TRAIL聯合順鉑誘導卵巢癌耐藥細胞株COC1/DDP凋亡機制的研究*

莊良武林嵐陳捷陳麗笙

TRAIL聯合順鉑誘導卵巢癌耐藥細胞株COC1/DDP凋亡機制的研究*

莊良武①林嵐①陳捷①陳麗笙①

目的：研究TRAIL聯合順鉑對卵巢癌耐藥細胞COC1/DDP生長的影響，以及聯合用藥對TRAIL死亡受體（DR4、DR5）、凋亡相關基因Smac、Survivin表達的影響，揭示TRAIL聯合順鉑可能逆轉COC1/DDP細胞耐藥性的機制。方法：采用MTT法檢測不同濃度TRAIL蛋白與DDP聯合用藥對COC1/DDP細胞生長的影響，用Annexin V-FITC法檢測COC1/DDP細胞凋亡，用RT-PCR方法檢測DDP對TRAIL受體（DR4、DR5）、凋亡相關基因Smac、Survivin表達。結果：TRAIL蛋白對COC1/DDP細胞生長有抑制作用，DDP與TRAIL蛋白聯合作用后細胞生長抑制率顯著升高（P＜0.05）。DDP使COC1/DDP細胞的DR5表達水平顯著增強，為正常對照組的3.45倍（P＜0.001）；Smac表達為對照組的2.82倍（P＜0.001）；DR4水平無明顯變化；Survivin表達較對照組顯著減少（P＜0.001）。結論：TRAIL蛋白對COC1/DDP細胞生長有抑制作用，DDP與TRAIL聯合增強了對COC1/DDP細胞生長抑制；TRAIL逆轉COC1/DDP細胞對DDP的耐藥性可能與DDP導致TRAIL受體DR5水平升高、Smac表達增加，通過線粒體途徑促進了腫瘤細胞的凋亡有關。

卵巢癌； 耐藥性； TRAIL； 凋亡機制

First-author’s address：The People’s Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350004，China

卵巢癌病死率居女性生殖道惡性腫瘤之首，約有70%患者發現時已是晚期，而其中絕大多數在手術后的化療過程中又極易產生耐藥，導致卵巢癌5年生存率僅為30%［1］。尋找逆轉卵巢癌耐藥化療敏感性的藥物并研究其機制，是現階段卵巢癌治療臨床和基礎研究的熱點。

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）是新發現的TNF超家族成員，與其受體結合后可特異性地誘導多種腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞幾乎無毒性，現已受到人們的廣泛關注［2-5］。TRAIL與靶細胞表面的死亡受體DR4/DR5特異結合形成DR4/DR5-FADD-procaspase-8死亡誘導信號復合物（DISC），促使procaspase-8自我裂解形成有活性的凋亡起始蛋白caspase-8，進而活化效應蛋白，最終導致細胞凋亡［6-7］。本研究檢測TRAIL對COC1/DDP細胞TRAIL死亡受體（DR4、DR5）、凋亡相關基因Smac、Survivin表達的影響，旨在探討TRAIL聯合順鉑可能逆轉COC1/DDP細胞耐藥性的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1細胞株COC1/DDP 細胞由福建醫科大學腫瘤實驗室提供。

1.1.2主要試劑 重組TRAIL蛋白為Pepro Tech公司產品；四甲基偶氮唑藍（MTT）系美國Sigma公司產品。DD為山東齊魯制藥廠產品。酶聯分析儀為美國VICTOR1420型多標記計數儀；逆轉錄試劑盒、Taq酶、DNAmarker總RNA提取試劑（Trizol）購自Invitrogin公司。引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養 COC1/DDP細胞采用含10%胎牛血清、1%雙抗（青鏈霉素混合液）的RMPI-1640培養液，置于37 ℃、5%CO2及20%O2的培養箱中進行培養。

1.2.2TRAIL蛋白和順鉑對細胞生長抑制檢測（1）檢測不同濃度TRAIL對COC1/DDP細胞生長的影響：分別取對數生長期的COC1/DDP細胞以每孔1×104個/mL接種于96孔板24 h貼壁后，更新培養液并加入TRAIL蛋白液使終濃度為5、10、20、 50、100、150 μg/L，每個濃度5個復孔，另設對照組（同體積的PBS）、空白組（加培養液，不含細胞及藥物）；加藥后分別繼續在培養箱中作用12、24、36、48、60 h后取板備測。采用MTT法測定細胞的吸光度A490值，計算細胞生長抑制率。（2）求得IC50及最佳作用時間。（3）檢測DDP與接近IC50的三個濃度TRAIL蛋白聯合作用對COC1/DDP細胞生長的影響：分別取對數生長期COC1/DDP細胞接種于96孔培養板中，培養24 h后加入含有2 μg/mL DDP和接近IC50的三個濃度TRAIL蛋白的培養液， 每一處理組設5個復孔，另設對照組、空白調零組，培養24 h后取板備測。測定每孔細胞的A490值，計算細胞生長抑制率。

