棗果纖維素酶對裂果發生的影響
2016-11-11 03:15:53栗現芳趙瑞華陳國梁陳宗禮
安徽農業科學 2016年27期
栗現芳， 姚 瑞， 趙瑞華， 陳國梁， 陳宗禮
(1.陜西省紅棗重點實驗室,陜西延安 716000；2.延安大學生命科學學院,陜西延安 716000)
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棗果纖維素酶對裂果發生的影響
栗現芳1,2， 姚 瑞1， 趙瑞華1， 陳國梁1,2， 陳宗禮1,2
(1.陜西省紅棗重點實驗室,陜西延安 716000；2.延安大學生命科學學院,陜西延安 716000)
[目的]針對棗裂果問題，探討棗果纖維素酶對裂果發生的影響。[方法]以陜北主栽品種木棗、駿棗和團棗的不同成熟期棗果的果皮和果肉為材料，采用還原糖法(DNS法)，通過酶液提取和酶活性測定，分析不同樣品中的纖維素酶活性，探討不同裂果性品種、不同時期以及棗果不同組織中纖維素酶活性的動態變化趨勢。[結果]抗裂性木棗不同成熟期纖維素酶活性變化差異顯著，其中脆熟期活性最高；極易裂性駿棗不同時期酶活性變化也呈顯著差異，裂果后活性明顯下降；較易裂性團棗不同時期酶活性變化差異不顯著。不同組織間纖維素酶活性變化趨勢基本相同，差異均不顯著。不同品種間易裂性駿棗纖維素酶活性高于抗裂性木棗和較易裂性團棗。[結論]易發生裂果的脆熟期酶活性高，抗裂性好，而裂果一旦發生會導致酶活性降低，并且裂果現象的發生與組織間的酶活性變化沒有關系。
棗；裂果；纖維素酶
紅棗，為鼠李科木本植物棗的果實[1],是我國陜北地區的一大特產，其味甜可口，營養豐富，富含多種氨基酸、維生素等營養物質[2],素有“活維生素C丸”的美譽[3]。紅棗還具有重要的藥用價值，對于脾胃虛弱、氣血不足、心悸失眠等癥狀有很好的緩解[4-6]。大棗富含的環磷腺苷對預防和治療心肌梗塞、冠心病等心腦血管疾病有很大的作用，同時還有防癌抗癌的功效[7]。
紅棗的適宜生態條件是干燥少雨、陽光充足的氣候，它適應能力特別強，耐寒(-30 ℃)、耐高溫(43 ℃)、耐鹽堿、耐貧瘠，特別是在干旱地區的棗樹結出的果實，品質尤佳。陜北黃河、洛河沿岸一帶，氣候、土壤條件均適宜棗樹生長，因此許多市縣的農民都以種植紅棗為經濟來源，種植面積達30萬hm2，正常年景的產量在20萬t左右[8]。但近年來陜北紅棗面臨嚴重的裂果問題。一般年份裂果、爛果率達15%左右，成熟期多雨的年份，裂果率達到50%～80%，嚴重的年份裂果率高達95%以上[9]。據報道，自然條件下不同品種間裂果一般與降雨時間和成熟度有關。
目前國內已有很多學者致力于棗裂果問題的研究，且主要集中于探討果實解剖結構、果實理化特性、遺傳特性、礦質元素、外界環境條件等對裂果的影響，對棗裂果發生的生理機制研究較少[10-12]。解決棗裂果的方法，目前的研究較多集中在栽培方面，主要有選育抗裂品種、大棚栽培和加強土、肥、水綜合管理等[13]。其實果裂現象在水果中普遍存在，在對荔枝及油桃中抗裂性不同的品種進行研究發現，細胞壁代謝相關酶活性與裂果密切相關，其中纖維素酶活性在易裂品種中較抗裂品種活性高[14-16]。
筆者以陜北紅棗主栽品種駿棗、團棗和木棗為材料，采用還原糖法(DNS法)測定不同裂果性品種、不同時期以及棗果不同組織中纖維素酶的活性變化，了解纖維素酶在不同品種中的時空表達模式，對于探究纖維素酶對裂果發生的影響機制提供理論參考，為后續抗裂品種的選育提供理論依據。
1 材料與方法
1.1材料
1.1.1原料。供試材料均采樣自延安延川當地，有白熟期、半紅期、脆熟期、裂果后和完熟期5個時期的木棗、駿棗和團棗，采集的棗果放入自封袋中保存，并立即放置于冰盒中，帶回實驗室后于-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。其中，木棗為抗裂性品種，團棗為較易裂性品種，駿棗為易裂性品種[17-18]。
1.1.2主要儀器。紫外分光光度計(UV2600)，日本島津；高速冷凍離心機(HC-3614R)、電熱恒溫水浴鍋(HH-S4)，北京科偉永新儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9140A)，上海齊欣科學儀器有限公司；超低溫冰箱，德國；優普系列超純水機(UPK-110)，成都超純科技有限公司；電子天平(FA1004N)，上海精密科學儀器有限公司。
1.1.3主要試劑及配制方法。濃度為1 mg/mL 的葡萄糖標準液：將葡萄糖在恒溫干燥箱中105 ℃下干燥至恒重，準確稱取100 mg 于100 mL 小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入100 mL 容量瓶中用蒸餾水定容，充分混勻。4 ℃冰箱中保存(可用12～15 d)。3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液:準確稱取DNS 6.3 g 于500 mL 大燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，加入2 mol/L NaOH 溶液262 mL，再加到500 mL 含有185 g 酒石酸鉀鈉(C4H4O6KNa·4H2O，MW=282.22)的熱水溶液中，再加5 g結晶酚(C6H5OH，MW=94.11)和5 g無水亞硫酸鈉(Na2SO3，MW=126.04)，攪拌溶解，冷卻后移入1 000 mL 容量瓶中用蒸餾水定容，充分混勻。貯于棕色瓶中，室溫放置7 d后使用。0.1 mol/L pH 6.0的醋酸鈉緩沖液;1%甲基纖維素。
