復方甘草酸苷注射液對B16鼠黑素瘤細胞黑素生成的影響

顏克香 祝綠川 鄭志忠

·論著·

復方甘草酸苷注射液對B16鼠黑素瘤細胞黑素生成的影響

顏克香 祝綠川 鄭志忠

目的： 研究復方甘草酸苷注射液對B16鼠黑素瘤細胞黑素的影響及其機制。方法： 通過CCK8、流式細胞術、NaOH裂解法、多巴氧化法和Western-blotting技術檢測復方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細胞生長，黑素合成與轉(zhuǎn)運及酪氨酸酶活性和蛋白含量的影響。結(jié)果： （1）復方甘草酸苷注射液濃度低于30 μL/mL，對B16鼠黑素瘤細胞生長無明顯影響；濃度大于50 μL/mL，細胞生長速率減慢；濃度達到500 μL/mL，細胞生長明顯受抑制。（2）濃度在10 μL/mL到200 μL/mL，黑素的合成和酪氨酸酶的活性均增加。黑素的合成在復方甘草酸苷注射液濃度為50 μL/mL時增加最明顯；且酪氨酸酶活性呈濃度依賴性增加，在濃度為100 μL/mL和150 μL/mL時達到最高。結(jié)論： 復方甘草酸苷注射液有促進黑素瘤細胞黑素的合成與轉(zhuǎn)運及增加酪氨酸酶活性的作用。

復方甘草酸苷； B16鼠黑素瘤細胞； 酪氨酸酶

臨床上我們發(fā)現(xiàn)用復方甘草酸苷聯(lián)合其它治療白癜風的藥物可明顯加快白斑皮損處色素的恢復，控制活動期皮損的發(fā)展，國內(nèi)學者也有報道復方甘草酸苷可增加外用藥物如復方卡力孜然酊、鹵米松等的療效［1，2］，與其它藥物聯(lián)合運用的治療效果要優(yōu)于潑尼松［3］。但復方甘草酸苷治療白癜風的理論機制還未見相關報道，因此，我們體外研究不同濃度復方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細胞的生長、黑素合成與轉(zhuǎn)運及酪氨酸酶活性的影響，探討復方甘草酸苷治療白癜風的作用機制，為臨床治療白癜風提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料 主要試劑:B16鼠黑素瘤細胞由中科院提供，Hacat細胞由本室凍存，RPMI 1640培養(yǎng)基（美國，Gibco公司），新生小牛血清（Hyclone），左旋多巴（L-dopa），胰蛋白酶為Sigma產(chǎn)品，CCK-8（同仁化學研究所），復方甘草酸苷注射液（日本米諾公司提供），F(xiàn)ix&Perm破膜試劑盒（invitrogen公司），PE-cytokeratin（abcam公司），兔抗人的酪氨酸酶抗體（abcam公司），CFDA-SE（碧云天）。

1.2實驗方法

1.2.1B16鼠黑素瘤細胞的培養(yǎng) 用含10%新生牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞生長至近融合狀態(tài)，經(jīng)含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，制備細胞懸液和臺盼藍染色計活細胞數(shù)，然后進行實驗，每一次實驗均取自同一傳代細胞，每次實驗重復三次。

1.2.2B16鼠黑素瘤細胞增殖率的測定 取對數(shù)生長期B16鼠黑素瘤細胞，經(jīng)胰酶消化制備單細胞懸液，以 5×103/孔接種至96孔培養(yǎng)板，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，孵育6～12 h待細胞貼壁后，實驗組加入不同濃度的復方甘草酸苷注射液（1 μL/ mL，5 μL/mL，10 μL/mL，30 μL/mL，50 μL/mL，100 μL/mL，200 μL/mL，500 μL/mL），每種濃度設3個復孔，同時設只含培養(yǎng)液而無細胞的空白組和有細胞不加藥物的對照組，分別于加藥后24 h，48 h，72 h，96 h，120 h加入CCK-8 10 μL，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后用酶標儀檢測450 nm的吸光度值，參考波長是650 nm，用下列公式計算各組細胞增殖率，細胞增殖率=（實驗組 A450-空白組 A450）/（對照組A450-空白組A450）×100。