1.2.3采用Annexin V-FITC方法檢測COC1/DDP細胞凋亡 COC1/DDP細胞接種于6孔板培養24 h貼壁后加DDP及TRAIL蛋白，分對照組（PBS代替TRAIL蛋白、DDP）、DDP 2 μg/mL組、DDP 2 μg/mL +TRAIL40 μg/L組、DDP 2 μg/mL+TRAIL60 μg/L組、DDP 2 μg/mL+TRAIL80 μg/L組，各組均設5個復孔，藥物作用24h后按試劑盒流程加入Annexin V-FITC及碘化丙錠溶液（PI），流式細胞儀上分析。判斷標準：橫坐標是PI，縱坐標是Annixin V-FITC，左上、右上、左下、右下四個象限中右上象限代表死亡的細胞，左下象限是存活的細胞，左上象限即FITC（+）/PI（-）是凋亡的細胞。

1.2.4RT-PCR方法檢測COC1/DDP細胞DR4、DR5、Smac及Survivin表達 對數生長的COC1/DDP細胞分對照組（PBS代替）、DDP 0.5μg/mL組、DDP 1μg/mL組及DDP 2μg/mL組，分別培養24 h后，按試劑盒流程提取總mRNA、cDNA合成及PCR反應。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。引物序列：DR4（上游：5’-ACG AAC GCT CTG GGA CCT GTA AC-3’、下游：5’-ATG TCC TAT GCC TAG TTC TTG TTG-3’）、DR5（上游：5’-TGA GCG GGA AGA GGA CAT GA-3’、下游：5’-GGC TAT TGC CAT TGT GAT TTG A-3’）、Smac（上游：5’-ACC GCC CAC TAC TCT TCC TC-3’下游：5’-GCG ATG CAT TAG GAG CCG TG-3’）及Survivin（上游：5’-ATG CTG ATC GGA AGA CGC AA-3’下游：5’-GCG GAT CTG TTT TCT CTG AT-3’），條帶的大小分別為DR4 480 bp、DR5 445 bp、Smac 360 bp及Survivin 390 bp。

1.3統計學處理 采用SPSS 10.0統計軟件包，各組資料的比較行方差齊性檢驗，方差齊者用多組計量資料的方差分析進行比較，兩組資料比較用成組設計的t檢驗進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1不同濃度TRAIL蛋白對COC1/DDP細胞生長的影響 由圖1可見，TRAIL蛋白對COC1/DDP細胞的殺傷抑制作用隨藥物濃度的增加而增強；在同一藥物濃度干預下，殺傷抑制作用隨干預時間的延長而漸增；呈劑量－時間雙效應關系。

圖1　不同濃度TRAIL蛋白作用后對COC1/DDP細胞增殖抑制作用

2.2DDP與不同濃度的TRAIL蛋白聯合作用對COC1/DDP細胞生長的影響 選用接近IC50的三個濃度作為實驗濃度：40、60、80 μg/L，以24 h為干預時間。單獨DDP（2 μg/mL）作用COC1/DDP細胞24 h，抑制率為3.58%，見表1。提示COC1/DDP細胞對順鉑呈耐藥狀態，聯合用藥的抑制率明顯高于同一濃度單純TRAIL和DDP抑制率之和，提示TRAIL蛋白與DDP聯合用藥對COC1/DDP細胞可能有協同抑制增殖作用。

表1　DDP（2 μg/mL）和不同濃度TRAIL蛋白作用對COC1/DDP細胞生長影響 %

2.3流式細胞儀Annexin V-FITC法檢測細胞凋亡結果 如圖2～6所示，隨著與DDP聯合的TRAIL濃度增加，COC1/DDP細胞凋亡率也逐漸上升，聯合用藥干預后凋亡率分別為（7.5±1.2）、（16.5±1.6）及（25.6±2.1）%，與單純TRAIL蛋白作用比較，凋亡率均明顯增加，且各組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖2　對照組

圖3 DDP2μg/mL組

圖4　DDP2μg/mL+TRAIL40μg/L組

圖5　DDP2μg/mL+TRAIL60 μg/L組

圖6　DDP2μg/mL+TRAIL80 μg/L組

2.4RT-PCR檢測COC1/DDP細胞DR4、DR5、Smac及Survivin表達 以DR4、DR5、Smac及Survivin基因擴增產物電泳帶的吸光度，反映各自表達水平。如圖7所示，從右向左條帶分別代表對照組、DDP 0.5 μg/mL組、DDP 1 μg/mL組及DDP 2 μg/mL組。COC1/DDP細胞DR4水平對照組和DDP組表達均較低，且不同濃度DDP組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。DR5表達水平較對照組明顯升高，DDP 2 μg/mL組為對照組的3.45倍（P＜0.001）。Survivin表達均較對照組減少（P＜0.001），且不同濃度DDP組間比較無明顯差異（P＞0.05）。Smac表達漸次增加，DDP 2 μg/mL組為對照組的2.82倍（P＜0.001）。