1.2方法
1.2.1葡萄糖(G)標準曲線的制作。取8 支洗凈烘干的20 mL 具塞刻度試管，編號后按表1 加入標準葡萄糖(G)溶液和蒸餾水，配制成一系列不同濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后，向各試管中加入1.5 mL DNS溶液，搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容至20 mL，充分混勻。在540 nm 波長下，以1號試管溶液作為空白對照，調零點，測定其他各管溶液的光密度值并記錄結果。以葡萄糖含量(mg)為橫坐標，以對應的光密度值為縱坐標，繪制標準曲線。
表1 葡萄糖標準曲線制作
1.2.2纖維素酶的提取。參照寧正祥的方法[19]，取0.5 g樣品于預冷的研缽中，加入4 mL冷的0.1 mol/L pH 6.0的醋酸鈉緩沖液和少量石英砂，冰浴研磨勻漿，用3 mL醋酸鈉緩沖液迅速沖洗研缽研棒，一并轉移至離心管；低溫(4 ℃)下提取1 h；然后在低溫(4 ℃)下，10 000 r/ min離心20 min，上清液作為待測粗酶液。
1.2.3纖維素酶的活性測定。取2 mL 1%的甲基纖維素加0.5 mL的酶液(空白管此時不加酶液)，于37 ℃下保溫60 min，加入2.5 mL DNS終止反應，混合均勻(空白管加0.5 mL酶液)。立即放入沸水浴中顯色5 min，流水冷卻，加入20 mL H2O稀釋，搖勻后于540 nm波長下比色測定OD值。然后用3,5-二硝基水楊酸還原法測定生成的還原糖含量。
酶活力單位：1 mL酶液37 ℃，pH 6.0條件下，1 h分解甲基纖維素產生1 μmol葡萄糖為一個酶活單位(U)。
酶活力(U/g)=[葡萄糖含量(mg)×酶液定容總體積(mL)×稀釋倍數×5.56]/[反應液中酶液加入量(mL)×樣品重(g)×時間(h)]
式中，5.56為1 mg葡萄糖的μmoL數(1 000/180=5.56)。
1.3數據處理利用Excel數據分析功能進行數據整理和統計分析。
2 結果與分析
2.1標準曲線制作按照表1所示進行標準曲線制作，根據所測結果，以葡萄糖含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，利用Excel 2010繪制標準曲線，得出回歸方程及相關系數(圖1)；對測得的結果進行F檢驗，F值=47.909 46，P=0.000 083(P<0.01)，差異極顯著。R接近于1，說明兩個相關性比較大。
圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve
2.2木棗不同時期果皮、果肉纖維素酶活性通過對木棗品種不同成熟期取材、酶液提取、酶活性測定及比較分析(圖2)，結果表明，木棗果皮、果肉纖維素酶活性在不同時期的變化趨勢基本相同，從白熟期到脆熟期纖維素酶活性逐漸上升，而脆熟期到完熟期呈降低趨勢。不同時期間方差分析P≈0.04(0.01
注：A.白熟期；B.半紅期；C.脆熟期；D.裂果后；E.完熟期；M-1.木棗果皮；M-2.木棗果肉。Note：A.White ripe season; B.Half red stage; C.Full red stage; D.After dehiscent fruit; E.Stage of complete ripeness; M-1.Pericarp of Mu jujube; M-2.Sarcocarp of Mu jujube.圖2 木棗(M)不同時期不同組織纖維素酶活性變化Fig.2 The change of different organizations,different periods of cellulase activity in ‘Mu’ jujube
注：B.半紅期；C.脆熟期；D.裂果后；E.完熟期；J-1.駿棗果皮；J-2.駿棗果肉。Note：B.Half red stage; C.Full red stage; D.After dehiscent fruit; E.Stage of complete ripeness; J-1.Pericarp of Jun jujube; J-2.Sarcocarp of Jun jujube.圖3 駿棗(J)不同時期不同組織纖維素酶活性變化Fig.3 The change of different organizations,different periods of cellulase activity in ‘Jun’ jujube