1.2.3酪氨酸酶活性和黑素含量測定 取對數(shù)生長期B16鼠黑素瘤細胞，經(jīng)胰酶消化后以1×105/孔接種至6孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后加入不同濃度的復方甘草酸苷注射液（0 μl/mL，10 μl/mL，30 μl/mL，50 μl/mL，75 μl/mL，100 μl/mL，150 μl/mL，200 μl/mL，500 μl/mL），置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h，經(jīng)胰酶消化后計數(shù)，用NaOH裂解法測定黑素含量［4］，多巴氧化法測定酪氨酸酶的活性［5］，并加以修改。

1.2.4B16鼠黑素瘤細胞酪氨酸酶蛋白的測定 取對數(shù)生長期B16鼠黑素瘤細胞，經(jīng)胰酶消化后以1× 106接種至直徑6 cm的培養(yǎng)皿，待細胞貼壁后加入不同濃度的復方甘草酸苷注射液（0 μl/mL，10 μl/mL，30 μl/mL，50 μl/mL，75 μl/mL，100 μl/mL，150 μl/ mL，200 μl/mL，500 μl/mL），置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h，用全細胞裂解液提蛋白，并用Brodford法測定蛋白濃度，取相同蛋白濃度的樣品熱變性后上樣，經(jīng)10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后先后加入一抗（1∶1000）和相應的二抗孵育，plusECL化學發(fā)光檢測酪氨酸酶和β-actin蛋白的表達，應用化學發(fā)光成像分析儀對圖像進行分析。

1.2.5B16鼠黑素瘤細胞黑素轉(zhuǎn)運的測定 取2×106B16鼠黑素瘤細胞用CFDA-SE標記（按說明書操作），將標記后的B16鼠黑素瘤細胞和Hacat細胞以1∶2的比例接種于直徑3 cm的培養(yǎng)皿，并設立單獨培養(yǎng)的對照組，待細胞培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的復方甘草酸苷注射液（0 μl/mL，10 μl/mL，30 μl/mL，50 μl/mL，75 μl/mL，100 μl/mL，150 μl/mL，200 μl/mL，500 μl/mL），置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)96 h，將細胞用胰酶完全消化下來后，用PBS洗滌2次，分別加入試劑A和試劑B（按說明書操作）對細胞進行固定和通透后加入20 μL PE-cytokeratin，室溫孵育1 h，用含5%FBS的PBS洗滌3次后上流式檢測PE陽性的Hacat細胞中CFDA-SE標記陽性的細胞數(shù)，即代表成功發(fā)生黑素轉(zhuǎn)運的Hacat細胞數(shù)目。

2　結(jié)果

2.1不同濃度的復方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細胞形態(tài)的影響:復方甘草酸苷濃度大于50 μl/mL時，B16鼠黑素瘤細胞開始出現(xiàn)形態(tài)學的改變，主要表現(xiàn)為細胞胞體變大，樹突增多，以200 μl/mL時最明顯，見圖1、2

2.2不同濃度的復方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細胞增殖率的影響:當復方甘草酸苷濃度在30 μl/mL以內(nèi)時，對B16鼠黑素瘤細胞生長無明顯影響；濃度大于50 μl/mL時，細胞生長速率開始減慢，到達平臺期的時間延長，當濃度達到500 μl/mL時，細胞生長明顯受抑制，見表1。

圖1　對照組

圖2　200 μl/mL組

表1　不同濃度的復方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細胞增殖的影響

2.3不同濃度復方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響:當復方甘草酸苷濃度在10 μl/mL到200 μl/mL時，黑素的合成和酪氨酸酶的活性均增加。黑素的合成在濃度為50 μl/mL時增加最明顯；酪氨酸酶活性呈濃度依賴性增加，在濃度為100 μl/mL和150 μl/mL時達到最高，見圖3。

圖3　不同濃度復方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響

2.4不同濃度復方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細胞酪氨酸蛋白表達的影響:當復方甘草酸苷濃度在30 μl/ mL和50 μl/mL時酪氨酸蛋白表達明顯增加，濃度大于75 μl/mL時，酪氨酸蛋白表達降低，當濃度達到500 μl/mL，酪氨酸蛋白表達明顯受抑制，見圖4。

圖4　不同濃度的復方甘草酸苷對酪氨酸蛋白表達的影響

2.5不同濃度復方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細胞向Hacat細胞轉(zhuǎn)運黑素的影響:復方甘草酸苷濃度在10 μl/mL～200 μl/mL之間時均有促進黑素轉(zhuǎn)運的作用，以濃度為75 μl/mL和150 μl/mL時，黑素轉(zhuǎn)運能力最強，無明顯的劑量相關性，見圖5。

