然條件下生長的七葉一枝花幼苗比光照培養(yǎng)箱生長的快和好(圖2)。

經(jīng)過上述方法打破七葉一枝花種子的休眠期，需要180～210 d，種子可形成心形單葉幼苗。

2.3不同濃度6-BA對種子愈傷組織的影響種子外植體形成愈傷組織的適宜培養(yǎng)基為1/2MS(大量元素、微量元素、有機溶劑和鐵鹽都為MS培養(yǎng)基的50%)+0.1 mg/L 6-BA +0.5 mg /L NAA。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，在種子外植體愈傷組織誘導(dǎo)初期對培養(yǎng)基的要求較低，說明培養(yǎng)初期胚乳可以提供種子所需要的養(yǎng)分。6-BA 是植物組織培養(yǎng)中使用較廣泛的一種細胞分裂素，且在許多植物上表現(xiàn)出較強的誘導(dǎo)不定芽形成的能力。該試驗結(jié)果也說明6-BA用于種子不定芽的誘導(dǎo)是適宜的，且最佳濃度為0.1 mg /L。隨著6-BA濃度的增加，誘導(dǎo)不定芽的能力增強，同時外植體開始褐化，因此，在一定濃度范圍內(nèi)，高濃度的6-BA對誘導(dǎo)不定芽的形成是不合適的。

雖然是相同濃度的激素，但種子外植體誘導(dǎo)的效果不同，有的能直接形成愈傷組織，有的能形成愈傷組織和長出芽。種子外植體形成的愈傷組織(圖3 a)，在整個種子的周圍形成一圈愈傷組織，愈傷組織較松散且易碎，誘導(dǎo)效果不理想。選擇長勢好的愈傷組織進行分化培養(yǎng)，一段時間后發(fā)現(xiàn)，愈傷組織不同程度地褐變甚至顏色變黑，未分化出苗，既有愈傷組織又有芽的種子外植體也開始褐變和變黑(圖3 b和圖3 c)，但種子長出的芽可以進一步生長和發(fā)育(圖3 d～f)。

注：a和b.光照培養(yǎng)箱，c和d.自然條件。Note: a and b. Illuminating incubator， c and d. Natural conditions.圖2　光照培養(yǎng)箱和自然條件下生長的幼苗Fig. 2　Seedlings in labs and under natural conditions

注：a.愈傷組織，b.芽和愈傷組織，c.黑色的愈傷組織，d.分化的芽，e.芽生長和發(fā)育，f.長出根。Note: a. Callus, b. Bud and callus, c. Black callus, d. Differentiation of bud, e. Bud growth and development, f. Growing root.圖3　七葉一枝花種子愈傷組織誘導(dǎo)過程Fig.3　Seed callus induction process of Paris polyphylla Smith

6-BA能有效地被種子外植體所吸收，致使6-BA富集，且誘導(dǎo)的不定芽在含有6-BA的培養(yǎng)基上繼代幾次后，其玻璃化程度不斷加重，說明種子外植體有富集細胞分裂素6-BA的傾向。

雖然種子誘導(dǎo)出的愈傷組織未分化出苗，然而觀察發(fā)現(xiàn)其種子先長出胚根，露出種子之外(圖4 a～c)，隨著胚根的不斷發(fā)育和進一步對種子進行誘導(dǎo)分化(圖4 d～f)，胚根向下生長，形成主根；與此同時，胚軸細胞也相應(yīng)地生長和伸長，把胚芽連同子葉一起推出；最后胚芽突出種皮，向上生長，形成莖和葉，獲得了無菌苗(圖4 g～i)。由此可知，七葉一枝花是子葉出土萌發(fā)。

3　結(jié)論

研究結(jié)果表明，七葉一枝花種子快速萌發(fā)期由2 a縮短為0.5 a，萌發(fā)率由10%～46%提高到90%以上。150 mg/L GA3處理種子的萌發(fā)率最高。在七葉一枝花育苗、栽培生產(chǎn)中可以選擇這些植物激素，提高其出苗率和幼苗成活率。

較高濃度GA3有利于種子萌發(fā)，低濃度則使萌發(fā)率下降。先用水溶液浸泡種子，使種子充分吸脹，再用GA3溶液浸泡，有利于種子充分吸收GA3溶液。GA3不僅能誘導(dǎo)水解酶類的合成，也能促進酶的分泌，水解貯藏物質(zhì)供胚生長的小分子化合物，促進種子萌發(fā)，且促進效果最明顯。

種子外植體最合適的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加0.1 mg/L 6-BA和0.5 mg /L NAA的 1/2MS基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)的愈傷組織比較松散，濕度大，且易碎?？煽紤]使用未成熟的種子胚，此時胚比較幼嫩和容易獲得；根莖和種子外植體都能誘導(dǎo)出愈傷組織，但均未分化出苗。后續(xù)試驗考慮使用正交試驗篩選出合適的愈傷組織分化培養(yǎng)基，獲得植物體，以期為解決種苗問題提供理論指導(dǎo)。

注：a～c.出現(xiàn)胚根，d～f.誘導(dǎo)分化，g～i.無菌苗。Note:a-c.Radide, d-f.Inducing differentiation, g-i.Aseptic seedling.圖4　種子形成無菌苗的過程Fig. 4　The process of seeds growing into aseptic seedling

[1] 付婷婷,程紅焱,宋松泉.種子休眠的研究進展[J].植物學(xué)報,2009, 44 (5):629-641.

[2] PENCE V C,SOUKUP V G.Propagation of the rareTrilliumpersistensin vitro[J].Micropropagation news,1995,1:109-110.

[3] 蒙愛東,閆志剛,余麗瑩，等.七葉一枝花種子無菌培養(yǎng)萌發(fā)觀察[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(11):258,260.

[4] 王躍華,蔣婷婷,付偉，等.重樓植物的組織培養(yǎng)研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(8):2014-2016.

[5] 王嵐,付素靜,李藝,等.梵凈山七葉一枝花組織培養(yǎng)技術(shù)初探[J].農(nóng)技服務(wù)(實驗研究),2015,32(2):66-67.

Seeds Germination and Tissue Culture ofParispolyphyllaSmith

HUANG Zong-hua

(Guangdong Peizheng College, Guangzhou, Guangdong 510830)

[Objective] To research the optimal GA3concentration and the optimal culture medium for seed germination of Paris polyphylla Smith. [Method] Seeds ofP.polyphyllawere processed by different concentrations of GA3. The optimal GA3concentration to promote the rapid seed germination and high germination rate was researched. Seeds with 3-4 cm radicle were planted in the soil. Under the condition of illumination and natural growth, growth of the first leaf was observed, respectively. Callus were induced by different concentrations of 6-BA, so as to find the optimal concentration of 6-BA. [Result] In 150 mg/L GA3treatment, seeds had the highest germination rate. The optimal callus induction medium for seed explants was 1/2 MS +0.1 mg/L 6-BA + 0.5 mg /L NAA. [Conclusion] This ratpid germination method forP.polyphyllais feasible.

ParispolyphyllaSmith; Seeds; Germination rate; Callus

湖北省自然科學(xué)基金項目(2010CDA035)；中南民族大學(xué)植物遺傳與發(fā)育創(chuàng)新團隊資助項目。

黃宗華(1987- )，女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，研究方向：應(yīng)用生物化學(xué)。

2016-07-20

S 188

A

0517-6611(2016)27-0118-04