天津地區滑舌鰨養殖水體微生物多樣性研究

馬超++鄭德斌++賈磊++張博++肖廣俠

摘 要：天津半滑舌鰨工廠化水產養殖已經實現了快速的發展，本文對A1（漢沽地區養殖所用水源）、A2（漢沽區域流水式養殖水體）、B1（漢沽區域循環水系統處理水體）、B2（漢沽區域循環水系統養殖水體1）、Bb（漢沽區域循環水系統病魚專養池養殖水體）、C1（大港區域循環水系統處理水體）、C2（大港區域循環水系統養殖水體1）、Cb（大港區域循環水系統病魚專養池養殖水體）8個養殖區域的微生物，利用宏基因組技術對微生物多樣性進行研究，初步獲取微生物遺傳信息。分析方法主要為對16S rRNA的高變區V3區序列進行PCR擴增，并對拼接后的序列進行分析，包括OTUs（Operational Taxonomic Uints）的提取、alpha多樣性分析、beta多樣性分析等。通過分析可知8個養殖區域的微生物多樣性之間存在著一定的差異。

關鍵詞：半滑舌鰨養殖；水體微生物；多樣性分析

中圖分類號： S966 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160832010

目前野生半滑舌鰨數量驟減，大部分都為養殖品種。半滑舌鰨工廠化養殖是天津水產養殖的支柱產業之一。其經濟價值高，適合工廠化養殖，在我國已形成了較大的養殖規模。半滑舌鰨的養殖環境與半滑舌鰨的生長及病害發生息息相關，因此分析工廠化養殖半滑舌鰨水環境中微生物的多樣性，對于研究半滑舌鰨的生長和病害發生有著重要意義。

本文利用宏基因組技術對天津市工廠化養殖半滑舌鰨的水環境中的微生物多樣性進行研究，初步獲取微生物遺傳信息，解讀半滑舌鰨養殖水環境中細菌優勢類群及其豐度，揭示半滑舌鰨工廠化養殖水環境中的菌群特征，分析其菌群的組成和功能。探討養殖水環境微生物群落同魚病之間的關系，探求微生物群落對魚體健康的影響，以期從養殖池原位環境鑒定并篩選具有潛在益生作用的功能微生物。

1 實驗方法

1.1 從樣品中提取總DNA后，針對16S rRNA的高變區V3區序列設計特異性引物進行PCR擴增

對擴增后的產物進行提純，末端修復，連上接頭、測序引物后，采用IlluminaMiSeq進行測序。

1.2 分析流程

對于測序所得到的序列，通過去除低質量、接頭污染等過程完成數據過濾，得到可信的目標序列，用于后續分析。過濾后的序列，稱為Clean data或Clean Reads，將雙端測序相應的read1與read2（read1與read2是指分別從5和3端2個方向測序所得到的序列片段）進行拼接；利用軟件QIIME 1.8.0版本對拼接后的序列進行分析，包括OTUs（Operational Taxonomic Uints）的提取、alpha多樣性分析、beta多樣性分析等。

2 結果分析

2.1 數據過濾統計

某些原始序列帶有adapter序列，或含有少量低質量序列。經過一系列數據過濾處理以去除雜質數據，得到Clean Reads。Raw Reads包含低質量的序列、接頭污染的序列、含N比例大于5%的序列，以及Clean Reads。Clean Reads所占的比例越高，數據質量越好，根據每種序列所占的比例繪制如下柱狀圖，可以直觀地反映數據過濾情況。

2.2 數據量統計

數據經過過濾得到Clean Data，下圖為本項目全部樣本的Clean Data數據量統計圖，可以很直觀看出Clean Data數據量已滿足要求。

2.3 測序數據質量值分布

為了反映Clean Data的質量，以保證分析的準確性，以Q30/Q20堿基百分比作為指標進行統計，Q30/Q20堿基百分比越大說明測序錯誤率小于0.1%/1%的堿基在總堿基中的比例越大。下圖以所有樣本為橫軸，以Q30百分比作為對應的縱軸直觀地反映了最終過濾后的數據質量，同時也反映了過濾后各個樣本的質量的均一性（每個樣本的Q30堿基百分比相近）。

為了粗略反映測序過程中測序質量的穩定性，以Clean Reads的堿基位置作為橫坐標，每個位置的平均測序質量值作為縱坐標，得到每個樣本測序質量分布圖：

2.4 物種比較分析

在了解每個OTUs對應的物種后，由于存在同一個物種具有多個不同的OTUs的情況。把具有相同物種分類的OTUs合并到一起，統計不同樣品間的物種成分變化，可以了解不同樣品之間的菌群多樣性。如下柱狀圖展示的是Phylum level下的各個樣品中的物種分布：

2.5 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性展示的是樣品內的菌群的多樣性情況，包括菌種的類別豐富度以及菌種數目的均勻度。Alpha多樣性越高即細菌種類越豐富，細菌數目越均勻則表示此群落愈加穩定。根據4種不同的計算指標在不同的取樣深度下求得了alpha多樣性chao1度量指標的值，如下圖所示：

區域Bb的物種多樣性最強，其次為C2和B1，區域Cb和A1的物種多樣性最差。

2.6 Beta多樣性分析

Beta多樣性展示的是樣品間的菌群的差異情況，根據樣品的物種分布，計算了unweightedUniFrac距離（只考慮各樣品中的物種類別差異）和weighted UniFrac距離（考慮了樣品之間物種類別差異以及各類別物種的豐度的差異）。

然后，對樣品間的距離矩陣進行主成分分析，做出如下的三維PCA圖。

3 小結

對A1、A2、B1、B2、Bb、C1、C2、Cb8個養殖區域的微生物，利用宏基因組技術對微生物多樣性進行研究，并對拼接后的序列進行分析（OTUs（Operational Taxonomic Uints）的提取、alpha多樣性分析、beta多樣性分析等），各個區域的物種多樣性之間存在著一定的差異，其中區域Bb的物種多樣性最強，C2和B1次之，區域Cb和A1的物種多樣性最差。

參考文獻

[1]Pei，A. Y.et al.Diversity of 16S rRNA genes within individual prokaryotic genomes[J].Applied and Environmental Microbiology，2010（76）：3886-3897 .

[2]Vasileiadis，S.et al.Soil bacterial diversity screening using single 16S rRNA gene v regions coupled with Multi-Million read generating sequencing technologies[J].PLoS ONE，2012（7）：e42671.

[3]Caporaso，J. G. et al.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nat Meth，2010（7）：335-336.

[4]Ahn，J.et al.Human gut microbiome and risk for colorectal cancer[J].Journal of the National Cancer Institute，2013（105）：1907-1911.

[5]Adler，C.J.et al.Sequencing ancient calcified dental plaque shows changes in oral microbiota with dietary shifts of the neolithic and industrial revolutions[J].Nat Genet，2013（45）：450-455.

[6]Zhang，J.Kobert，K.Flouri，T.&Stamatakis，A. PEAR：a fast and accurate illumina Paired-End reAdmergeR[J].Bioinformatics，2013（30）：btt593-620.