圖5　不同濃度復方甘草酸苷對B16鼠黑素瘤細胞向Hacat細胞轉(zhuǎn)運黑素的影響

3　討論

早在1987年就有學者發(fā)現(xiàn)甘草次酸抑制B16黑素瘤細胞生長，并導致細胞形態(tài)的改變和刺激黑素的合成，甘草酸苷也可導致同樣的改變但需要的濃度比甘草次酸高20多倍，甘草次酸處理細胞84 h后除去，細胞的生長速率可輕度恢復，但倍增時間是對照組的2倍，流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)甘草次酸對細胞生長的抑制是通過阻止細胞由G1期進入S期造成的［6］。我們的結(jié)果表明復方甘草酸苷濃度大于50 μl/mL時，B16鼠黑素瘤細胞生長速率開始減慢，進入平臺生長期的時間延長，這可能也與阻止細胞由G1期進入S期有關。隨著復方甘草酸苷濃度的增加，細胞形態(tài)學的改變也越明顯，主要表現(xiàn)為胞體增大，樹突增多，以濃度為200 μl/mL最明顯；當濃度達到500 μl/mL時，細胞胞體又開始變小，樹突也減少。

Jung等研究證實甘草酸苷可以劑量依賴性方式促進B16黑素瘤細胞內(nèi)酪氨酸酶mRNA和蛋白的表達，增加酪氨酸酶的活性及黑素的含量。酪氨酸相關蛋白2（TRP-2）mRNA水平也增加，而酪氨酸相關蛋白1（TRP-1）的變化不明顯。在甘草酸苷的有效濃度內(nèi)沒有出現(xiàn)細胞毒性，而在同樣無毒性濃度下，甘草次酸對黑素合成無明顯影響［7］。這與1987年Abe等報道的甘草次酸能刺激黑素的合成不一致，分析原因可能與兩者的濃度不一樣有關:Jung等的研究是在對細胞無毒性的條件下進行，而Abe等的研究是在使細胞形態(tài)發(fā)生改變的條件下進行。雖然1分子的甘草酸苷含1分子的甘草次酸和2分子的葡萄醛酸，但相同劑量的甘草次酸不能增加酪氨酸酶mRNA和蛋白水平，對黑素合成無影響，這表明甘草酸苷中的糖苷結(jié)構在黑素合成過程中起重要作用。本研究中發(fā)現(xiàn)復方甘草酸苷濃度在30 μl/mL和50 μl/mL時，酪氨酸酶蛋白表達增加，黑素的合成也增加，并在50 μl/mL時達到最大；當濃度大于75 μl/mL時，酪氨酸酶蛋白的表達開始降低，當濃度達到500 μl/mL時，酪氨酸酶蛋白的表達明顯受抑制。酪氨酸酶活性的增加呈明顯的劑量相關性，在濃度為100 μl/mL和150 μl/mL時達到最高，然后又逐漸降低，但均高于對照組。

酪氨酸酶活性的增加與黑素合成的增加不完全一致，可能與復方甘草酸苷中甘氨酸的含量有關。甘氨酸是一種最簡單的氨基酸，在蛋白合成中很重要，參與了動物的許多生理反應，國外學者研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸濃度為1～16 mM時對B16鼠黑素瘤細胞增殖無明顯影響，可抑制由α-MSH誘導的B16F0黑素瘤細胞內(nèi)黑素的合成，且高劑量時可降低酪氨酸酶蛋白的表達，但對酪氨酸酶的活性無影響［8，9］。當復方甘草酸苷濃度為 100 μl/mL時，甘氨酸的濃度為 26.64 mmol/L，當復方甘草酸苷濃度為50 μl/mL時，甘氨酸的濃度在14 mmol/L以內(nèi)，對細胞的增殖無明顯影響，本研究中觀察到的復方甘草酸苷濃度在75 μl/mL以上時，酪氨酸蛋白表達降低但酪氨酸酶活性增強可能與甘氨酸濃度增加有關。