2.3駿棗不同時期果皮、果肉纖維素酶活性通過對駿棗不同時期不同組織酶活性比較分析(圖3)，結果表明，駿棗果皮、果肉纖維素酶活性在不同時期的變化趨勢也基本相同，從半紅期到裂果后纖維素酶活性逐漸下降，此時間段果皮和果肉纖維素酶活性趨勢基本相同。裂果后到完熟期酶活性上升，且果肉纖維素酶活性高于果皮，上升趨勢也較為明顯。不同時期間方差分析P≈0.011(0.01
注：A.白熟期；B.半紅期；C.脆熟期；D.裂果后； T-1.團棗果皮；T-2.團棗果肉。Note：A.White ripe season; B.Half red stage; C.Full red stage; D.After dehiscent fruit; T-1.Pericarp of Tuan jujube; T-2.Sarcocarp of Tuan jujube.圖4 團棗(T)不同時期不同組織纖維素酶活性變化Fig.4 The change of different organizations,different periods of cellulase activity in ‘Tuan’ jujube
2.5不同品種棗果纖維素酶活性比較分析從總體水平上比較不同品種、不同時期、不同組織酶活性的變化趨勢(圖5)，表現為3個品種不同棗果組織間纖維素酶活性變化趨勢均表現一致，沒有顯著差異；木棗和團棗纖維素酶酶活性變化趨于平穩，且木棗酶活性高于團棗，駿棗不同成熟期棗果纖維素酶活性變化幅度較大，在裂果后表現明顯降低，除該時期外，均高于木棗和團棗。
注：A.白熟期；B.半紅期；C.脆熟期；D.裂果后；E.完熟期；M-1.木棗果皮；M-2.木棗果肉；J-1.駿棗果皮；J-2.駿棗果肉；T-1.團棗果皮；T-2.團棗果肉。Note:A.White ripe season; B.Half red stage; C.Full red stage; D.After dehiscent fruit; E.Stage of complete ripeness; M-1.Pericarp of Mu jujube; M-2.Sarcocarp of Mu jujube; J-1.Pericarp of Jun jujube; J-2.Sarcocarp of Jun jujube; T-1.Pericarp of Tuan jujube; T-2.Sarcocarp of Tuan jujube.圖5 木棗、駿棗、團棗不同時期不同組織纖維素酶活性變化Fig.5 The change of different organizations,different periods of cellulase activity in different breed
從棗果同一時期比較不同品種不同組織間酶活性的變化(圖6)，在半紅期駿棗酶活性明顯高于其他2個品種；團棗的纖維素酶活性整體水平都比較低，木棗居中，且兩者變化幅度較小，而駿棗變化幅度較大；從半紅期到脆熟期木棗果皮、果肉纖維素酶活性上升，駿棗和團棗品種酶活性均下降；脆熟期到裂果后，木棗、駿棗和團棗果皮、果肉纖維素酶活性都呈下降趨勢。
注：B.半紅期；C.脆熟期；D.裂果后； M-1.木棗果皮；M-2.木棗果肉；J-1.駿棗果皮；J-2.駿棗果肉；T-1.團棗果皮；T-2.團棗果肉。Note：B.Half red stage; C.Full red stage; D.After dehiscent fruit; M-1.Pericarp of Mu jujube; M-2.Sarcocarp of Mu jujube; J-1.Pericarp of Jun jujube; J-2.Sarcocarp of Jun jujube; T-1.Pericarp of Tuan jujube; T-2.Sarcocarp of Tuan jujube.圖6 同一時期不同品種、不同組織纖維素酶活性變化比較Fig.6 The change of different organizations,different breed of cellulase activity in the same periods
3 討論
纖維素酶(β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單體酶，而是起協同作用的多組分酶系，是一種復合酶，作用于纖維素以及從纖維素衍生出來的產物，將不溶性纖維素轉化成葡萄糖。通過調查認為，果皮中的纖維素酶可以水解果皮中的纖維素，降低果皮的機械強度，增加果實裂果的易發性。對于荔枝的研究表明，其易裂品種“糯米糍”果皮中的纖維素酶活性高于其抗裂品種“淮枝”。
該試驗中同一品種果肉中的纖維素酶活性在各個時期的變化趨勢與果皮相似，差異均不顯著。對同一品種同一組織的纖維素酶活性在各個時期的變化分析可得，抗裂性木棗果皮中纖維素酶活性從白熟期到脆熟期逐漸上升，脆熟期到完熟期酶活性呈降低趨勢，變化差異顯著，其中脆熟期酶活性表現最高；極易裂性駿棗果皮中纖維素酶活性從半紅期到裂果后逐漸下降，裂果后到完熟期酶活性上升，變化差異顯著；較易裂性團棗果皮中纖維素酶活性從白熟期到半紅期呈上升趨勢，半紅期到裂果后呈下降趨勢，變化差異不顯著。對于不同品種間纖維素酶活性在各個時期的變化整體水平分析得出，在半紅期到脆熟期易裂性駿棗果皮中的纖維素酶活性高于較易裂性團棗和抗裂性木棗，而在裂果后可能由于裂果現象會使纖維素酶用于分解纖維素從而導致極易裂性駿棗和較易裂性團棗的纖維素酶活性均低于抗裂性木棗。因此，推測易發生裂果的脆熟期酶活性高，抗裂性好，而裂果一旦發生會導致供試品種酶活性降低；并且果皮和果肉間在任何一個品種任何一個時期都不存在顯著性差異，說明裂果現象的發生與組織間的酶活性變化沒有關系，具體作用原理還需后續試驗進一步驗證。