圖7　RT-PCR檢測COC1/DDP細胞DR4、DR5、Smac及Survivin表達

3 討論

腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體TRAIL是TNF超家族的新成員。TRAIL通過與死亡受體（death receptor，DR）的功能受體DR4、DR5結合，能特異性殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞無明顯毒性，與FasL和TNF-α對多種組織細胞有毒性相比，TRAIL在腫瘤治療方面具有更好的應用前景［4-7］。目前普遍接受的TRAIL凋亡誘導途徑有兩條，即線粒體依賴型途徑和線粒體非依賴型途徑。I型為線粒體非依賴型途徑，即活化的caspase-8直接激活下游效應蛋白caspase-3、caspase-6、caspase-7而誘導凋亡。Ⅱ型為線粒體依賴型途徑，活化的caspase-8促使Bid催化斷裂形成有活性的截短Bid（tBid）并定位于線粒體膜，引起線粒體跨膜電位降低或破壞，促使線粒體釋放細胞色素c、促凋亡蛋白Smac和dATP結合形成凋亡酶體（apoptosome），進而活化效應蛋白，最終導致細胞凋亡［8-14］。

本實驗通過MTT法證實TRAIL蛋白可抑制COC1/DDP細胞生長，與DDP聯合用藥的抑制率高于同一濃度單純TRAIL和DDP抑制率之和，提示兩者聯合對COC1/DDP細胞可能有協同抑制增殖作用。流式細胞儀Annexin V-FITC法檢測細胞凋亡結果說明這種抑制作用部分源于兩者的促凋亡作用。RT-PCR檢測結果表明經過DDP處理后COC1/DDP細胞DR5表達增加，且可能通過線粒體途徑中促凋亡蛋白Smac表達增加導致細胞凋亡。

COC1/DDP是將人卵巢漿液性腺癌細胞通過DDP濃度間歇誘導，最終獲得能完全耐受1.0 μg/mL DDP的細胞亞株。由于TRAIL誘導細胞凋亡途徑不同于DDP的作用機制，TRAIL是通過與細胞表面受體DR4和DR5結合引起腫瘤細胞凋亡，這與DDP、TXAL等常規化療藥物作用機制完全不同［15-19］。Arts等［20］通過檢測發現化療后殘瘤腫瘤組織中DR4、DR5的表達較化療前更強，認為這種變化可能是因化療引起。本研究結果表明在2 μg/mL的DDP作用下COC1/DDP細胞抑制率僅為3.58%，提示對DDP耐藥，聯合用藥的抑制率明顯增加，高于同一濃度單純TRAIL和DDP抑制率之和。DDP處理后DR5水平增加，會明顯增強TRAIL促凋亡的作用，可以用來解釋TRAIL可能逆轉COC1/DDP細胞對DDP的耐藥性。Survivin通過抑制caspase-3的表達而阻止細胞過度凋亡，本研究中DDP處理后Survivin表達減少，是否可能導致caspase-3的表達增加進而促進細胞，尚需進一步實驗予以證實。Smac是存在于線粒體中并調節細胞凋亡的蛋白質，本研究中DDP處理后，Smac表達增加，推測DDP處理后COC1/DDP細胞DR5表達增加，可能通過線粒體途徑導致細胞凋亡。

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Effects of TRAILand Cisplatin on the Trail-induced Apoptosis in Ovarian Carcinoma Cell Line COC1/DDP

ZHUANG Liang-wu，LIN Lan，CHEN J ie，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（29）：017-021

Objective：To investigate the effect of TRAILcombined with Cisplatin on the growth of ovarian cancer resistant COC1/DDP cells，and the effect of drug combination on the expression of TRAILdeath receptors（DR4，DR5） and the apoptosis related genes Smac and Survivin.Method：The effects of different concentrations of TRAILprotein combined with DDP on the growth inhibition of COC1/DDP cells were detected by the MTT assay.Apoptosis of COC1/DDP cells was detected by V-FITC Annexin method.The expression of TRAILdeath receptors（DR4，DR5） and the apoptosis related genes Smac，Survivin after treated with DDP were studied by RT-PCR technique.Result：TRAILprotein inhibited the growth of COC1/DDP cells，and the inhibition rate of DDP and TRAILprotein was significantly increased（P＜0.05）.The COC1/DDP cell expression level of DR5 significantly enhanced as the control group of 3.45 times（P＜0.001）.The expression of Smac for the control group of 2.82 times（P＜0.001）.DR4 level without obvious change.Survivin expression compared with the control group decreased significantly（P＜0.001）.Conclusion：TRAILprotein inhibited the growth of COC1/DDP cells，and the combination of DDP and TRAILenhanced the inhibition of COC1/DDP cells.TRAILreversing the drug resistance of COC1/DDP cells to DDP may cause by the increase of TRAILreceptor DR5 and Smac expression，and promote the apoptosis of tumor cells through the mitochondrial pathway.

Ovarian cancer； Drug resistance； TRAIL； Apoptotic mechanism

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.29.005

福建省自然科學基金面上項目（2013J01324）

①福建中醫藥大學附屬人民醫院 福建 福州 350004

莊良武

（2016-06-26） （本文編輯：程旭然）