黑素分為真黑素和褐黑素兩種，是整個黑素形成過程中的兩種不同產(chǎn)物，真黑素為棕色或黑色，褐黑素為紅色或黃色。研究發(fā)現(xiàn)在黑素小體內(nèi)褐黑素合成過程中巰基的供體來源主要是游離的半胱氨酸，而不是谷胱甘肽［10，11］；培養(yǎng)基中L-酪氨酸和L-半胱氨酸的濃度變化在體外情況下可調(diào)節(jié)真黑素和褐黑素的比例。在酪氨酸酶的活性足以保證真黑素生成的情況下，控制褐黑素合成的因素是半胱氨酸而不是多巴醌。低濃度的L-半胱氨酸（0.2 mM）增加酪氨酸酶的活性促進黑素的合成，而高濃度的L-半胱氨酸抑制酪氨酸酶的活性，使褐黑素的產(chǎn)生增加［12］。當復方甘草酸苷注射濃度為100 μl/mL，鹽酸半胱氨酸的濃度為0.634 mmol/L，本研究中當復方甘草酸苷濃度大于50 μl/mL時，黑素的含量又開始降低，可能與半胱氨酸濃度過高導致褐黑素產(chǎn)生增加有關。

甘草酸苷是由一分子的18β-甘草次酸和兩分子的葡萄醛酸構成的親水性三萜皂苷，是甘草提取物中最重要的有效成分之一，具有抗炎、抗過敏和免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理作用。國內(nèi)學者粟玉珍等人的研究也發(fā)現(xiàn)18β-甘草酸濃度在低于3 mmol/L時對B16鼠黑素瘤細胞無毒性并有促進增殖的作用，但當濃度大于4 mmol/L，B16黑素瘤細胞生長受到抑制。而18β-甘草次酸濃度在大于10 μmol/L時及對B16黑素瘤細胞有抑制作用，且隨劑量的增大抑制作用增強［13］。上述研究表明低濃度的甘草次酸對B16鼠黑素瘤細胞有明顯的抑制作用，高濃度的甘草酸苷才對B16鼠黑素瘤細胞有抑制作用。B16鼠黑素瘤細胞中酪氨酸酶的活性和黑素的含量與甘草酸苷和甘草次酸濃度呈劑量依賴性增強，甘草酸苷濃度在2 mmol/L時達到最高，甘草次酸濃度在40 μmol/L時達到最高，此濃度對細胞有明顯的抑制作用，但在對細胞生長無抑制作用濃度（10 μmol/L以下）時對黑素合成無影響［13］，這與Jung和Abe等的研究結(jié)果一致。雷鐵池等研究發(fā)現(xiàn)甘草等中藥的乙醇提取物對蘑菇酪氨酸酶活性有明顯的抑制作用，并進一步證實甘草活性成分18α-甘草酸雙胺鹽在100 μmol/L時，可明顯抑制酪氨酸酶的活性和降低黑素的含量而不影響細胞的增殖［14］。這與粟玉珍等的研究結(jié)果不一致，他們研究結(jié)果的差異可能甘草酸分子結(jié)構的差異有關，一個是18β-甘草酸，一個是18α-甘草酸雙胺鹽；也可能與濃度相關，從雷鐵池等研究結(jié)果的圖表中可以看出當18α-甘草酸雙胺鹽濃度在1000μmol/ L時也表現(xiàn)為增加酪氨酸酶的活性和促進黑素的合成。當復方甘草酸苷注射濃度為100 μl/mL，甘草酸苷的濃度為4.25 mmol/L。本研究中復方甘草酸苷濃度在100 μl/mL和150 μl/mL時，酪氨酸酶的活性最高，這與粟玉珍等研究結(jié)果一致。復方甘草酸苷中的甘草酸苷主要是18β-甘草酸。

因此，復方甘草酸苷可直接激活黑素細胞內(nèi)酪氨酸酶的活性促進黑素的合成，此外還可以促進黑素細胞內(nèi)合成的黑素轉(zhuǎn)運到角質(zhì)形成細胞，這可能是臨床上復方甘草酸苷治療白癜風有效的原因之一。

［1］袁星海，姚新民，王豫平，等.復方甘草酸苷片聯(lián)合鹵米松乳膏治療白癜風的療效觀察［J］.中國藥房，2005，16（14）:1092-1093.

［2］林偉濤，林偉林.復方卡力孜然酊聯(lián)合復方甘草酸苷治療白癜風31例［J］.嶺南皮膚性病科雜志，2005，12（4）:315 -316.