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Effect of Cellulase on Jujube Fruit Cracking
LI Xian-fang1,2,YAO Rui1,ZHAO Rui-hua1et al
(1.Shaanxi Key Laboratory of Chinese Jujube, Yan’an,Shaanxi 716000; 2.College of Life Science,Yan’an University,Yan’an,Shaanxi 716000)
[Objective] Aiming at the problem of jujube fruit cracking,the influence of cellulase on jujube fruit cracking was discussed.[Method] With the main varieties of jujube in Northern Shaanxi,Mu jujube, Jun jujube and Tuan jujube,in different fruit maturity stage and different tissue as materials,by the method of DNS,through the extraction of enzyme,the measurement of enzyme activity,enzyme activity of cellulose in different samples were analyzed,the dynamic change trend of cellulase activity in different fruit varieties,periods and tissues were discussed.[Result] The changes of cellulose activity in different mature period was significant in crack resistance jujube,which the activity of brittle ripe stage was highest; The enzyme activity changes in different periods of easy to crack of Jun jujube also showed significant difference,activity decreased significantly after cracking; The enzyme activity in different periods of easier to crack of tuan jujube was not significant.The trend of cellulase activity in different tissues was basically the same,and the difference was not significant.Among different varieties,the cellulase activity of fissility Jun jujube were higher than that of the crack resistance of the Mu jujube and Tuan jujube fissility group.[Conclusion] The enzyme activity in brittle ripe stage is highest,crack resistance is good,and cracking event will lead to reduction of enzyme activity,and there is no relationship between fruit cracking and changes of enzyme activities in tissues.
Jujube; Fruit cracking; Cellulose
陜西省教育廳專項科研計劃項目(2013JK0735)；延安市科學技術研究發展計劃項目(2013-KN12)；延安大學校級科研計劃項目(YDK2015-76)；陜西省科技廳農業科技創新與攻關項目(2016NY-138)；延安市科學技術研究發展計劃項目(2014CGZH-09)。
栗現芳(1981- )，女，河北魏縣人，講師，博士，從事植物遺傳育種研究。
2016-08-07
S 665.1
A
0517-6611(2016)27-0065-04