［3］鄭成彬，劉秀玲，李桂雙.復方甘草酸苷片聯(lián)合白癜風濃縮丸治療進展期白癜風的療效觀察［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學雜志，2008，7（2）:101.

［4］Oikawa A，Nakayasu M.Quantitative measurement of melanin as tyrosine equivalents and as weight of purified melanin［J］.Yale J Biol Med，1973，46（5）:500-507.

［5］鄧瑞春，周勇，章金剛，等.氫化可的松對B16黑素瘤細胞酪氨酸酶及黑素影響研究［J］.中國藥理學通報，2002，18（4）:433-436.

［6］Abe H，Ohya N，Yamamoto KF，et al.Effects of glycyrrhizin and glycyrrhetinic acid on growth and melanogenesis in cultured B16 melanoma cells［J］.Eur J Cancer Clin Oncol，1987，23（10）:1549-1555.

［7］Jung GD，Yang JY，Song ES，et al.Stimulation of melanogenesis by glycyrrhizin in B16 melanoma cells［J］.Exp Mol Med，2001，33（3）:131-135.

［8］Ishikawa M，Kawase I，Ishii F.Glycine inhibits melanogenesis in vitro and causes hypopigmentation in vivo［J］.Biol Pharm Bull，2007，30（11）:2031-2036.

［9］Ishikawa M，Kawase I，Ishii F.Combination of amino acids reduces pigmentation in B16F0 melanoma cells［J］.Biol Pharm Bull，2007，30（4）:677-681.

［10］Potterf SB，Virador V，Wakamatsu K，et al.Cysteine transport in melanosomes from murine melanocytes［J］.Pigment Cell Res，1999，12（1）:4-12.

［11］Kinnaert E，Duez P，Morandini R，et al.Cysteine but not glutathione modulates the radiosensitivity of human melanoma cells by affecting both survival and DNA damage［J］. Pigment Cell Res，2004，17（3）:275-280.

［12］Smit NP，Van der Meulen H，Koerten HK，et al.Melanogenesis in cultured melanocytes can be substantially influenced by L-tyrosine and L-cysteine［J］.J Invest Dermatol，1997，109（6）:796-800.

［13］粟玉珍，周婧，于淞.18β-甘草酸對鼠黑素瘤B16細胞酪氨酸酶的影響［J］.臨床皮膚科雜志，2005，34（6）:372-373.

［14］雷鐵池，朱文元，夏明玉，等.甘草酸、熊果苷及氫醌對小鼠黑素瘤細胞黑素生成影響的比較研究［J］.臨床皮膚科雜志，2004，29（2）:69-72.

（收稿:2016-05-01 修回:2016-06-12）

The effect of compound glycyrrhizin injection on the melanogenesis of B16 murine melanoma cells

YAN Kexiang，ZHU Lvchuan，ZHENG Zhizhong.
Department of Dermatology，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200040，China
Correspondence author:ZHENG Zhizhong，E-mail:zhengzhizhong@medmail.com

Objective:To investigate the effect of compound glycyrrhizin injection on melanogenesis and mechanism of B16 murine melanoma cells.Methods:The influence of compound glycyrrhizin injection on the growth of B16 murine melanoma cells and the protein level and enzyme activity of tyrosinase，melanogenesis and melanosome transport was measured by CCK8，flow cytometry，NaOH splitting methods，dopa hydrocarbonylation and western-blotting technique，respectively.Results:（1）There was no influence on the growth of B16 murine melanoma cells when the concentration of compound glycyrrhizin injection was lower than 30 μL/mL；The growth rate of B16 murine melanoma cells was retarded when the concentration was higher than 50 μL/mL；The cells were greatly inhibited when the concentration reached 500 μL/mL.（2）The melanogensis and the protein level of tyrosinase were stimulated when the concentration of compound glycyrrhizin injection was between 10 μL/mL and 200 μL/mL；The melanogenesis was greatly stimulated when the concentration was 50 μL/mL，and the tyrosinase activity was increased in a concentration-dependent manner，which was peaked when the concentration was 100 μL/mL or 150 μL/mL.Conclusion:Compound glycyrrhizin injection can stimulate the melanogenesis and melanosome transport，and increase the tyrosinase activity.

compound glycyrrhizin injection；B16 murine melanoma cell；tyrosinase

復旦大學附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海，200040

鄭志忠，E-mail:zhengzhizhong@medmail.com